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免疫亲和层析法纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体
目的:制备可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱.方法:纯化的抗抗CD3 ScFv单克隆抗体与预活化的Sepharose 4B偶联制成免疫亲和层析柱,采用自制的免疫亲和层析柱纯化由摇瓶发酵获得的抗Pgp/抗CD3双功能抗体,采用间接免疫荧光法测定抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合活性.结果:成功地制备了可以纯化抗Pgp/抗CD3双功能抗体的免疫亲和层析柱,采用此柱纯化的抗体与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合的活性与带有E-tag纯化标志的抗体基本一致.结论:此介质可以替代价格高昂的E-tag亲和层析介质在纯化Pgp/抗CD3双特异双功能抗体中的应用,同时还可以避免由于E-tag纯化标志而带来的免疫原性问题,此项研究工作为抗Pgp/抗CD3双功能抗体将来在临床应用奠定了基础.
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单克隆抗体亲和层析法纯化SEB及其活性鉴定
目的:采用亲和层析法获取高纯度的金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB),并对其进行活性分析.方法:采用正辛酸沉淀法纯化了一株抗SEB的单克隆抗体(1D2),与CNBr活化的Sepharose4B偶联制成亲和层析柱纯化SEB,并对其超抗原活性和抗原活性进行鉴定.结果:与离子交换纯化法和市售的标准品相比较,亲和层析法纯化的SEB纯度高,纯化的效率为60.71%.同时,纯化后的SEB具有良好的抗原性和超抗原活性.结论:单克隆抗体亲和层析法可以高效率地纯化高纯度的SEB.
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特异性IFN-α2b多克隆抗体的制备及鉴定
干扰素α家族至少有15个亚型,彼此之间有78%～98%的同源性[1],尤其是IFN-α1和IFN-α2亚型之间的差异更小.以不同亚型的干扰素制备的多克隆抗体与抗原之间有很多的交叉反应.本文利用自行设计的亲和层析组合柱从复杂的多克隆抗体中除去与其他干扰素有交叉反应的抗体,得到针对IFN-α2b的特异性抗体.这种纯化IFN-α2b多克隆抗体的方法非常简便快捷.
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Allo A-Sepharose 4B亲和层析分离糖缺失转铁蛋白(CDT)
目的 建立Allo-A Sepharose亲和层析技术分离血清中糖缺失转铁蛋白(CDT)和转铁蛋白(Tf).方法 Allo-A与的偶联反应在0.1mmol/L NaHCO3(含0.5mmol/L NaCl)内进行;Allo-A Sepharose 4B亲和层析技术用于分离血清CDT和Tf;ELISA用于定量CDT和Tf.结果 Allo-A Sepharose 4B亲和层析图谱显示2个洗脱峰,CDT存在于第一洗脱峰,Tf存在于第二洗脱峰.ELISA测定结果显示,在5例正常血清中,CDT水平为4.53～4.76(CV=1.8～9.7%),Tf水平为255.3～524.9(CV=5.1～10.7%);在5例患者血清中,CDT水平为3.04～4.20(CV=0.8～11.6%),Tf水平为6.05～34.73(CV=0.7～11.1%).表明Allo-A Sepharose 4B亲和层析技术在分离CDT和Tf中,具有较理想的可重复性.结论 Allo-A Sepharose 4B亲和层析技术可用于CDT和Tf的分离,如果能够获得CDT参比血清,可进一步评价该技术的灵敏度.
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亲和层析法纯化溶栓素
目的:探讨亲和层析纯化溶栓素的方法.方法:采用高碘酸钠法制备溶栓素抗体的亲和层析介质纯化溶栓素.结果:提纯的溶栓素经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为一条带,活性回收率为49.5%.结论:亲和层析的高碘酸钠法是纯化溶栓素的一种分离速度快、特异性强、经济、安全可靠的方法,并适合于大规模纯化.
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人胎盘泌乳素酶联免疫方法的建立及其应用
目的:建立一种检测胎盘功能的新手段.方法:从人胎盘匀浆中分离、纯化出人胎盘泌乳素(HPL)纯品,制备HPL抗体.用改良的过碘酸钠法制备HPL抗体与辣根过氧化物酶结合物,建立了双抗体夹心的酶联免疫方法,检测了正常妊娠和高危妊娠孕妇血中HPL水平.结果:高危妊娠和血中NPL值低,且HPL低值者的胎儿宫内窘迫、低Apgar评分的发生率均高于HPL值正常组,两组相比差异均有显著性.结论:该法具有特异、敏感、快速、准确等优点,可作为检测胎盘功能的一项可靠指标.
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基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化
目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.
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狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白密码子优化、原核表达及多克隆抗体的制备
目的 对狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白(matrix protein,MP)密码子进行优化,原核表达重组蛋白,并制备多克隆抗体.方法 通过GenBank查找狂犬病病毒CTN-1株M蛋白编码序列并体外合成,将目的 序列插入原核表达载体pET-28b,构建重组质粒pET-28b-M,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达M蛋白,经亲和层析和复性后,免疫豚鼠制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA检测多抗的免疫反应性以及效价.结果 成功构建了pET-28b-M重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,经亲和层析及透析获得纯化的重组M蛋白,制备的多克隆抗体可与M蛋白发生特异性结合,效价达1∶21 870.结论 成功优化表达了狂犬病病毒CTN-1株M蛋白,制备了高效价的多克隆抗体,为后续M蛋白生物学分析以及新型狂犬病疫苗的研究奠定了基础.
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应用于抗体药物捕获的耐碱亲和层析介质性能的比较
目的 比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考.方法 利用两种单抗纯品(mAb1和mAb2)测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果.结果 在5％穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35～73 g/L之间.小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89％,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96％;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内.结论 结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质.
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截断型人可溶性CD40L的表达与纯化
目的表达相对分子质量18 000的截断型人可溶性CD40L.方法针对人CD40L(Glu108-Leu261)设计引物,以全长人CD40L为模板,扩增目的基因,经pGEM-T中间载体进一步连接到pQE-40载体,构建pQE/sCD40L表达载体.转化E.coliM15后经IPTG诱导表达,分离、洗涤包涵体,并利用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,经复性后检测对骨髓瘤细胞SP2/0细胞株的抑制作用.结果克隆的目的基因为480bp,经测序与文献报道一致,所构建的菌株(M15/PQE/sCD40L)经诱导表达目的蛋白量为26.7%,相对分子质量为18 000,纯化后蛋白纯度为96.5%,对SP2/0细胞有生长抑制作用.结论原核表达的截断型人可溶性CD40L具有抑制肿瘤细胞生长作用.
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纤维连接蛋白的提取及其在细胞培养中的应用
目的 从牛血清中提取纤维连接蛋白(Fibronectin,FN),并观察其在细胞培养中的作用.方法 将明胶偶联于溴化氰活化的Sepharose-4B,采用亲和层析法从牛血清或粗提后的样本中提取FN,并检测其蛋白含量.用纯化的牛FN处理细胞培养板,观察细胞在板中的生长情况,并与在进口板中的生长情况进行比较.结果 所提取的FN,其蛋白含量约为400 μg/ml,电泳结果与FN对照品一致,均为两条主带.用其处理的细胞培养板,培养细胞的形态和密度与进口板比较无明显差异.结论 用溴化氰活化的Sepharose-4B提取FN是可行的,且其在细胞培养中有良好的助黏附与贴壁作用,有助于细胞培养.
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葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺
目的 建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺.方法 采用超声波破菌和IgC-Sepharose 4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量.结果 此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4.7、4.4和5.4 mg/ml,收率分别为2.70、2.64和3.78g/100 g湿菌.对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线.经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160 000～180 000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67 000和34 000.结论 已成功建立了分离纯化SPA的新工艺.
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重组G145R HBsAg亲和纯化方法的建立及其应用
目的 建立重组乙型肝炎病毒G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法.方法 用抗-HBs单克隆抗体(D12-McAb)制备亲和层析胶,对2A8细胞(分泌G145R变异HBsAg)培养上清盐析物进行亲和纯化.采用SDS-PAGE、Western blot 及ELISA,对纯化产物的纯度、特异性、含量和回收率进行鉴定,并与同法纯化的HBsAg阳性血清及r-wHBsAg提取物进行比较.结果 D12-McAb对重组真核表达G145R变异HBsAg、HBsAg阳性血清及r-wHBsAg三者具有相似的亲和性,产物纯度分别为90.3%、95.2%和93.1%,回收率分别为43.3%、72.0%和66.4%.结论 已成功地建立了重组G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法,为G145R变异以及其他HBV免疫逃逸变异感染的深入研究奠定了重要的技术基础.
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两种亲和层析方法纯化兔抗CHO细胞蛋白多克隆抗体的比较
目的 比较两种亲和层析法纯化兔抗CHO细胞蛋白多克隆抗体的效果.方法 制备可溶性CHO细胞蛋白,免疫家兔,获得兔免疫血清,采用蛋白A亲和层析和抗原偶联亲和层析两种方法分别纯化兔抗CHO细胞蛋白抗体,ELISA测定抗体效价;SDS-PAGE分析抗体纯度;Western blot分析抗体的特异性.结果 兔IgG经蛋白A亲和层析纯化后,ELISA效价约为1:106,抗体纯度达81.3%;经抗原偶联亲和层析纯化后,ELISA效价可达1:107,抗体纯度达80.6%.两种方法纯化的抗体特异性均较好.结论 抗原偶联亲和层析法更适合纯化兔抗CHO细胞蛋白多克隆抗体.
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重组单抗药物亲和层析病毒去除工艺验证
目的 对重组单抗药物亲和层析病毒去除工艺进行验证.方法 以甲型流感病毒H1N1亚型、单纯疱疹病毒1型和腺病毒5型作为指示病毒,分别使用新、旧rProtein A Sepharose Fast Flow(rProtein A SFF)层析介质考察重组抗狂犬病病毒单抗亲和层析步骤对病毒的去除效果.结果 经新、旧rProtein A SFF介质亲和层析后,3种指示病毒的滴度均下降4.0log10以上.结论 rProtein A SFF亲和层析工艺能有效去除重组单抗药物的潜在病毒污染.
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用亲和层析处理的抗体鉴定布鲁氏菌致病株与疫苗株差异抗原的研究
目的 建立用亲和层析处理的抗体鉴定布鲁氏菌致病株与疫苗株差异抗原的方法.方法 以羰基二咪唑(CDI)活化载体sepharose CL 4B,制备布鲁氏菌抗原亲和层析柱.致病株M28抗体先经疫苗株M5抗原柱吸附、中和,洗出液再经致病株M28抗原柱纯化、浓缩,分别与M28、M5抗原进行免疫印迹反应.结果 处理后的M28抗体与M28抗原间存在两条特异的反应条带,此两条条带没有出现在与M5抗原的反应条带中.结论 通过亲和层析处理的致病株M28抗体能够用于布鲁氏菌致病株与疫苗株差异抗原的鉴定.
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生物活性肽Lunasin的原核表达和分离纯化
目的:利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin.方法:将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达.然后利用亲和层析技术将含有6x His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干.结果:①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白.②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白.结论:在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin.
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基于亲和层析方法研究栀子苷的药物靶标
目的:运用亲和层析方法初步探索栀子苷的特异结合蛋白.方法:采用环氧氯丙烷(Epichlorohydrin,ECH)作为活化试剂对琼脂糖凝胶进行环氧基修饰,通过偶联栀子苷与环氧活化的琼脂糖凝胶(epoxy activated Sepharose CL-6B,EAS6B),制备以栀子苷为配基的亲和介质,以高效液相色谱法验证其偶联.利用栀子苷-EAS6B亲和介质,从小鼠脑组织总蛋白中筛选特异结合蛋白.结果:优化偶联条件后,得到佳的活化反应条件:15％ECH、0.8 mol/L NaOH于37℃反应3h,环氧基密度达到122 μmol/mL,琼脂糖凝胶亲和介质的偶联量为19.53％,偶联率为17.08 μnol/mL.从小鼠脑组织总蛋白中筛选得到3个栀子苷特异结合蛋白的条带,经质谱鉴定,发现主要是由热休克蛋白、脑酸溶性蛋白和谷氨酰胺合成酶等组成.结论:确立了琼脂糖凝胶环氧活化的佳条件,制备了栀子苷-EAS6B亲和介质并应用其筛选出栀子苷的结合蛋白.
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亲和层析法提取纯化人心肌肌钙蛋白I
目的 研究出一种提纯人心肌肌钙蛋白I (cTnI)的简便方法.方法 将兔骨骼肌肌钙蛋白C (sTnC)与经溴化氰活化的Sepharose 4B凝胶偶联,制成sTnC亲和层析柱.人心肌经匀浆、离心后, 上清液上sTnC亲和层析柱,洗脱后可获得cTnI纯品.结果 SDS-PAGE得到一条电泳带,其分子量为25 kD.Western blot结果表明,提纯的cTnI可被cTnI单克隆抗体特异性识别.cTnI产率为82.6 mg/100 g人心肌.结论 亲和层析法提高了cTnI的产率,为下一步cTnI体外诊断的研究工作打下基础.
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亲和层析在制药与生物医学中的应用研究进展
在生物大分子和药物分子的研究中,亲和层析正变得越来越重要.有些分子之间存在着特异性的相互作用,如酶与底物、抗原与抗体等,它们能够专一而可逆的结合,这种结合力就是亲和力,亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在基质上,利用分子间亲和力的特异性和可逆性,对样品中的另一个分子进行吸附或研究样品中与其发生相互作用的分子.
