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Prx1基因敲除小鼠模型的构建
目的 建立Prx1(Peroxiredoxin 1)基因敲除小鼠模型.方法 体外培养Prx1基因捕获小鼠ES(胚胎干)细胞,利用显微注射方法将ES细胞注射入C57BL/6小鼠囊胚腔,通过胚胎移植将注射后的囊胚引入受体小鼠子宫,将高嵌合率小鼠与C57BL/6小鼠杂交,利用毛色遗传和PCR技术对子代鼠进行鉴定.结果 通过对F1代小鼠的毛色遗传和PCR基因型鉴定,Prx1基因捕获ES细胞能够整合到小鼠生殖系,并稳定遗传.结论 成功获得Prx1基因敲除小鼠.
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基因打靶技术研究及其应用
基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段,具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点[1],其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等,相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获等.
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基因捕获技术
基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段,对于揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值.本文综述了基因捕获技术的基本原理和研究方法、发展现状及远景.
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一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用
目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用.方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针.并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交.分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析.结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90％以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100％,且均一性良好.检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409).结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库.
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基因捕获测序诊断血癌
澳大利亚新南威尔士大学和加文医学研究所的科研人员开发了一种新的基因测序技术，被称为“捕获测序”，其精度大大高于现有方法，它尤如一台倍数更高的显微镜，可用于对基因组进行精细研究，并帮助快速诊断血癌（即白血病）。
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革兰阴性菌中整合子携带超广谱β-内酰胺酶的研究进展
整合子是一种主要存在于革兰阴性菌中的基因捕获和表达的遗传单位,能够选择性捕获或去除各种特异性耐药基因盒,从而加速了细菌耐药性的扩散.近年来,整合子介导的细菌耐药机制引起了研究人员的极大关注,成为研究细菌耐药传播机制的一大热点.目前已明确的位于整合子上的抗性基因已超过70多种[1],其中包括相继发现的一些超广谱β-内酰胺酶(ESBL)被整合在整合子上,这无疑加速了ESBL的传播速度.本文就整合子的分类、结构,革兰阴性菌中整合子携带ESBL的流行病学特征、检测和协同耐药基因的表达等作一综述.
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基因捕获联合高通量测序技术在甲基丙二酸血症诊断中的应用
目的 探讨新一代基因测序平台(HiSeq2000)在甲基丙二酸血症(MMA)诊断中的价值.方法 1.采集已经临床确诊的9例MMA患儿外周血并提取DNA,将设计好的基因捕获探针与患儿DNA文库混合,然后利用基因捕获联合高通量测序分析技术对有机酸代谢相关的48个基因全部外显子区域进行测序.2.获得原始数据,去除接头和过滤低质量数据,对数据进行SNP、InDel等分析,并采用Sanger测序方法对异常位点进行测序验证.3.气相色谱-质谱联用分析技术对尿液标本的有机酸测定及其他辅助检查.结果 1.突变基因:7例存在MMACHC基因突变,7例患儿中共检测出7种突变,包括c.482G＞A、c.567_568insT、c.609G＞A、c.440_ 441del、c.80A＞G、c.315C＞G、c.90G＞A,其中c.440_441 del为未见报道突变;1例存在甲基丙二酰辅酶A变位酶(MUT)基因突变,均为内含子异常,分别是c.754-1G＞C、c.1677-1G＞A,其中c.754-1G＞C为未见报道突变;1例未检测到突变.2.临床症状:9例患儿均存在智力运动发育迟缓,伴抽搐3例,反复顽固性代谢性酸中毒、头痛及面瘫、反复性溶血各1例.脑电图异常9例,头颅磁共振异常8例,尿液中甲基丙二酸水平均升高(273.4 ～146 022.8倍),血同型半胱氨酸水平增高8例(27.13～ 396.84 μmol/L,正常＜20 μmol/L).3.Sanger测序验证:均符合新一代测序平台结果,无假阳性存在.结论 1.进一步证明c.609G＞A突变位点为中国MMA合并同型半胱氨酸血症患儿的热点突变位点.MMA基因突变类型较多,与临床症状无明显相关性.2.推测MMACHC基因c.440_441 del突变及MUT基因c.754-1G＞C突变为新发突变.3.基因捕获联合高通量基因测序技术一次性捕获突变基因数量大,获取疾病的遗传信息量广,具有高通量、高灵敏度、高效等特点,适合于MMA患儿检测,也可为其他儿科临床常见遗传性疾病的检测提供参考.
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基因敲除技术现状及应用
功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要.基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展.其中Cre-LoxP系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究.此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术.
关键词： 基因敲除 Cre-loxp系统 转座子 基因捕获 -
目标区域捕获联合新一代测序技术在遗传性聋研究中的应用及发展前景
耳聋是常见的遗传异质性疾病之一，大多数遗传性聋是单基因病。自1988年第一个耳聋基因被定位，1995年第一个非综合征型耳聋基因POU3F4被克隆以来，耳聋基因的定位及克隆研究取得了巨大进展，目前已经鉴定了76个非综合征型耳聋相关基因，另外100多个已定位的耳聋基因座尚待相关基因的鉴定（截至2013年10月）［1］。在单基因病的致病基因定位和克隆研究中，通常采用的家系连锁分析和定位克隆技术是有效、准确的方法之一，但是，如果家系中患病人数有限或不外显，或外显不全，或是散发性病例，则连锁分析多半失效。此外，以Sanger测序为基础的测序技术因其高成本和长耗时也限制了其应用。新一代测序技术（nex t -generation sequencing technology ，NGS）为探索单基因病提供了新的途径，因其无需收集大家系的样本，且可对全外显子组或全基因组的无偏倚测序，使得NGS在发现罕见遗传病的病因方面具有独特优势，尤其是对遗传性聋患者的全外显子组或耳聋相关基因组（分别占全基因组的1％和0．01％）［2］进行目标区域测序分析，捕获的是疾病的大部分致病突变信息，具有所需样本量少、费用低、通量高的优势，能够检测更多的样本，促进了遗传性聋新的致病变异的发现。本文聚焦于目标区域捕获联合 NGS在遗传性聋基因研究中的应用，尤其是该技术在转化医学和新生儿听力筛查中的应用前景，同时归纳了基因捕获的主要方法和新一代测序技术的发展及其特点。
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基因捕获筛选TGF-β1诱导间充质干细胞C3H/10T1/2平滑肌分化的差异表达基因
目的 利用基因捕获方法,分离转化生长因子-B1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导小鼠胚胎间充质干细胞C3H/10TI/2(简称10T1/2细胞)平滑肌分化前后差异表达基因.方法 5 ng/mL TGF-β1诱导10T1/2细胞平滑肌分化,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,RT-PCR鉴定平滑肌分化相关基因alpha平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,αSMA)、平滑肌22 alpha(smooth muscle 22 alpha,SM22α)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)和血清应答因子(serum response factor,SRF),免疫细胞化学实验检测αSMA.TGF-β1诱导建立的10T1/2细胞基因捕获阳性克隆库分化前后进行LacZ染色.cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)及电子克隆分离差异表达序列,在GenBank网站nBLAST进行生物信息学分析,用GenBank网站在线软件BankIt提交GenBank获取ID号,用pI/Mw软件计算蛋白分子量、等电点.Real-time PCR检测新基因mgt-16在BALB/c小鼠小肠、骨骼肌及心肌的表达.结果 细胞形态学、RT-PCR及免疫细胞化学实验鉴定TGF-β1成功诱导10T1/2细胞平滑肌分化.LacZ染色筛选获得2个平滑肌分化后差异表达克隆.RACE、电子克隆和nBLAST分析后发现为线粒体核糖体蛋白S6(mitochondrial ribosomal protein S6,Mrps6)和新基因mgt-16.mgt-16基因位于19号染色体,编码一个93个氨基酸的蛋白(命名为mgt-16),相对分子质量为9 772.02,等电点为6.04,提交后ID号为GU266552.新基因mgt-16在BALB/c小鼠小肠表达较高,而在骨骼肌、心肌表达较低.结论 利用基因捕获分离获得了TGF-β1诱导平滑肌分化前后2个差异表达基因:Mrps6和新基因mgt-16.
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多用途基因捕获C3H/10T1/2细胞阳性克隆库的构建及鉴定
目的: 以10T1/2细胞为间充质干细胞模型,构建用于间充质干细胞分化及恶性转化分子机制等研究的基因捕获阳性克隆库.方法: Dra I线性化逆转录病毒基因捕获载体ROSAFARY后,与pIRES2-EGFP用脂质体共转染phoenix细胞,LacZ染色证明转染成功后收集病毒上清感染10T1/2细胞.经潮霉素筛选获得阳性克隆,为排除假阳性克隆用LacZ部分片段PCR进行鉴定.结果: ROSAFARY脂质体转染phoenix细胞后48 h,GFP指示的转染效率约为20%～30%,LacZ染色有大约10%的阳性率.150 mg/L潮霉素筛选病毒感染的10T1/2细胞,挑取药物抗性克隆,PCR鉴定后获得43个阳性克隆,LacZ染色5个为捕获基因高表达细胞克隆.结论: 基因捕获技术建立非胚胎干细胞的克隆是可行的,成功建立的基因捕获阳性克隆库为应用基因捕获技术揭示成体干细胞分化及恶性转化分子机制奠定了基础.
关键词： 基因捕获 C3H/10T1/2细胞 聚合酶链反应R β-半乳糖苷酶类 -
肝癌基因组学与肝癌发病机制
肝癌在全球肿瘤相关死亡中排第三位[1].肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌中为常见的一种类型,其次是肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,IHCC).肝炎病毒感染(HBV,HCV等病毒)、脂肪肝、酒精肝、黄曲霉等是肝癌发生的公认致癌因素[2].近些年,随着基因捕获(gene capture)技术的发展和二代测序(next generationsequencing,NGS)技术成本的降低[3],肝癌的基因组学研究有很大的发展,肝癌的癌基因、抑癌基因以及其相关的致癌通路都有了较多的发现,本文对此进行综述.
