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制作哇巴因诱发豚鼠心律失常模型的体会
哇巴因诱发豚鼠心律失常为经典模型.笔者结合实验中发现的一些问题,就该模型的复制及实验操作提出一些个人的看法.
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果糖二磷酸钾盐对哇巴因诱导豚鼠心律失常的治疗作用研究
目的:研究果糖二磷酸钾盐对哇巴因诱导豚鼠心律失常的治疗作用.方法:60只豚鼠随机分为模型对照组、果糖二磷酸钾盐小剂量组、大剂量组、1,6-二磷酸果糖组、氯化钾组、门冬氨酸钾镁组.各组豚鼠四肢皮下插入针状电极,记录Ⅱ导联心电图和动态心电图,分离颈外静脉,缓慢推入相应药物,给药容量为1ml/100g.
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乳大鼠心室肌培养细胞代替急性酶分离细胞用于起搏电流电生理研究的可行性探索
目的 探讨体外培养细胞代替急性酶分离细胞用于心室肌电生理研究的可行性.方法 采用膜片钳全细胞记录技术,对比分析心室肌细胞培养的不同时间与急性酶分离的心室肌细胞起搏电流间的电生理学差异.结果 短期的培养就会使细胞膜电容下降,各期培养细胞的膜电容小于急性酶分离细胞的膜电容[(56±7) pF,P＜0.05].4d后膜电容随着培养时间的延长有逐渐增大的趋势,但各期之间的膜电容差异无统计学意义(P＞0.05).各个培养时间段细胞的反转电位、电流密度、活化阈值、半大激活膜电压(V0.5)等主要电生理指标之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 至少短期培养的乳大鼠心室肌细胞的起搏电流与急性酶分离细胞的起搏电流的主要电生理指标之间无明显差异,可以代替急性分离细胞应用于起搏电流的电生理研究.
关键词： 哇巴因 起搏电流 膜片钳全细胞记录技术 心室肌细胞 -
哇巴因对大鼠心室肌起搏通道基因表达的影响
目的:观察慢性洋地黄中毒对大鼠心室肌起搏通道基因表达的影响.方法:给予大鼠腹腔内注射哇巴因0.045 mg/(kg·d)连续两周.取大鼠心室肌组织,应用半定量实时荧光定量反转录聚合酶链式反应测定起搏通道的基因表达水平.结果:HCN2基因在哇巴因组的表达量较对照组明显升高了近1.5倍(P＜0.05),其中以左心室表达量的增加更为明显.而哇巴因组与对照组之间的HCN4基因表达量之间没有统计学差异(P＞0.05).结论:哇巴因慢性中毒时可以导致心室肌的HCN2基因表达明显上调,以左心室为著.而HCN4基因未受影响.HCN2基因可能和洋地黄中毒时出现的自律性增加的心律失常有关.
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慢性洋地黄中毒大鼠模型的建立
目的:建立一种慢性洋地黄中毒的动物模型.方法:大鼠腹腔内注射中毒剂量的哇巴因 0.045mg/Kg·d连续两周,观察动物体重、心电图、心脏湿重、尾动脉血压. 结果:哇巴因组和对照组在体重、心脏湿重、尾动脉血压等方面均无统计学差异.哇巴因组大鼠心室肌组织结构紊乱、炎性细胞浸润,心电图出现了PR间期延长、室性早搏、室扑等心律失常.结论:连续两周中毒剂量的哇巴因可以成功的构建慢性洋地黄中毒模型.
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哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞增殖及HIF-1α表达的影响
目的 探索哇巴因(Ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞增殖和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响.方法 Ouabain(0.05、0.5、2.5、25 μmol/L)作用于U87-MG细胞24 h,MTT法检测吸光度值和细胞活力,Western Blot检测HIF-1α表达量.结果 不同浓度Ouabain干预24 h后U87-MG细胞吸光度值(OD 490)与Control组相比,均明显降低(P均<0.01),细胞活力显著下降(P<0.01);与Control组比较,0.05 μmol/L Ouabain组HIF-1α蛋白表达量上升(1.27±0.05vs.1.00±0.05,P<0.05),当Ouabain浓度升高至2.5、25 μmol/L,HIF-1α表达显著降低(0.28±0.04,0.20±0.03 vs.1.00±0.05,P均<0.01).结论 较高浓度Ouabain可通过抑制HIF-1α表达,促进人胶质瘤U87-MG细胞凋亡.
关键词： 哇巴因 人胶质瘤U87-MG细胞 缺氧诱导因子-1α 凋亡 -
阿魏酸钠抗心律失常机制的初步探讨
目的探讨阿魏酸钠是否具有抗心律失常作用及其可能的抗心律失常机制.方法应用哇巴因及乌头碱建立心律失常的动物模型,并观察阿魏酸钠对心律失常的影响.结果阿魏酸钠0.6g/kg静脉推注可对抗哇巴因诱发的室性心律失常,使室性早搏、室性心动过速、室颤的发生时间延长,并可提高哇巴因致室性早搏、室性心动过速、室颤的剂量,两组之间差异有显著意义(P＜0.01),但阿魏酸钠不能对抗乌头碱诱发的心律失常.结论阿魏酸钠具有对抗哇巴因诱发的心律失常作用,机制可能与其对钾离子通道的阻滞作用有关.
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从噬菌体7肽库中筛选的哇巴因结合肽对血管内皮细胞的保护作用
目的:寻找与哇巴因高亲和力结合并抑制其生物功能的相关小分子肽,为治疗原发性高血压提供新策略.方法:以哇巴因为筛选分子,应用M13噬菌体呈现随机7肽库进行筛选.经过3轮生物淘筛,并通过ELISA法鉴定,对噬菌体阳性克隆ssDNA电泳鉴定和基因测序分析.委托合成筛选获得哇巴因结合肽,采用放射配基受体结合法检测其结合活性;MTT法检测血管内皮细胞的增殖抑制率,Hoechst33342/PI双荧光染色检测细胞形态学变化;利用RT-PCR和细胞免疫荧光检测钠泵α1、β1的表达水平;荧光探针检测细胞内游离Na+浓度变化.结果:筛选获得14个阳性克隆,基因测序显示:哇巴因结合肽一致率达64.3%(9/14).委托合成肽(Arg-Cys-Met-Thr-Ser-Arg-Ser).放射性配基受体结合法检测显示,合成的哇巴因结合肽能够与哇巴因结合.哇巴因结合肽+哇巴因的EAhy926细胞组增殖抑制率小于哇巴因组(P<0.05);Hoechst33342/PI双荧光染色显示细胞死亡数量减少;RT-PCR和免疫细胞化学检测钠泵α1、β1亚单位转录和翻译水平,显示哇巴因结合肽能拈抗哇巴因所引起钠泵α1亚单位表达的上调、β1亚单位的下调作用;荧光探针显示哇巴因结合肽能够拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用.结论:哇巴因特异性结合肽能够阻抑哇巴因对血管内皮细胞的抑制增殖和诱导死亡作用,为研究哇巴因与钠泵的相互作用机制及进一步研究抗哇巴因的分子药物奠定基础.
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哇巴因抗体Iodogen法标记125I及其应用
自从1775年，英国人 Villian Withering 应用毛地黄(foxglove)的提取物治疗充血性心衰以来，心脏糖苷(包括：地高辛、哇巴因和其它毛地黄样化物质)已被用作治疗心力衰竭和某些心律失常。1991年，Hamlyn等[1]发现，从血浆中纯化的内源性类洋地黄物质(EDLS)与哇巴因无区别，并通过监测非胃肠途径给予营养1 wk的人、牛和鼠3种动物证实，动物血液中ouabain是内源性的，是新发现的一种类固醇激素。EDLS不仅存在于正常血液中，在许多疾病中也有病理变化，尤其在高血压的发生。
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不同浓度哇巴因对A549细胞增殖及死亡的影响
目的:评价特异性钠泵抑制剂哇巴因在体外对非小细胞肺癌A549细胞增殖与死亡的影响.方法:利用细胞培养技术,采用MTT法、流式细胞技术、TUNEL法及电镜技术分别评价不同浓度哇巴因对A549增殖与死亡的影响.结果:当哇巴因浓度＜1.8nmol/L时,可通过干扰细胞周期,显示出促进肿瘤细胞增殖作用.哇巴因浓度≥1.8nmol/L时,肿瘤细胞增殖受抑.哇巴因对A549细胞增殖的抑制作用呈明显的剂量依赖性和时间依赖性.高浓度哇巴因(≥100nmol/L)所致的A549细胞死亡以非凋亡性死亡为主.结论:哇巴因在适当浓度具有抗肺肿瘤活性,可能成为潜在的抗肺肿瘤药物.
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哇巴因与地高辛对大鼠肝脏钠泵α亚单位基因表达的影响
目的观察哇巴因与地高辛对大鼠肝脏钠泵基因表达的影响. 方法分别给大鼠注射哇巴因(20 μg*kg-1*d-1)、地高辛(32 μg*kg-1*d-1) 和生理盐水(1 mL*kg-1*d-1), 观察给药后 6 wk大鼠血压的动态变化;并分别应用分子生物学RT-PCR及免疫组织化学技术,探讨各组大鼠肝脏钠泵α1, α2及α3亚单位mRNA 及蛋白水平基因表达的改变. 结果给予哇巴因2 wk后大鼠血压开始升高, 至6 wk时明显高于生理盐水组(17.7±1.2) vs (15.4±1.1) kPa, P<0.01), 而实验过程中地高辛组血压与对照组比较差异不明显. 无论是在mRNA水平还是在蛋白水平, 哇巴因对大鼠肝脏钠泵α1亚单位表达无影响,而地高辛使α1亚单位表达增强;两组大鼠α2亚单位表达均无改变;哇巴因使α3亚单位蛋白水平表达减弱,而mRNA水平增强,地高辛组大鼠肝脏钠泵α3亚单位无论在mRNA水平及蛋白水平表达均增强. 结论哇巴因在高血压发病中可能起着重要作用;哇巴因与地高辛可导致不同的钠泵基因表达改变,为进一步揭示内源性哇巴因生理与病理作用以及洋地黄类药物药理与毒理作用的分子机制提供了理论及实验依据.
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哇巴因、地高辛与高血压发病关系的研究
目的观察哇巴因、地高辛对组织钠泵α亚单位基因表达的不同影响,探讨哇巴因与高血压发病的可能关系.方法给予大鼠哇巴因30 μg*kg-1*d-1,地高辛40 μg*kg-1*d-1腹腔注射7周.用免疫组化及原位杂交方法检测心脏、肾脏、肝脏、腹主动脉和肾上腺组织钠泵α亚单位蛋白水平及mRNA水平的表达.结果哇巴因与地高辛对上述组织尤其是动脉及肾脏的钠泵α亚单位表达的影响不同,哇巴因增强动脉的α2表达,地高辛则抑制其表达;哇巴因使肾脏α1表达增强,地高辛则使其减弱.结论哇巴因导致组织钠泵α亚单位基因异常表达,这可能在高血压的发病中有重要意义.
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哇巴因与地高辛对大鼠肾脏皮质钠泵α亚单位基因表达的影响
目的对比研究哇巴因与地高辛对大鼠肾脏皮质钠泵(Na+,K+-ATP酶)α亚单位基因表达的影响,探讨内源性哇巴因(EO)的生物学效应以及洋地黄类药物药理作用的分子机制.方法长期给予大鼠注射小剂量哇巴因(20ug@kg-1@d-1)与地高辛(32μg@kg-1@d-1),动态观察大鼠血压变化;分别应用分子生物学RT-PCR及免疫组织化学技术,研究各组大鼠肾脏皮质钠泵α1、a2及a3亚单位mRNA及蛋白水平基因表达的改变.结果哇巴因与地高辛对大鼠血压的影响存在着明显差别,长期给予大鼠注射小剂量哇巴因可使大鼠血压升高,而地高辛对大鼠血压无影响.但哇巴因与地高辛对大鼠肾脏皮质钠泵α亚单位基因表达的影响是相同的,在mRNA水平均可使α1亚单位表达增强,a2与a2亚单位表达无改变;而在蛋白水平α1亚单位表达减弱,a3亚单位表达增强,a2亚单位表达无改变.结论哇巴因在高血压发病中可能起着重要作用;哇巴因与地高辛可导致相同的肾脏皮质钠泵基因表达改变,提示这种表达的改变在哇巴因导致血压升高的过程中可能并不起着关键性作用.
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哇巴因对大鼠肾皮质Na+-K+-ATP酶活性及多巴胺D1受体mRNA表达的影响
目的 观察哇巴因对大鼠肾皮质Na+-K+-ATP酶活性及多巴胺D1受体mRNA表达的影响.方法 28只SD大鼠随机分为2组,即哇巴因组[27.8μg/(kg·d)哇巴因腹腔注射]和对照组(生理盐水1mL/d腹腔注射),每周测量鼠尾动脉血压,共5周.于第3、5周后分2批处死动物,应用分光光度法测定各组大鼠肾皮质Na+-K+-ATP酶活性,同时采用实时定量PCR(real-time PCR)观察肾皮质中多巴胺D1受体mRNA表达的变化.结果 大鼠腹腔注射哇巴因3周后,两组血压无显著性差异,但哇巴因组大鼠肾皮质Na+-K+-ATP酶活性高于对照组(P<0.01),多巴胺D1受体mRNA表达低于对照组(P<0.01).5周后,哇巴因组大鼠血压与对照组相比有显著性差异(P<0.01),哇巴因组大鼠肾皮质Na+-K+-ATP酶活性进一步增高(P<0.01),多巴胺D1受体mRNA表达进一步减低(P<0.01).结论 长期小剂量外周注射哇巴因可使SD大鼠血压持续升高,这一作用与肾近曲小管Na+-K+-ATP酶活性增加引起水钠潴留有关,多巴胺D1受体可能参与了这一过程.
关键词： Na+-K+-ATP酶活性 多巴胺D1受体 哇巴因 高血压 钠转运 -
哇巴因对大鼠心脏内皮素系统表达的影响
目的探索哇巴因对大鼠心脏内皮素系统表达的影响.方法雄性SD大鼠随机分为哇巴因组和生理盐水对照组,每周测量收缩压,分别于实验2、4、6周放免法测定两组大鼠血浆及心脏组织中内皮素的含量,并用免疫组化法检测大鼠左心室内皮素A、B两种受体的表达.结果大鼠腹腔注射哇巴因4周后收缩压开始上升,6周后哇巴因组大鼠血压与对照组相比有显著性差异.大鼠腹腔注射哇巴因2周后,血浆及心脏组织内皮素水平升高,4周时左心室内皮素A型受体表达增强,而B型受体的表达在整个实验过程中均无显著变化.结论哇巴因可以引起血浆及心脏组织中内皮素质量浓度增加,左心室内皮素A型受体表达增强,这种效应可能是其升高血压及损害靶器官的机制之一.
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Gαq/11在哇巴因信号转导中的意义
目的观察不同浓度哇巴因对SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞Gαq/11表达的影响,并探讨其在哇巴因信号转导中的作用.方法采用贴块法原代培养SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,进行传代和纯化.分别给予生理浓度以及病理浓度的哇巴因干预48 h,免疫细胞化学染色观察平滑肌细胞Gαq/11蛋白的表达.结果生理浓度哇巴因干预后,平滑肌细胞有增殖现象;而病理浓度组细胞发生凋亡.生理浓度组Gαq/11表达(111.21±30.47)显著高于病理浓度组(68.70±6.21)以及对照组(58.81±4.51,P＜0.01);病理浓度组和对照组相比无显著变化.结论①Gαq/11介导了生理浓度哇巴因引起细胞增殖的生物学效应;②病理浓度哇巴因引起细胞凋亡的生物学效应与Gαq/11无关;③哇巴因在不同浓度下,可能通过不同的信号转导通路产生相应的药理学作用或生物学效应.
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哇巴因对血管紧张素Ⅱ及其1型和2型受体mRNA在心肌中表达的影响
目的观察哇巴因(Ouabain)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其1型(AT1)与2型(AT2)受体mRNA在心肌中表达的影响.方法60只SD大鼠随机分为3组,分别为Ouabain组[27.8 ng/(kg·d)Ouabain腹腔注射]、Losartan组[27.8 ng/(kg·d)Ouabain腹腔注射,同时给予Losartan 30 ng/(kg·d)灌胃]、对照组(生理盐水2 mL/d腹腔注射),每周测定鼠尾血压,共6周.应用放免法测定各组大鼠血浆及心肌中AngⅡ质量浓度,同时采用实时定量荧光PCR(FQ-PCR)观察心肌中AT1和AT2mRNA表达的变化.结果血浆中的AngⅡ质量浓度在Ouabain组及Losartan组均显著高于对照组(P＜0.05),而Ouabain组心肌中AngⅡ质量浓度无明显变化.与对照组相比,Ouaba1n组及Losartan组心肌中AT1 mRNA与AT2mRNA的表达明显上调(P＜0.05).结论外周长期、慢性给予Ouabain后可持续升高SD大鼠的血压,并使RAS系统激活,这一作用可能是通过AT1受体介导.给予Ouabain激活AT1受体的同时,AT2活性也增加.
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哇巴因与盐负荷对大鼠心血管超微结构的影响
目的研究哇巴因及盐负荷对大鼠心血管超微结构的影响.方法哇巴因腹腔注射(20μg/(kg·d))构建动物模型,同时给予1%高盐饮水及正常无盐饮水,并建立阴性对照,喂养8周后电镜观察心脏及升主动脉超微结构变化.结果单独注射哇巴因组(12只)及单独高盐饮食组(10只)均有部分大鼠(分别为10/12和7/10)血压升高,此组大鼠分别为"哇巴因敏感鼠"和"盐敏感鼠",哇巴因注射加高盐饮水喂养组(10只)大鼠血压都升高.血压升高的大鼠其心脏及升主动脉超微结构明显变化,尤以联合干预者为著.结论哇巴因及盐负荷均可以引起高血压发展过程中的心血管重塑,两者具有协同作用.
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抗哇巴因多克隆抗体的制备及免疫周期和剂量的研究
制备抗哇巴因多克隆抗体,探讨佳的免疫周期及免疫剂量.应用哇巴因(ouabain)-牛血清白蛋白(BSA)结合物为抗原免疫家兔,每周从兔耳缘静脉采血,监测哇巴因特异抗体的产生;以0.25mg/次、1mg/次、1.75mg/次、2mg/次四种不同免疫剂量进行佳免疫剂量的研究.5个月后颈动脉取血,进行抗体效价、亲和力及特异性的检测.结果显示免疫间隔为6周、免疫剂量为1.75mg/次时可以获得高效价、高亲和力和高特异性的哇巴因抗血清.
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嗜铬细胞瘤组织中内源性哇巴因表达的意义
目的探讨内源性哇巴因(EO)在肾上腺嗜铬细胞瘤组织中表达的意义.方法采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(SP法)检测EO在嗜铬细胞瘤组织中的表达.结果血压与EO在嗜铬细胞瘤组织中的表达呈现相关关系.伴有血压升高的嗜铬细胞瘤患者,其瘤组织中EO呈弥漫性强阳性表达;而EO在不伴有血压升高的嗜铬细胞瘤患者则呈现阴性表达.结论EO与嗜铬细胞瘤所致的高血压关系密切,为其进一步研究提供了有价值的形态学依据.
