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原发性肝癌肝型碱性磷酸酶凝集素亲和层析测定及临床意义
目的研究血清肝型碱性磷酸酶(L-ALP)凝集素亲和层析用于原发性肝癌诊断的价值.方法用麦胚凝集素(WGA)分离血清骨型碱性磷酸酶(B-ALP)和L-ALP,再将L-ALP进行蔓陀萝凝集素(DSA)亲和层析,分离不同亲和力组分.结果正常人血清L-ALP不与DSA结合,在慢性肝炎及肝硬化患者血清中分离到DSA弱结合组分,原发性肝癌患者血清出现了特有的DSA强结合组分,64例原发性肝癌血清中阳性率为92.19%,其中14例原发性小肝癌(癌结节小于5 cm)有78.57%的阳性率.结论 L-ALP的DSA强结合组分为原发性肝癌特异性标志,L-ALP凝集素亲和层析是一种诊断原发性肝癌的灵敏可靠的方法.
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抗Resistin合成多肽抗体的制备及鉴定
目的制备抵抗素合成肽及其抗体.方法根据人抵抗素cDNA编码的氨基酸序列合成抵抗素分子22～34位的13个氨基酸的多肽(CSMEEAINERIQE),并利用MBS双功能试剂将人工合成多肽成功地与KLH进行偶联,免疫家兔制备抗抵抗素合成多肽的抗体,并经亲和层析进行了纯化.结果对此抗体进行鉴定的结果表明,抗人抵抗素合成多肽抗体可与天然抵抗素分子发生特异性反应,并可用于免疫沉淀和Western blot.结论该抗体的制备为Resistin分子功能的研究及肥胖和2型糖尿病的机制研究提供了有用的工具.
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用亲和层析法纯化人精浆蛋白
[目的]用亲和层析法从增生的前列腺组织中纯化人精浆蛋白(γ-seminoprotein,γ-sm).[方法]采用超声波粉碎、NP-40提取与两种免疫亲和层析相结合[抗人精浆蛋白单抗(E4B7mAb)亲和层析和蛋白A亲和层析]的新提纯方案,获得了高纯度γ-sm抗原.[结果]所纯化的γ-sm蛋白经ELISA双抗夹心法和免疫印迹分析检测证明,用此法从增生的前列腺组织中分离到γ-sm抗原,而且纯化的γ-sm具有生物活性.[结论]这种方法的建立将为分离γ-sm抗原提供一种有效途径,为抗精浆蛋白基因工程抗体的研究提供良好的抗原保证.
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人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究
目的：构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体，纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体，并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性，蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白；Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符；KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论成功构建HD-5原核表达载体，经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。
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LPS亲和层析柱吸附抗LPS抗体的实验研究
目的:制作LPS亲和层析柱(affinity chromatography columu)并观察它对急性运动轴索型神经病(acute motor axonal neuropathy, AMAN)患者血浆中的抗脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)抗体的吸附.方法:以致AMAN空肠弯曲菌(campylobacter jejuni, Cj) Penner 0∶19型的LPS作为配体与CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow亲和介质偶联制作亲和层析柱;利用间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)检测过柱前后样本以及抗体经洗脱后,洗脱液中所含抗LPS抗体滴度.结果:阳性的抗LPS抗体血浆流过LPS亲和层析柱后,12/13管流出液中抗LPS抗体变为阴性;抗体经洗脱后,在洗脱液中检出高滴度的抗LPS抗体.结论:LPS亲合层析柱是一种去除AMAN病人血浆中抗LPS抗体较为理想的方法.
关键词： 急性运动轴索型神经病 空肠弯曲菌 脂多糖 亲和层析 -
MBL的提纯及初步鉴定
目的:本研究拟从人混合血浆中提取MBL并初步鉴定,为进一步深入研究MBL的一些特性奠定基础.方法:取混合血浆通过前处理后经过Mannan-Agarose亲和层析的方法纯化,收集含蛋白的洗脱液,充分透析、浓缩即得,用SDS-PAGE对提取物质进行鉴定.结果:用纯化后的产物经过SDS-PAGE,在30kDa处显示两条谱带(对应的分子量约为28kDa和32kDa处),回收率为20%.结论:成功用二步亲和层析法从健康人血浆中提纯MBL,取得了比较满意的结果.
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重组人Jo-1抗原的表达、纯化以及免疫特异性检测
目的 表达纯化重组人Jo-1抗原,免疫印迹和ELISA检测其免疫特异性.方法 IPTG诱导含有Jo-1基因的重组菌,获得高表达的可溶性融合蛋白(MBP-Jo-1),亲和层析纯化该表达蛋白,免疫印迹和ELISA分别检测其抗原性并与生化提取的Jo-1抗原比对.结果 表达的重组Jo-1蛋白具有Jo-1抗原的特异性.结论 重组Jo-1蛋白与天然Jo-1抗原具有相同的免疫原性和免疫原特异性.
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一种肝癌特异性GGT的DSA亲和色谱检测方法
目的 建立一种特异的检测血清中肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶(HS-GGT)的亲和层析方法,并观察HS-GGT对原发性肝癌(PHC)的鉴别诊断价值.方法 采集64例PHC、22例肝外肿瘤、68例良性肝病及21例正常对照者的血清,以神经胺酸酶(NMD)水解后直接用欧曼陀罗凝集素(DSA)亲和层析柱分离,首先用柱平衡液洗脱不结合组分,再用50 mmol/L醋酸洗弱结合组分,后用100 mmol/L醋酸洗脱强结合组分,用连续监测法测定各组分中的GGT活性,并分析各组分GGT在PHC鉴别诊断中的价值.结果 DSA强结合组分中的GGT为PHC患者所特有,以其在总GGT所占比例＞2%为PHC诊断的Cutoff值,其诊断特异度为95.5%,灵敏度为85.8%,准确度为92.0%.结论 该方法能较好地鉴别诊断PHC,较其他检测方法更为简便,且同样有着较高的诊断灵敏度和特异度.
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RA33/36抗原的纯化及相应抗体的检测
目的纯化RA33/36抗原,观察其检测效率.方法从小鼠Ehrlich腹水癌细胞中提取RA33/36粗抗原,使用肝素-琼脂糖凝胶CL-6B对RA33/36粗抗原进行亲和层析,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)和免疫印迹法(IBT)检测富含RA33/36的组分,比较粗抗原和纯化抗原的检测效果.结果SDS-PAGE和IBT显示RA33/36抗原主要存在于缓冲液C的洗脱峰中,纯化抗原较粗抗原杂蛋白条带明显减少,且更加清晰,在检测RA33/36抗体时得到了相同的阳性和阴性结果.结论纯化的RA33/36抗原较粗抗原提高了抗体检测效率,可广泛应用于临床.
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RA33/36纯化抗原检测抗体在类风湿关节炎的应用
目的探讨RA33/36抗体对类风湿关节炎(RA)的临床价值.方法以纯化的RA33/36为抗原,用免疫印迹法检测RA498例、其他风湿性疾病患者514例、正常对照50名,比较RA33/36抗体在各组人群中的阳性率,并评价其与RA患者临床和实验室指标间的关系、早期诊断及联合诊断价值.结果 RA33/36抗体在RA中的灵敏度为32.93%,特异性为88.52%,在RA早期病例中阳性率为32.03%,在72例类风湿因子(RF)阴性的RA患者中有21例阳性(29.17%).RA33/36抗体与抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体联合检测,特异度为98.46%.RA33/36抗体阳性组和阴性组的关节肿胀数、疼痛关节数、功能分级、X线分期及其他临床指标差异无统计学意义,RF、抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗Sa抗体及抗CCP抗体阳性率两组差异均无统计学意义.结论 RA33/36抗体对RA有较好的灵敏度和特异度,且有早期诊断价值,并对RF有补充诊断价值,与抗CCP抗体联合诊断可提高诊断的特异性,可广泛应用于RA的临床诊断.
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亲和层析Sa抗原及其抗体检测与老年类风湿关节炎
类风湿关节炎(RA)是我国常见的一种关节疾病,有报道其患病率随年龄增长而增加,随着我国人口老龄化,RA在老年人中的每年新发患者可达十几万人.因此,重视老年类风湿关节炎(EORA)的早期诊断对改善患者的生活质量及减轻家庭和社会负担都很有意义.
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RhD阳性血影细胞抗原性及血浆抗-D抗体分离
目的 探讨用不同渗透浓度的磷酸盐缓冲液(PBS)制备的RhD阳性影细胞的抗抗原性及应用该细胞从低效价血浆中分离抗-D抗体的方法.方法 用不同渗透浓度的PBS作为裂解液,将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞,观察其抗原性;以血影细胞为固相抗原,经亲和层析法从抗-D抗体含量为0.814 μg/ml的健康人血浆中分离抗-D抗体,检测相关指标.结果 用pH 7.4、30 mmol/L PBS制备的血影细胞形态完整,保持较强的抗原性;用该细胞血胞成功获得抗-D抗体,回收率达到84.65%,其中IgG单体加二聚体含量为99.3%,不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白(henoglobin,Hb).结论 用pH 7.4、30mmol/L PBS制备的血影细胞可作为固相抗原从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体.
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蚯蚓纤溶酶分离及部分生化性质的研究
采用亲合层析法对蚯蚓纤溶酶进行初步纯化,并对其生化特性进行鉴定.结果表明:经纯化的蚯蚓纤溶酶其分子量在20KD-30KD之间,对人血纤维蛋白平板具有良好的溶解作用,并考察了其热稳定性.纤溶酶能激活血栓中的纤溶酶原,从而使血栓溶解,直接作用于血栓表面,使形成血栓的纤维蛋白溶解成小分子,达到抗血栓之目的.
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血管性血友病因子A1分子在大肠杆菌中的可溶性表达及功能鉴定
背景：血管性血友病因子A1通过介导随流血小板在受损血管部位的黏附在初始止血中发挥至关重要的作用，但重组A1在原核中多为包涵体表达，不利于纯化及体外的功能研究。
目的：在大肠杆菌中稳定高效表达可溶性野生型血管性血友病因子A1以及突变型血管性血友病因子G1324S，并研究其生物学功能。
方法：将血管性血友病因子A1(野生型)、血管性血友病因子G1324S(功能失去型突变体)重组质粒分别转化到感受态细胞DH5α中，筛选提取质粒。将提取的质粒分别转化到大肠杆菌(E.coli)BL21、E.coli M15中，筛选挑单克隆菌于LB培养基，扩大培养。比较溶菌酶破碎法和超声波破碎法两种不同的裂菌方法，使目的蛋白血管性血友病因子A1的可溶性表达，经过Ni柱亲和层析纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化的血管性血友病因子A1、血管性血友病因子G1324S纯度和免疫学活性；采用流动腔实验系统分析在不同流体剪应力条件下，血小板在两种目的蛋白上的黏附能力。
结果与结论：每100 mL上清液可分别纯化得到5.77 mg血管性血友病因子A1，6.83 mg血管性血友病因子G1324S纯品，并具有较高的纯度和免疫学活性。流动腔结果显示，对每个剪切应力下铺设不同A1分子的底板进行两两比较，随着流体剪应力从0.1 Pa提高1 Pa，G1324S突变组所黏附细胞数下降的幅度(46.8%)要远高于野生型组(20.5%)，说明突变后的A1分子的功能有所减弱。结果表明纯化的蛋白介导血小板黏附的能力与临床特征一致，野生型血管性血友病因子的结合活性明显高于突变型。 -
艾氏腹水瘤细胞热休克蛋白70的抗瘤效应
目的观察从艾氏腹水瘤细胞胞浆中提纯的热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的抑瘤作用,并探讨其机制.方法用亲和层析提纯艾氏腹水瘤细胞的HSP70,应用体内免疫法检测HSP70的抑瘤作用,用3H-TdR释放法检测特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性.结果与对照组相比免疫组小鼠平均肿瘤重量明显减轻、体积明显缩小,特异性CTL的杀伤活性显著增强.结论HSP70可诱导机体产生特异性杀伤活性,抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长.
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人血浆来源血管抑素的分离与纯化
血管抑素(angiostatin,AGN)是1994年O'Reilly等学者从荷瘤小鼠的血清和尿液中首次提纯出来的一种相对分子量为38KD的多肽类物质,具有抑制新生血管生成的作用[1],命名为血管抑素.
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用亲和层析法纯化牛精浆蛋白
目的:从牛精浆中纯化牛精浆(BSP)蛋白.方法:利用盐析及亲和层析等方法对BSP蛋白进行纯化. 结果:用Gelatin-Sephorase 4B亲和胶纯化出一个蛋白峰,经电泳及氨基酸测序证实为BSP-A1/-A2蛋白.结论:用市售Gelatin-Sephorase 4B亲和胶可方便的纯化出BSP-A1/-A2蛋白.
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长白山乌苏里蝮蛇降纤酶层析分离和特性研究
采用简洁、高效、高产、高速及制药企业容易实施的分步洗脱制备降纤酶工艺，生产的降纤酶符合部颁标准，并适合制药企业连续大规模生产。
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单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素
单克隆抗体亲和层析技术可用来从体液、组织抽提液、细胞培养液中,特别是从基因工程菌体破碎液等复杂组成物中分离出微量蛋白质和多肽.由于其特异性高,操作简便而迅速,在高价值蛋白质和治疗用多肽的下游处理过程中,作为一种良好的分离纯化工具,有较广泛的适用性.本文运用该技术从人生长激素(hGH)基因工程菌发酵破碎液中一步分离制备高纯度并具有生物活性的重组hGH.
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自制肝素亲和柱分离纯化载脂蛋白H及其抗体制备与鉴定
目的:自制肝素-琼脂糖6B亲和柱提纯人血清载脂蛋白H (apoH),免疫制备多克隆抗体,为大量制备与进一步研究做准备.方法:利用间接还原胺化法制备亲和层析柱,并优化反应条件.运用高氯酸沉淀、离子交换及亲和层析从人血清中纯化抗原,制备兔源多克隆抗体.结果:自制亲和柱肝素结合量约5 mg/g (介质体积).纯化的抗原经SDS-PAGE鉴定分子量约50 kD,无杂带;16种氨基酸组成分析结果与报道一致.多克隆抗体与购置的国外抗体一样,在进行ELISA与dot-ELISA时与小牛血清白蛋白有交叉反应;但在变性且还原的条件下,Western blot结果显示无交叉反应.结论:自制亲和柱成本低、亲和性好、肝素结合稳定,用之分离纯化得到了高纯度apoH;兔多克隆抗体用于检测血清中载脂蛋白H含量时需进一步纯化.
