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亲和层析微柱法测定肝癌特异性AFP
目的建立一种方便、经济的方法检测血清中肝癌(HCC)特异性AFP(AFP-L3).方法用小扁豆凝集素(LCA)亲和层析柱分离血清中AFP-L3,放射免疫法测定AFP及AFP-L3.结果肝癌患者血清经LCA-Sepharose 4B亲和层析柱分离和含α-甲基-D-甘露糖苷的解吸液洗脱可得到AFP-L3.以AFP-L3在总AFP中所占百分比≥15%作为临界值,本法诊断HCC的敏感性为92.7%,特异性为88.2%.结论该法特异性强、敏感性高、重复性好,且方便、经济,为临床早期诊断肝癌的有用指标.
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KSHV ORF73C基因原核表达产物的纯化与免疫原性分析
目的纯化卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核抗原(LANA)羧基端编码基因ORF73C原核表达蛋白并分析其免疫原性.方法含重组质粒pGEX-6p-1+ORF73C(pORF73C)的宿主菌BL21经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.用glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化表达产物后,以重组3C蛋白酶对融合蛋白进行解离,SDS-PAGE对表达及纯化产物进行鉴定.以纯化的ORF73C蛋白免疫小鼠获得抗血清,建立ELISA检测其免疫原性.结果SDS-PAGE显示蛋白条带大小分别为49 000和23 000,与预期的ORF73C融合蛋白及ORF73C蛋白分子量大小一致;ELISA检测显示,抗ORF73C多抗免疫反应性高于未免疫小鼠血清2倍以上.结论成功获得了纯化的ORF73C蛋白,经ELISA显示其有较强免疫原性.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV) ORF73C 亲和层析 免疫原性 -
人血清甘露聚糖结合凝集素的提取与鉴定
人体中甘露聚糖结合凝集素(mannan binding lectin,MBL)存在的质量与某些感染性疾病和自身免疫病等易感性增加有关.为进行对MBL的实验和临床应用研究,我们从人血清中提取了MBL并以此制备了抗MBL单克隆抗体[1],报道如下.
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人血小板第4因子和P-选择素的纯化
目的用单克隆抗体亲和层析方法从人血小板破碎液中纯化血小板因子4和P-选择素.方法将单克隆抗体SZ-95-IgG和SZ-51-IgG分别与溴化氰活化的Sepharose4B凝胶连接成SZ-95-IgG-Sepharose4B和SZ-51-IgG-Sepharose4B亲层析柱,人血小板破碎液经此亲和层析柱上样后,再经FPLC系统获得的所要的产品,产品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度,用点杂交鉴定其生物学活性.结果 SZ-95-Sepharose4B和SZ-51-Sepharose4B亲和层析柱的偶联率分别72%和68%,每1ml(约1×109个血小板)血小板破碎液中可以纯化到18μgPF4和12μg P-selectin,所得产品经SDS-PAGE,在分子量约为12kD和140KD处各显单一的蛋白区带,经点杂交印迹显示产品分别与单抗SZ-95和SZ-51反应显带.结论用单克隆抗体亲和层析柱纯化的PF4和P-selectin产品得率高、纯度高、活性好.
关键词： 血小板因子4 P-selectin 单克隆抗体 亲和层析 -
沙眼衣原体E型MOMP基因原核表达载体的构建和纯化
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)共有19个血清型,其中D～K血清型则可通过性传播,引起人类泌尿生殖道感染,并可引起并发症.沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)携带Ct亚型等多种抗原决定簇,是诊断试剂和疫苗开发的基础.本研究选择MOMP基因作为研究对象,用PCR技术扩增E型沙眼衣原体MOMP基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pGEX中,构建重组表达质粒.然后将重组表达质粒转化人大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定.诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定,并以亲和层析柱纯化表达产物,为进一步研究该蛋白的生物学特性,了解衣原体的致病机制奠定基础.
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连续流层析在单抗亲和层析中的应用
亲和层析作为单克隆抗体分离纯化的关键步骤,其工艺设计对生产效率和成本具有重要影响.对比批次层析和连续流层析两种工艺模式,以期提高亲和层析填料的使用效率,降低生产成本.采用GE公司(A)KTA PCC设备,对比考察两款亲和层析介质在批次层析及连续流层析两种生产模式下产品的关键质量属性,如聚合物、降解物、电荷异构体、工艺杂质残留等,以及关键工艺属性,如回收率、生产效率、填料量等.连续流层析工艺稳定,纯化回收率与批次层析接近.此外,尽管多根层析柱串联上样,洗脱中间体产品关键质量属性无明显差异,但生产效率明显提高,填料用量显著减少.与批次层析工艺相比,连续流层析可显著减少亲和填料的用量,减少缓冲液的消耗,显著提高生产效率,降低生产成本.
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促血小板生成素模拟肽二联体连接肽的筛选
比较不同Linker连接的促血小板生成素模拟肽二联体(dTMP)的生物活性,筛选高生物活性dTMP的Linker设计.全基因合成4个dTMP基因,将片段克隆到pGEX-4T-1载体,构建重组表达载体pGEX-4T-1/dT-MP,筛选阳性目的克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),0.1 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白.超声细胞破碎仪破菌,Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析获得GST-dTMP融合蛋白,凝血酶酶切,再次亲和层析除去GST标签,收集目的dTMP肽片段,双荧光素酶法检测各目的肽片段的活性.通过实验,正确构建了4个不同的pGEX-4T-1/dTMP表达载体,经表达纯化得到了GST-dTMP融合蛋白,酶切后再次亲和层析纯化,并获得了相对分子质量与理论值3 920,3 640,3 610,3 430相符的4个dTMP肽片段,它们的活性大小依次为:dTMP-Linker3＞ dTMP-Linker4＞dTMP-Linker1＞dTMP-Linker2.实验发现,不同的连接肽显著影响dTMP肽片段的生物活性,该实验成功筛选到了活性较高的连接肽Linker3.
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HIV-1型gp41抗原蛋白在大肠杆菌无细胞体系中的表达和免疫反应性检测
HIV-1型gp41抗原蛋白在HIV初筛诊断中有重要应用.该研究合成了gp41全长基因序列,将其与pIVEX2.4c酶切连接构建表达载体,在大肠杆菌无细胞体系中实现了目标蛋白的全长可溶表达.考察了添加不同浓度非离子型去污剂Brij78对蛋白可溶性的影响,在0.2％ Brij78条件下,可溶性gp41重组蛋白的表达水平达到650μg/mL.Ni2亲和层析纯化目标蛋白,纯度达到95.6％;超滤浓缩后,蛋白浓度为0.9 mg/mL,总回收率为70.8％.免疫反应性检测结果显示该gp41重组抗原制备的乳胶HIV抗体诊断试纸能与不同滴度的HIV-1型阳性标本反应,在检测线位置出现红色条带,而与HIV-1型阴性标本无反应.该研究制备了具有完整氨基酸序列的HIV-1型gp41重组抗原,为进一步提高HIV抗体诊断试剂的质量打下了基础.
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谷胱甘肽双功能合成酶的克隆表达、酶学性质及其应用的研究
谷胱甘肽是广泛存在于生物体内的生物活性三肽化合物,因其具有重要的生理功能而在医药、食品、化妆品等行业有着广泛的应用,该研究克隆了来自Listeria monocytogenes的谷胱甘肽双功能酶基因gshF,以pET28a(+)作为表达载体,利用大肠杆菌实现重组表达,研究表明,重组菌于37℃培养4h后,在28℃下经0.2 mmol/L IPTG诱导表达,胞内酶活可达2 318 U/L.表达产物破胞、离心、亲和层析后,进一步考察了其酶学性质,表明该酶催化适温度37℃,适pH 8.5,还研究了Mg2+和ATP对其的影响以及该酶的稳定性.终通过GshF体外酶催化合成谷胱甘肽,得到的高产量为2.58 g/L.这些对该酶在谷胱甘肽生物合成上的应用有重要的借鉴作用.
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rhFGF-21的高效表达及其纯化工艺的优化
成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)是FGF家族的一员.现有研究表明,FGF-21是一种血糖调节因子,有望被开发成为治疗糖尿病的候选药物.本实验是在前期研究的基础上,对高效表达FGF-21基因的工程菌株进行接种、发酵、诱导表达,将表达产物纯化,PEG修饰提高其体内半衰期,通过改变反应体系的反应时间、反应温度、蛋白浓度和反应物之间的质量比优化修饰反应.阴离子交换层析纯化反应混合物,终得到纯度大于98％的活性FGF-21蛋白.
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重组大肠杆菌高效可溶性表达芳基硫磺基转移酶的研究
3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)是生物肝素酶法制备途径的硫磺基供体,价格高且易分解.芳基硫磺基转移酶(ASTIV,EC 2.8.2.1)可以转化对硝基硫酸苯酯(PNPS)和3'-磷酸腺苷-5'-磷酸(PAP)生成PAPS.利用大肠杆菌系统高效可溶性表达ASTIV.对鼠源ASTIV基因序列进行密码子优化并全合成;转入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达;对表达条件进行优化,提高可溶表达量;Ni2亲和层析纯化目标蛋白,重组ASTIV产量达到80 mg/L,纯度高达95.3％,比酶活为42.5 mU/mg;用碱性磷酸酶(CIAP)转化ASTIV构型,比酶活进一步提高到85.0 mU/mg.该研究为ASTIV重组表达,PAPS酶法制备以及生物肝素合成奠定了坚实的基础.
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小鼠腹水JWA单克隆抗体的制备鉴定
建立小鼠腹水中JWA单克隆抗体(Monoelonalantibody,mAb)的制备方法及鉴定,获得高纯度、高效价的JWA单克隆抗体.对预先用弗氏不完全佐剂处理的小鼠腹腔接种JWA单克隆抗体杂交瘤细胞,收集小鼠腹水、离心,采用Protien G亲和柱层析法进行亲和层析纯化JWA单克隆抗体,并采用SDS-PAGE检测方法分析纯化抗体的纯度.分别运用细胞免疫荧光、免疫印迹技术鉴定纯化的抗体特异性.BCA法测定纯化后JWA单抗的浓度为6.79 mg/mL;SDS-PAGE电泳显示纯化的抗体只有IgG的重链和轻链,而没有其它杂蛋白带;纯化后的JWA单抗在免疫荧光实验可以检测到细胞中JWA蛋白在胞浆中呈丝状均匀分布,与前期实验结果一致.免疫印迹实验中1∶800、1∶400均可以得到清晰的目的条带.用Protein G亲和层析法获得了高纯度和较高效价的JWA单克隆抗体,这将为JWA蛋白的基础和应用研究提供技术支持.
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抗人甲胎蛋白单链抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定
甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)是重要的肝癌诊断标记物,在肝癌的进展过程中扮演重要角色.构建具有免疫学活性的抗人AFP单链抗体,为进一步的研究奠定实验基础.采用RT-PCR技术,从分泌抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增mAb抗体可变区的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段.将ScFv片段亚克隆至质粒pET32a中,将重组质粒转染大肠杆菌BL21并IPTG诱导表达ScFv蛋白,利用肠激酶切除Trx标签后,经镍柱亲和层析获得蛋白,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到54.13％.
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重组人白介素21的原核表达与体外活性研究的优化
为了构建重组人白介素21(rhIL-21)原核稳定表达和体外活性检测系统,采用Overlap-PCR法合成目的基因;经双酶切整合至pET28,化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)构建pET-28a-rhIL-21 BL21 (DE3)原核表达系统;胞内表达的包涵体经镍亲和层析色谱柱纯化后,尿素缓冲液梯度透析复性,终溶于PBS缓冲液;双抗体夹心法ELISA、Western blotting检测复性蛋白的生物活性;细胞增殖抑制试验(MTT法)研究rhIL-21对Jurkat细胞株和HuT102细胞株的作用.实验成功建立了rhIL-21表达纯化与活性评价体系,为进一步研究IL-21的促免疫性疾病发展和抗肿瘤活性奠定了基础.
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抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体的高密度发酵与纯化
在发酵罐上采用高密度发酵的方法对抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体工程菌进行了培养,其发酵结果是每升发酵液的湿菌菌重150 g,OD550值达121;以免疫亲和层析的方法纯化抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体,经计算抗体产量可达146.6 mg/L;间接免疫荧光测定结果经流式细胞仪分析计算表明,抗CD3 ScFV/抗PgP ScFv双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合.
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一种鲨肝再生因子类似物的克隆表达及纯化
获得可溶性表达的鲨肝再生因子类似物,初步研究性质与活性.构建含有鲨肝再生因子类似物片段的原核表达载体pET 32a-S;转化BL21,IPTG诱导表达融合蛋白,表达产物经过分离纯化-FXa酶切-分离纯化,得到鲨肝再生因子类似物;利用MTT比色法研究该重组产物对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖活性.结果原核表达的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶的形式存在,表达量为40%,分子质量为30 ku,去除融合子后的鲨肝再生因子类似物分子质量为12kμ,PI=4.7.活性研究显示在6.25～50μg/ml浓度范围内,类似物与天然产物均有相似的刺激SMMC-7721细胞株增殖的活性,但是在高浓度下却表现出了抑制活性.
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传质模型在亲和层析中的应用
综述了传质模型的内容和其在下游分离纯化中的应用以及结合高通量筛选技术对传质模型研究方法的优化,重点介绍了传质模型包括吸附等温线模型和吸附动力学模型在亲和层析介质动态结合载量预测中的应用.与传统下游分离纯化工艺研发相比,采用传质模型,一方面能全面评估实验条件对层析工艺开发的影响,给工艺开发及优化提供新的思路,另一方面也能减少工艺开发时间和耗材用量达到降低工艺开发成本的目的.同时,高通量筛选技术在层析工艺开发中的大量推广也逐渐改变传统工艺开发流程,大大降低工艺开发成本.大量研究表明.通过研究吸附等温线和吸附动力学模型,能够对层析介质的静态吸附能力以及动力学行为进行描述,准确预测亲和层析中产品的穿透曲线和亲和层析介质的动态结合载量,与实验室规模层析柱上实验结果一致性好,有望广泛应用于下游纯化工艺参数的优化和探索中.
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免疫球蛋白结合结构域的研究进展
Z结构域,又叫免疫球蛋白结合结构域,是由金黄色葡萄球菌蛋白A( Staphylococal Protein A,SPA)中B结构域改构而成.SPA是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的能与多种哺乳动物的抗体相结合的天然蛋白,组成SPA的5个结构域中,以B结构域的抗体结合力及稳定性占绝对优势.将B结构域28～29位敏感性残基Asn-Gly定向诱变成为Asn-Ala后,得到的结构域被称为Z结构域,其稳定性更高,可耐受羟铵和溴化氢的处理.首尾相连的两个Z结构域,被命名为ZZ结构域,具有与SPA相类似的抗体结合容量以及更高的稳定性,可以耐受工业纯化中苛刻的环境.ZZ结构域以其独特的反3α螺旋结构、以及特有的抗体结合能力已广泛应用于外源蛋白的可溶表达及免疫检测、抗体纯化等领域.该文将对ZZ与抗体结合的机制研究以及它在各领域的应用研究进行综述.
关键词： 免疫球蛋白结合结构域 ZZ结构域 葡萄球菌蛋白A 亲和层析 -
应用仿生亲和层析从广东产舟山眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒中分离纯化镇痛多肽
摘要研究眼镜蛇毒镇痛组分的分离纯化方法,为寻找镇痛效果好,而无成瘾性的新型镇痛药物,在合成出可用于亲和吸附眼镜蛇毒心脏毒素层析介质的基础上,结合阳离子交换UND SphereTM S,凝胶过滤Sehpadex G-50,疏水层析Phenyl SepharoseTM CL-4B,从广东产舟山艮镜蛇毒中分离出镇痛多肽.此外,将凝胶过滤Sehpadex G-50应用于仿生亲和层析之前检测分离效果.得出在一步仿生亲和层析后,用疏水层析的方法分离效果更佳,仿生亲和层析适于第一步分离.
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单克隆抗体亲和层析法纯化namalva细胞干扰素
采用自行研制的α干扰素单克隆抗体亲和层析胶3D9进行了Namalva细胞干扰素纯化的初步研究.结果表明:α干扰素纯化活性回收率达96%,比活性达1×108IU/mg,一次亲和层析纯化倍数4.4×104.电泳及Westem blot结果显示相对分子质量在2.1×103.
