首页 > 文献资料
-
血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞体外增殖的影响
目的:评价血小板裂解液(PL)对根尖乳头干细胞(SCAP)增殖的影响,为PL代替胎牛血清(FBS)提供依据.方法:用显微镜观察SCAP的生长特征,用流式细胞仪检测细胞的表面标志物,用茜素红染色检测细胞的成骨分化能力.将SCAP分为四组,分别在培养基中加入PL(2％、5％和l0％)和10％ FBS.培养第1、3、5、7d后用MTT检测各组SCAP的增殖情况.结果:流式细胞分析表明SCAP表达CD73、CD90和CD105呈阳性,CD14、CD34和CD45呈阴性.SCAP骨向分化呈阳性.2％ PL与10％ FBS组之间细胞增殖差异不具有统计学意义(P＜0.05),5％ PL组与10％ FBS组之间细胞增殖差异有统计学意义(P＜0.05).结论:在对SCAP的增殖方面,2％ PL与10％ FBS的作用相近.5％ PL强于10％ FBS.
-
关节腔内重复注射血小板裂解液治疗早期膝骨关节炎疗效观察
目的:探讨关节腔内重复注射血小板裂解液治疗早期膝骨关节炎的临床疗效.方法:选择我院2011年10月～2015年5月106例(141膝)早期膝骨关节炎患者,行关节腔内注射血小板裂解液,每周2次,5次为1个疗程,随访12～18个月(平均16.7个月),对治疗前及治疗后1个月、3个月、6个月、12个月进行的西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)评分和美国膝关节协会(AKS)评分进行比较,评估疗效.结果:治疗后1个月、3个月、6个月、12个月与治疗前相比,WOMAC评分显著降低(P＜0.01),疼痛减轻,僵硬程度减轻,关节功能受限程度降低.AKS评分比较结果显示治疗后患者临床症状明显减轻,关节功能包括活动度和稳定性得到一定程度的恢复.所有患者治疗后均未出现并发症,患者满意度高.结论:关节腔内重复注射血小板裂解液治疗早期膝骨关节炎临床效果肯定,能减轻症状并提高生活质量.
-
血小板裂解液代替动物血清进行间充质干细胞体外扩增的研究进展
监管机构不鼓励使用胎牛血清(FBS)作为细胞培养补充剂,以降低人畜共患病和异种免疫反应的风险.此外,由于动物福利原则,FBS生产受到严格审查.在含有血小板裂解液(PL)培养基中生长的间充质干细胞(MSC)显示出了更快的增殖速度,同时保持了良好的成骨分化能力,PL同时具备MSC附着的关键因素、生物安全性及对MSC扩增后的免疫调节能力,PL被提出作为MSC离体扩增的FBS替代物.我们简要总结了PL体外扩增MSC领域的新研究.
-
血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响
背景:血小板裂解液是将浓缩血小板进一步裂解后所获得的液体成分,含有多种生物活性因子.有研究认为血小板裂解液可促进成骨细胞的增殖,而其对骨髓间充质干细胞生物学功能的影响还不太了解.目的:探讨血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖的影响.设计、时间及地点:独立样本观察,于2007-09/2008-01在山西省医用组织库完成实验.材料:清洁级成年健康Wistar大鼠8只.方法:取2只大鼠股骨,全骨髓培养法传代扩增骨髓间充质干细胞.自6只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备血小板裂解液.取第5代骨髓间充质干细胞,以含10%胎牛血清的L-DMEM/F12作为基础培养基组,在此基础上分别加入血小板裂解液至终浓度为1%和5%作为条件培养基组.主要观察指标:ELISA法测定血小板裂解液中生长因子含量.CASY细胞分析仪计数活细胞.双缩脲法全自动生化分析仪检测细胞总蛋白含量.倒置显微镜动态观察细胞形态变化与生长状况.结果:[1]血小板裂解液中的血小板衍生生长因子、转化生长因子B 1、胰岛素样生长因子1和血管内皮细胞生长因子含量分别为(300±30), (140±25), (80±35), (70±20)ng/L.[2]自培养第3天开始,条件培养基组活细胞数均明显高于基础培养基组(p<0.05),且含5%血小板裂解液的条件培养基组升高幅度尤为显著,于第3天达到对数生长期,比基础培养基组提前约1d,细胞总数在第4,9天时达基础培养基组的近3倍.[3]培养1周后条件培养基组每106个细胞中的总蛋白含量均显著高于基础培养基组(P<0.05).[4]骨髓间充质干细胞在不同浓度血小板裂解液培养条件下,细胞形态基本一致,多为长梭形,类似于成纤维细胞.结论:血小板裂解液是多种生长因子的承载体系,具有丝裂原功效,可在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞的生长增殖,且该效应存在一定程度的剂量依赖性.
-
血小板裂解液在骨组织工程中的应用
背景:以血小板裂解液修复骨缺损不仅去除了残余细胞结构,降低了免疫原性,而且还保留了其中的多种生长因子,可为异体或异种移植创造条件.目的:总结归纳有关对能促进骨生长的血小板裂解液相关研究及应用方式进行综述.方法:以"tissue engineering,bone defect,gene therapy,growth factor"为检索词,检索PubMed数据库(2004-01/2011-01),以"血小板血浆,骨组织工程,血小板裂解液,生长因子"为检索词,检索CBM数据库(2004-01/2011-01).文献检索语种为英文和中文.纳入血小板裂解液促进骨的再生和修复的文献,排除重复文献.结果与结论:计算机初检得到340篇文献,根据纳入排除标准,对其中23篇文献进行分析.目前研究证实,血小板裂解液可促进骨髓基质干细胞和成骨细胞的增殖;与生物陶瓷或自体骨复合,可明显促进骨缺损的修复.合理应用血小板裂解液对骨的再生和修复具有重要意义.
-
血小板裂解液联合国产多孔钽对MG63细胞增殖以及ITGβ1/Vinculin/F-actin信号通路表达的影响
背景:课题组前期研究发现国产多孔钽有利于MG63细胞的早期黏附、增殖,可用作骨组织工程支架材料.血小板裂解液是富血小板血浆进一步优化后的产物,更适合用于诱导修复骨缺损.目的:在前期研究基础上,深入探索血小板裂解液联合国产多孔钽支架材料对MG63细胞增殖以及ITGβ1/Vinculin/F-actin信号通路表达的影响.方法:培养MG63细胞并接种在国产多孔钽支架上,加入3%、5%、7%、10%血小板裂解液,应用CCK-8法筛选出佳的体积分数7%进行以下实验.实验分组:空白对照组MG63细胞培养;血小板裂解液组:7%血小板裂解液与MG63细胞共同培养;多孔钽组:多孔钽支架材料与MG63细胞共同培养;血小板裂解液-多孔钽组:7%血小板裂解液、多孔钽与 MG63细胞共同培养.扫描电镜观察国产多孔钽及血小板裂解液-多孔钽-MG63细胞复合物的表面形态;CCK-8法检测MG63细胞的增殖状态;qPCR、免疫细胞化学染色、Western-blot检测MG63细胞ITGβ1、Vinculin、F-actin的mRNA和蛋白表达.结果与结论:①扫描电镜显示,MG63细胞均良好地黏附在多孔钽支架表面;②与空白对照组比较,血小板裂解液组与多孔钽组均可促进MG63细胞的增殖(P < 0.05);4组中,血小板裂解液-多孔钽组MG63细胞的增殖显著(P < 0.05);③qPCR、免疫细胞化学染色、Western-blot结果显示,4组中血小板裂解液-多孔钽组MG63细胞的ITGβ1、Vinculin、F-actin的mRNA及蛋白表达多(P < 0.05).说明血小板裂解液和国产多孔钽支架材料能协同促进MG63 细胞的增殖,并能上调ITGβ1/Vinculin/F-actin信号通路mRNA及蛋白的表达,该信号通路的激活可能有助于MG63细胞的增殖、黏附及分化.
-
血小板裂解液对人间充质干细胞生物学特性的影响
背景：血小板裂解液是自体或异体血小板富集物经裂解后获得的产物，不仅去除了残余的细胞结构，降低了免疫原性，而且保留了其中的多种生长因子，有研究表明它可替代传统培养基中的胎牛血清，对间充质干细胞进行体外扩增。目的：观察血小板裂解液对人骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞生物学特性的影响，为临床细胞治疗及再生医学提供科学的实验数据。方法：采集新鲜血液，经冻融获取血小板裂解液；采集健康成人骨髓和脂肪组织，分别采用密度梯度离心法和Ⅰ型胶原酶消化法获得骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞；对血小板裂解液培养后的骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的细胞形态、细胞表型、分化能力、增殖能力、集落形成能力和细胞因子分泌水平进行检测。结果与结论：应用血小板裂解液在体外成功地培养扩增了骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞，两种细胞的细胞形态、细胞表型、集落形成能力、细胞因子分泌水平、成软骨、成骨和成脂肪分化能力等生物学特性无明显差异。脂肪间充质干细胞的累积群倍数高于骨髓间充质干细胞(P <0.05)，表明脂肪间充质干细胞具有更强的增殖能力，在体外血小板裂解液培养体系下更适宜进行大规模扩增。
-
人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞
背景：目前国内外大多数实验仍采用经典的培养基和胎牛血清进行脐带间充质干细胞培养，血清培养潜在的不安全因素限制了未来临床应用的可行性。
目的：以人血小板裂解液替代胎牛血清培养、鉴定人间充质干细胞，以期进一步应用于临床低密度扩增人间充质干细胞。
方法：人血小板裂解液通过反复冻融、离心、过滤、浓缩等方法制备。以 IMDM 为基础培养基，添加5%浓缩血小板裂解液作为实验组培养基；以添加体积分数10%胎牛血清为对照组培养基。采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞，以3000/cm2的浓度进行传代培养，待细胞扩增至P5代后，进行细胞形态与直径、免疫表型、成骨成脂分化、克隆形成率等细胞生物学特性检测，并比较两者之间的差别。
结果与结论：人血小板裂解液扩增的脐带间充质干细胞形态细长，有更高的细胞累积群倍数；克隆形成检测结果显示两者形成的克隆效率差异无显著性意义，流式细胞术检测结果显示两者有相似的细胞表型，体外诱导分化显示两者都具有成骨、成脂分化能力，但人血小板裂解液扩增的间充质干细胞成骨分化能力更强。提示人血小板裂解液可以取代胎牛血清用于临床低密度扩增人间充质干细胞。 -
血小板裂解液大规模扩增人脐带间充质干细胞
目的 用血小板裂解液(platelet lysate,PL)大规模扩增人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC),并检测其生物学特性,为临床应用提供实验依据.方法 分别采用PL和胎牛血清(FBS)低密度扩增人UCMSC,比较两组UCMSC的细胞形态、大小、克隆形成率、增殖能力、细胞表型和分化能力.结果 PL扩增的UCMSC形态细长;直径明显小于FBS扩增的UCMSC(P＜0.05);克隆形成率与FBS扩增的UCMSC差异无统计学意义(P＞0.05);有更高的细胞累积群倍数;与FBS扩增的UCMSC有相似的细胞表型;与FBS扩增的UCMSC均具有成骨、成脂诱导分化能力,但PL扩增的UCMSC成骨分化能力更强.结论 PL可取代FBS用于大规模扩增UCMSC.
-
干扰素γ对血小板裂解液扩增的人脐带间充质干细胞免疫调节功能的影响
目的 探讨干扰素(interferonγ,IFNγ)对血小板裂解液扩增的人脐带间充质干细胞(umblical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)免疫调节功能的影响.方法 采用血小板裂解液(platelet lysate,PL)扩增UCMSCs,通过细胞形态、细胞表型和分化能力检测IFNγ(10 ng/mL)对UCMSCs生物学特性的影响.同时采用ELISA法分析IFNγ对UCMSCs分泌免疫相关因子PGE-2、TGF-β1和IL-6的影响,CCK-8法检测IFNγ对UCMSCs抑制人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)增殖的影响.结果 IFNγ预处理对UCMSCs在细胞形态、细胞表型、细胞成骨和成脂肪的分化能力方面无明显影响(P＞0.05);IFNγ预处理可显著促进UCMSCs的TGF-βI及IL-6分泌(P＜0.05),但对PGE-2的分泌无明显影响(P＞0.05);IFNγ预处理可增强UCMSCs对PBMCs增殖的抑制作用(P＜0.05).结论 IFNγ预处理可增强UCMSCs的免疫调节功能.
-
富含血小板血清裂解液治疗皮肤缺损32例
目的:观察富含血小板血清裂解液治疗皮肤缺损的临床疗效.方法:2010年12月至2011年12月,采用富含血小板血清裂解液治疗皮肤缺损患者32例,男23例,女9例.年龄18 ～ 54岁,中位数37.5岁.缺损部位:手部皮肤缺损5例,缺损面积1.5 cm×1.5 cm至4 cm×3 cm；脚部皮肤缺损8例,缺损面积2.5 cm×1.0 cm至6 cm ×4.5 cm；上肢皮肤缺损7例,缺损面积3.5 cm×2.5 cm至8 cm ×7.5 cm；下肢皮肤缺损12例,缺损面积6.5 cm ×4.5 cm至10cm×9.5 cm.新鲜性损伤24例,陈旧性损伤8例.所有患者均做细菌培养,其中1种细菌生长者6例,2种细菌生长者2例；金黄色葡萄球菌3例,大肠杆菌3例,绿脓杆菌2例,变形杆菌2例.术后随访观察伤口愈合情况及并发症发生情况.结果:所有患者均获得随访,随访时间0.8 ～2个月,中位数1.3个月.伤口均愈合,无感染等并发症发生.15例在喷洒富含血小板血清裂解液10 d左右时伤口处长出新的皮肤,13例在喷洒富含血小板血清裂解液20 d左右时伤口处长出新的皮肤,4例在喷洒富含血小板血清裂解液30 d左右时伤口处长出新的皮肤.结论:采用富含血小板血清裂解液治疗皮肤缺损,效果良好,值得进一步深入研究和推广应用.
-
血小板裂解液对膝骨关节炎模型大鼠疼痛和软骨损伤的影响及作用机制研究
目的:探讨血小板裂解液(platelet lysate,PL)对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型大鼠疼痛和软骨损伤的影响及可能的作用机制.方法:取4只SD大鼠从其外周血中分离制备PL,并制成低(1×106个·mL-1)、中(1×107个·mL-1)、高(1×108个·mL-1)3种浓度的PL.取40只SD大鼠,随机分为空白组、模型组、PL低浓度组、PL中浓度组、PL高浓度组,每组8只.空白组不进行造模处理,其余4组大鼠通过向双侧膝关节腔内注射碘乙酸进行KOA造模.造模后第1天开始进行药物干预,PL低、中、高浓度组大鼠双侧膝关节腔分别注射50 μL低、中、高浓度PL,空白组和模型组大鼠双侧膝关节腔分别注射等量生理盐水,每周1次,共注射4次.分别于造模结束后第2周和第4周测定各组大鼠的压痛阈值和热痛阈值.痛阈测定结束后处死大鼠,取双侧膝关节进行组织病理学观察并评定Mankin's评分.另取5只SD大鼠,从大鼠关节软骨中分离获取软骨细胞进行体外培养,将培养的第3代软骨细胞分为空白组、模型组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组,空白组以含10％ FBS的培养基进行培养,模型组以含10％ FBS和碘乙酸的培养基进行培养,PL低、中、高浓度组分别以含10％ FBS和低、中、高浓度PL的培养基进行培养,以CCK-8法测定细胞增殖情况.结果:①压痛阈值测定结果.造模结束后第2周时,5组大鼠的压痛阈值比较,差异有统计学意义[(385.04±116.23)g,(179.23 ±74.75)g,(257.60±70.97)g,(306.79 ±56.91)g,(352.13±67.03)g,F＝8.255,P＝0.000].模型组的压痛阈值低于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组(P＝0.001,P＝0.045,P＝0.002,P＝0.000);PL高浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P ＝0.000,P＝0.001);PL中浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组(P＝0.001).造模结束后第4周时,5组大鼠的压痛阈值比较,差异有统计学意义[(540.58±97.70)g,(352.81±54.41)g,(419.17±44.74)g,(460.43±63.73)g,(493.38 ±62.53)g,F＝9.137,P＝0.000].模型组的压痛阈值低于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组(P＝0.000,P＝0.018,P＝0.003,P＝0.000);PL高浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P＝0.000,P＝0.002);PL中浓度组的压痛阈值高于PL低浓度组(P ＝0.002).②热痛阈值测定结果.造模结束后第2周时,5组大鼠的热痛阈值比较,差异有统计学意义[(8.35±2.17)s,(5.90±1.67)s,(6.77±1.08)s,(7.48±0.91)s,(8.24±1.65)s,F＝4.248,P＝0.007].模型组的热痛阈值低于空白组、PL中浓度组和PL高浓度组(P ＝0.013,P＝0.014,P＝0.007);模型组与PL低浓度组热痛阈值比较,差异无统计学意义(P＝0.118);PL高浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P ＝0.000,P ＝0.024);PL中浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组(P ＝0.002).造模结束后第4周时,5组大鼠的热痛阈值比较,差异有统计学意义[(9.75±2.10)s,(6.78±1.46)s,(7.15±1.58)s,(7.91±1.35)s,(8.67±1.55)s,F＝4.310,P＝0.006].模型组的热痛阈值低于空白组、PL中浓度组和PL高浓度组(P＝0.005,P＝0.009,P＝0.002);模型组与PL低浓度组热痛阈值比较,差异无统计学意义(P ＝0.634);PL高浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组和PL中浓度组(P ＝0.000,P＝0.019);PL中浓度组的热痛阈值高于PL低浓度组(P＝0.025).③膝关节软骨病理学观察结果.5组大鼠膝关节软骨Mankin's评分比较,差异有统计学意义[(1.63±1.11)分,(9.29±1.03)分,(5.14±1.64)分,(3.14±1.73)分,(2.57±1.40)分,F＝37.299,P＝0.000].模型组的Mankin's评分高于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组、PL高浓度组(P ＝0.000,P＝0.000,P＝0.000,P＝0.000);PL高浓度组的Mankin's评分低于PL低浓度组(P＝0.013);PL中浓度组的Mankin's评分与PL高浓度组、PL低浓度组比较,差异均无统计学意义(P ＝0.541,P＝0.062).④膝关节软骨细胞增殖测定结果.5组软骨细胞的吸光度比较,差异有统计学意义(0.71±0.06,0.46±0.01,0.58±0.02,0.66±0.11,0.69±0.01,F＝25.644,P＝0.000).模型组的吸光度低于空白组、PL低浓度组、PL中浓度组和PL高浓度组(P ＝0.001,P＝0.000,P＝0.016,P＝0.000);PL高浓度组的吸光度高于PL低浓度组(P＝0.000);PL中浓度组的吸光度与PL高浓度组、PL低浓度组比较,差异均无统计学意义(P ＝0.639,P＝0.204).结论:PL可提高KOA模型大鼠疼痛阈值,修复软骨损伤,且其作用效果与PL的剂量有关,其作用机制可能与PL能促进软骨细胞增殖有关.
-
血小板裂解液关节腔注射治疗膝骨性关节炎的临床观察
目的:观察血小板裂解液关节腔注射治疗膝骨性关节炎的近期临床疗效.方法:自2015年1月至2016年12月采用前瞻临床随机对照的研究方式,对100例膝骨性关节炎患者进行研究,治疗组(A组)50例,血小板裂解液关节腔注射治疗,对照组(B组)50例,透明质酸钠关节腔注射治疗.连续治疗1个月后比较两组患者患膝KSS评分、WOMAC评分和Lysholm评分.结果:治疗组(A组)患膝WOMAC评分明显低于对照组(B组)(P＜0.05),KSS评分和Lysholm评分均高于B组(P＜0.05).结论:血小板裂解液关节腔内注射治疗膝骨性关节炎的近期临床疗效明显,是膝关节骨性关节炎治疗方法的一种新选择.
-
正骨伸筋胶囊联合血小板裂解液对兔膝骨关节炎软骨组织形态及血清IL-1和TNF-α含量的影响
目的:观察正骨伸筋胶囊联合血小板裂解液对兔膝骨关节炎软骨组织形态及血清IL-1和TNF-α含量的影响,初步明确正骨伸筋胶囊联合血小板裂解液治疗膝骨关节炎(KOA)的作用机制.方法:将6月龄30只新西兰大白兔随机分为对照组、氨基葡萄糖组和正骨伸筋胶囊联合血小板裂解液组,每组10只.分组后建立自发性KOA模型,取耳缘静脉血.造模结束后,正常组、氨基葡萄糖组和正骨伸筋胶囊联合血小板裂解液组分别以纯水、盐酸氨基葡萄糖注射液、正骨伸筋胶囊注射液灌胃及血小板裂解液关节腔注射,1次/d,连续干预2个月后进行标本及血液采集.采集标本为新西兰大白兔右后下肢膝关节髌下韧带表面的滑膜和胫骨内侧平台软骨,制成石蜡切片;血液取血为耳缘静脉血.软骨组织切片染色后光镜下观察软骨组织形态,采用Mankin's病理评分标准进行评分;对大白兔治疗前后血清IL-1及TNF-α含量进行分析比较.结果:3组大白兔关节软骨Mankin's评分比较,差异有统计学意义[(0.284±0.128)分,(3.790±0.480)分,(2.930±0.287)分,F=113.900,P＜0.001];3组治疗前后血清IL-1及TNF-α含量比较差异有统计学意义(P＜0.05),治疗组治疗后血清IL-1及TNF-α含量优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:正骨伸筋胶囊联合血小板裂解液和盐酸氨基葡萄糖均可延缓KOA兔膝关节软骨退变,但正骨伸筋胶囊联合血小板裂解液的作用更加明显;正骨伸筋胶囊能有效降低膝骨关节炎患者血清IL-1及TNF-α含量,血小板裂解液可修复关节软骨,为其减少炎症刺激等作用机制提供了一定的分子细胞生物学及生物组织工程学方面的依据.
-
人血小板裂解液替代胎牛血清促进骨髓间质干细胞的增殖
目的 探讨人血小板裂解液(human platelet lysates,HPL)对骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖以及生物学特性的影响.方法 通过对机采血小板反复冻融获得HPL,采用密度梯度离心法从骨髓中分离MSCs,分别用10％胎牛血清(feotal calf serum,FCS)和LD-DMEM添加不同浓度的HPL进行培养,以确定佳HPL浓度.分离6株人源MSCs,从原代开始分别用添加胎牛血清和佳HPL浓度的LD-DMEM进行培养,对两种培养体系下6株不同来源的MSCs的增殖能力,表面标记表达量以及细胞周期进行研究,并利用t-test进行统计学分析,P＜0.05视为有统计学差异.结果 研究发现HPL中含有MSCs生长所必需的4种生长因子,PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB),bFGF(成纤维细胞生长因子),IGF-1（胰岛素样生长因子1）,TGF-β1（转化生长因子β1）,浓度分别为:(0.53+0.06)ng/ml,（37.5+4.31）pg/ml,(0.15+0.06) mg/ml,(5150±463)pg/ml.适合MSCs增殖的佳HPL浓度为7.5％.两种培养条件下的细胞形态无明显区别,均为长梭形.8代以前,细胞增殖能力没有显著性差异(P＞0.05),两种培养条件下的MSCs均表达CD105,CD106以及粘附分子CD29和CD44,不表达CD34,CD45,且其表达量没有显著性差异(P＞0.05).两种培养体系下绝大多数细胞处于G0-G1期,FCS培养的MSCs其G0-G1期占(96.97±0.95)％,7.5％的HPL培养的MSCs其G0-G1期占(94.58±1.56)％,两种培养条件下不同周期没有显著性差异(P＞0.05).结论 本研究适合MSCs增殖的佳HPL浓度为7.5％,HPL可以替代胎牛血清体外培养扩增人骨髓间质干细胞,并保持其生物学特性基本不变.
-
人血小板裂解液对骨髓间质干细胞成骨成脂分化的影响
目的 探讨人血小板裂解液(HPL)体外培养人骨髓间质干细胞(MSCs)及其对MSCs成骨和成脂分化能力的影响.方法 采用贴壁法分离培养3株人骨髓来源MSCs,每株细胞在培养时平行分为2个实验组,分别用含10％胎牛血清的低糖培养基和含7.5％ HPL的低糖培养基培养,均培养MSCs至第5代,分别用成骨及成脂诱导液对每组MSCs做成骨、成脂分化诱导,诱导成功后分别用茜素红、油红O对成骨和成脂分化结果染色鉴定,并进一步对成骨、成脂诱导结果做定量分析:成骨分化染色后洗脱茜素红在562 nm波长下测定OD值并对每个培养孔细胞做蛋白定量,以茜素红OD值与蛋白定量值的比值作为成骨分化的定量值；成脂分化染色后用异丙醇洗脱油红O,在510 nm波长下测定OD值,以之作为成脂分化的定量值.对所得的结果做统计学分析.结果 对第5代的MSCs做成骨诱导12 d后,光镜下可见致密结节形成,茜素红染色及定量鉴定结果显示2种培养液培养的MSCs均能成功向成骨细胞分化,而7.5％HPL培养的MSCs成骨能力比10％ FBS培养的MSCs强,定量鉴定结果分别为16.548±4.397、4.151±5.631 (P ＜0.05).成脂诱导12 d后,细胞内有明显脂滴形成,油红O染色及定量分析结果显示MSCs成功向脂肪细胞分化,但7.5％ HPL培养的MSCs成脂能力与10％FBS培养的MSCs相比较弱,定量鉴定结果分别为0.239±0 030、0.497±0.105(P ＜0.05).结论 HPL可以促进MSCs成骨分化,抑制其成脂分化.
-
浓缩血小板制备血小板裂解液及其质量特性的初步研究
目的 探索浓缩血小板制备血小板裂解液的方法并初步确定所制备血小板裂解液的质量特性.方法 富血小板血浆法制备浓缩血小板,以-80℃冰冻8 h/12 h/24 h,37℃空气浴融化反复冻融制备血小板裂解液,检测裂解效率.pH计检测pH值,生化分析仪检测TP、ALB浓度,ELISA方法检测PDGF、VEGF、EGF、TGF-β、IGF-1等细胞因子浓度,并以95％参考区间确定其质量特性.结果-80℃12 h,37℃反复冻融6次血小板裂解达到＞95％,pH、TP、ALB、PDGF-AA/AB/BB、VEGF、EGF、TGF-β、IGF-1 95％参考区间分别为6.72-7.38、(45-57) g/L、(22-38) g/L、(0.98-2.01) ng/mL、(122-293) ng/mL、(5.35-15.6) ng/mL、(0.49-1.82) ng/mL、(2.97-8.03) ng/mL、(177-290)ng/mL、(95-154) ng/mL.结论 建立了以浓缩血小板反复冻融制备血小板裂解液的有效方法并初步确立了其质量标准.
-
血小板裂解液的制备及生物学效应观察
目的 制备高含量细胞因子的血小板裂解液(PL).方法 采用反复冻融法[-80℃～37℃冻融3次(冻24 h/次)]和超声法(285 W,每次超声处理5 s停止5 s,共10次)处理10份单采血小板制剂(30 mL/份),ELISA法对细胞因子,血小板衍生长因子(PDGF)-AA、PDGF-AB、PDGF-BB,转化生长因子-β1(TGF-β1),血管内皮生长因子165(VEGF165)检测,同时将2种方法制备的PL按10％比例加入常规培养基DMEM/F12培养第5代人脐血间充质干细胞,观察传至第7代细胞增殖情况,并与FBS液培养(组)比较.结果 血小板保存3d后制备成的PL各因子含量均升高,0d浆与3d浆相比,PDGF-AA (ng/mL)为0.071±0.024 vs2.494±0.326,PDGF-AB (pg/mL)为36.079±15.54 vs 5 866.572±859.31,PDGF-BB(pg/mL)为33.258±21.23 vs 641.69±80.58;VEGF165 (pg/mL)为26.661±5.42 vs 122.652±10.59;TGF-β1 (pg/mL)为55.556±6.16 vs3 930.022±827.68(P＜0.05或＜0.01).超声法可释放更高含量的细胞因子,3d反复冻融组与3d超声组比较,PDGF-AA (ng/mL)为0.095±0.025 vs1.28±0.236,PDGF-AB(pg/mL)为12 424.746±3 738.03 vs 19 610.987±10430.26;PDGF-BB(pg/rnL)为5 429.184±1 824.53 vs8 397.039±611.93;VEGF165 (pg/mL)为128.379±46.69 vs374.552±32.48;TGF-β1 (pg/mL)为8 820.789±1 755.45vs 14 686.780±7 164.89(P＜0.05或＜0.01).结论 反复冻融法和超声法均能有效释放血小板内的细胞因子;超声法处理血小板能释放更高含量的细胞因子,可替代FBS用于细胞培养.
-
组织工程骨促进大鼠骨缺损修复的实验研究
目的 探讨组织工程骨对大鼠骨缺损的修复效果. 方法 取16只成年健康Wismr大鼠,体重250～300 g,雌雄不限,制备血小板裂解液(platelet lysate,PL).将PL、异体脱钙骨颗粒(allogeneic decalcified bone granules,ADBG)与Col Ⅰ凝胶混合,构建PL/ADBG/Col Ⅰ(PAC)及ADBG/Col Ⅰ(AC).取8只成年健康Wistar大鼠,体重250～300 g,雌雄不限,分离培养BMSCs.取第5代BMSCs以1×106个/mL浓度接种至PAC复合培养,体外构建组织工程骨(PACB).另取成年健康Wistar大鼠40只,制备双侧股骨髁缺损模型,随机分为A、B、C、D 4组(n=10),分别植入400 mg PACB、PAC、AC和Col Ⅰ.术后4周,行X线片及组织学观察、ALP活性检测,评价骨缺损修复效果. 结果 术后4周,A、B、C、D组骨密度分别为(7.31±0.54)、(4.36±0.67)、(2.12±0.47)、(1.09±0.55)像素:修复区新生骨软骨和成活的移植骨片总面积分别为(412.82±22.31)、(266.57±17.22)、(94.34±20.22)、(26.12±12.51)像素/视野;股骨髁内ALP含量分别为(94.31±7.54)、(69.88±4.12)、(41.33±3.46)、(21.03±3.11)U/L;以上指标A组均高于B、C、D组,D组低,差异均有统计学意义(P<0.05).流式细胞仪分析显示,T细胞亚群CD3+CD4+CD8-、CD3+CD8+CD4-百分比和CD4/CD8比值在各组间差异均无统计学意义(P>0.05). 结论 体外构建的PACB可促进大鼠骨缺损修复.
-
血小板裂解液对大鼠BMSCs成骨分化的干预效应
目的 观察血小板裂解液(platelet lysate,PL)对大鼠BMSCs成骨诱导分化的干预效应.方法 成年健康清洁级Wistar大鼠24只,体重250～300 g,雌雄不限.取16只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,ELISA法测定PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量.另取8只大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BMSCs,取第4代细胞按1×104/cm2接种行成骨诱导培养.按诱导培养液的不同,实验分为3组,A、B组基础诱导培养基中分别含终浓度为5%和1%的PL,C组仅含基础诱导培养基.倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化及生长状况;诱导培养7d,各组行ALP染色;诱导培养2、8、10d,ALP/总蛋白含量确定ALP活性;诱导培养20 d,茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析.结果 PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量分别为(300±30)、(140±25)、(80±35)和(70±20)pg/mL.倒置相差显微镜观察,各组BMSCs形态逐渐发生改变,出现类成骨细胞样形态特征;A组细胞形态变化不及B、C组明显,但细胞增殖较快:20 d A组细胞仍密集生长,ECM中形成的矿物沉积显著少于B、C组.诱导培养7 d,A组细胞胞浆中有少量颗粒,ALP染色呈弱阳性;B、C组细胞胞浆中有大量棕褐色颗粒,ALP染色呈强阳性.诱导培养2、8、10d,ALP活性定量分析示A组显著低于B组和C组(P<0.05).诱导培养20d,茜素红染色显示A、B、C组钙结节数量分别为(7.67±1.10)、(12.87±0.81)和(15.59±1.25)个;矿化结节面积分别为(161 778.70±44 550.80)、(337 349.70±56 083.24)和(415 921.70±71 725.39)像素;A组均明显低于B组和C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 PL 是多种生长因子的承载体系,以剂量依赖方式抑制BMSCs成骨诱导中ALP活性和矿化结节形成.
