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不同偶联模式的兴奋性氨基酸受体所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的相互影响
目的 研究不同偶联模式的兴奋性氨基酸受体所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的相互影响.方法 用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA,以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离出mRNA并注射入非洲爪蟾卵母细胞使表达,通过全细胞双电极电压钳位法,分别以M-胆碱受体Carb,谷氨酸离子型受体激动剂kainate(KA),代谢Ⅰ型受体激动剂quisqualate(QA)及代谢Ⅲ型受体激动剂L-phosphoserine(L-SOP)两两同时灌流有受体表达的非洲爪蟾卵母细胞.结果 3种偶联模式的受体激动后产生的膜电流具有交叉脱敏现象.结论 在多种受体共存的细胞中,受体之间可能存在着广泛的相互作用.
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乙酰唑胺对表达水孔蛋白1的非洲爪蟾卵母细胞转运水功能的影响
目的观察乙酰唑胺对水孔蛋白1(AQP1)水转运功能的影响.方法将AQP1 cRNA 10 ng注射入非洲爪蟾卵母细胞,观察并记录给予1×10-7～1×10-5 mol*L-1乙酰唑胺后卵母细胞在低渗溶液中的膨胀率,并计算其渗透水通透性(Pf)的变化.结果非洲爪蟾卵母细胞表达AQP1蛋白后,在低渗溶液中迅速膨胀,Pf值显著增加至1.82×10-2 cm*s-1,而注射水的阴性对照仅为0.25×10-2 cm*s-1.AQP抑制剂HgCl2使Pf值降至0.64×10-2 cm*s-1;1×10-7～1×10-5 mol*L-1乙酰唑胺处理后,Pf值分别降至1.43,1.24和0.93×10-2 cm*s-1.结论乙酰唑胺剂量依赖性地降低AQP1介导的渗透水通透性,抑制AQP1转运水的功能.
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α-芋螺毒素TxIB异构体对大鼠和人类α6/α3β2β3乙酰胆碱受体的拮抗活性研究
目的 研究α-芋螺毒素TxIB 3个二硫键异构体对大鼠和人类α6/α3β2β3乙酰胆碱受体(nAChRs)的拮抗活性.方法 采用Fmoc固相合成法,分别合成TxIB的3个二硫键异构体.利用非洲爪蟾卵母细胞分别表达大鼠和人类的α6/α3 β2 β3nAChRs,分别测定3个异构体对它们的拮抗活性.结果 成功合成了TxIB的3个二硫键异构体,并通过超高效液相色谱(UPLC)与基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱进行了鉴定,且为正确.α-芋螺毒素TxIB的3个二硫键异构体在UPLC的洗脱出峰时间差异明显,其亲水性顺序分别为球状异构体(globular)＞带状异构体(ribbon)＞珠子状异构体(bead).质谱鉴定它们的相对分子质量完全一样,且与理论相对分子质量一致.大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs在非洲爪蟾卵母细胞中获得了有效表达,并用该技术体系测知了TxIB的3个二硫键异构体的拮抗活性.其中,TxIB的球状异构体活性强,对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs的拮抗活性极其相似,其半抑制浓度(IC50)分别为28.2与32.0 nmol·L-1.而带状异构体和珠子状异构体对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs几乎没有拮抗活性,其IC50＞ 10 μmol·L-1.结论 本实验人工合成的TxIB球状异构体对大鼠与人类α6/α3β2β3 nAChRs具有高选择性强拮抗活性,这为后续TxIB新药研发提供了研究基础.
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非洲爪蟾卵母细胞P2X受体存在的证明
目的:D1中除有P2Y受体介导的成分外,可能还有P2X受体介导的电流参与.本研究的目的在于进一步证实D1电流中是否有P2X受体介导电流的存在.方法:采用双电极电压钳记录方法.结果:Zn2+对不依赖于G蛋白之IATP(D1)具有增强作用;重复施加ATPD1电流逐步减小,而D2电流则逐步增大.在仅有D2之IATP(D2)情况下,重复加ATP后D2电流不但不增大反而有所下降.结论:非洲爪蟾卵母细胞上存在P2X受体.
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兴奋性氨基酸受体所介导细胞钙电流特征及其中L-SOP的作用途径
目的:研究兴奋性氨基酸受体各亚型所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的特征及其中Ⅲ型受体激动剂L-SOP的作用途径.方法:用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA,以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离出mRNA并注射入非洲爪蟾卵母细胞使表达,以全细胞双电极电压钳位法灌流此卵母细胞.结果:100 μM KA(kainate)(离子型)产生一主峰电流后缓慢下行,成为一稳定电流平台,终脱敏,脱敏时间平均为37.57 min.2 μM QA(quisqualate)(代谢Ⅰ型)产生一峰值电流后转为一持续性钙振荡或直接出现钙振荡,振荡维持时间为(6.72±1.33)min,脱敏时间均随激动剂浓度的增加而缩短.0.8 mM L-SOP(L-phosphoserine)(代谢Ⅲ型)灌流产生规律性电流振荡,振荡时间为(20.17±8.47)min.此振荡电流可被代谢Ⅰ型受体拮抗剂L-AP3所拮抗.结论:离子型、代谢Ⅰ型及代谢Ⅲ型受体均产生各自特征电流模型;L-SOP不仅是Ⅲ型受体的激动剂,而且是Ⅰ型受体的弱的激动剂,即细胞振荡电流是L-SOP通过Ⅰ型受体的作用途径而产生.
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肌肉型乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达
建立肌肉型乙酰胆碱受体(胎儿型α1β1δγ和成年型α1β1δε)在非洲爪蟾卵母细胞中的表达模型,用于以这两种受体为靶点的药物筛选.将肌肉型乙酰胆碱受体的各个亚基基因在体外转录获得各自的cRNA,显微注射到非洲爪蟾卵母细胞中,利用双电极电压钳技术检测其表达情况,并确定不同浓度的乙酰胆碱对胎儿型α1β1δγ和成年型α1β1δε受体电流表达情况的影响.在卵母细胞中成功表达两种肌肉型乙酰胆碱受体;当乙酰胆碱浓度为1 μmol/L时,α1β1δγ和α1β1δ￡受体电流很小,不能用于后续的检测试验,当浓度为5μmol/L时,完全激活α1β1δγ受体的开放电流达到大6025 nA,当浓度为20μmol/L时,完全激活α1β1δε受体的开放电流达到大2 742 nA,只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生.该受体模型的成功建立,为筛选作用于肌肉型乙酰胆碱受体的药物提供了实验模型.
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α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达
建立以哺乳动物α3β4乙酰胆碱受体(nAChR)为分子靶标的药物筛选模型.将大鼠乙酰胆碱受体的α3与β4亚基基因分别进行体外转录,获得α3与β4亚基基因的cRNA,按1:1的比例将适量α3与β4的cRNA 混合后,显微注射到新鲜分离的非洲爪蟾卵母细胞中,在ND96溶液中、17℃下培养24 h后,通过双电极电压钳技术(TEVC)检测受体α3β4nAChR的乙酰胆碱(Ach)门控电流.同时注入α3、β4cRNA的非洲爪蟾卵母细胞孵育24h后,可记录到明显的Ach门控内向电流,未注射或只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生.α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,以此为药物作用靶点,可用于大量生物毒素等物质的活性筛选实验模型.
关键词： α3β4乙酰胆碱受体 双电极电压钳 非洲爪蟾卵母细胞 药物筛选模型 -
表达的辣椒素受体对甲醛刺激的反应
目的:验证Nielsen假设的正确性. 方法:体外转录辣椒素受体(VRI)cDNA,获得CRmRNA,注入非洲爪蟾卵母细胞,异源性表达VRI .用甲醛刺激异源性表达的VRI.用双电极电压钳记录. 结果:实验组有3个细胞对激动剂辣椒素(capsaicin 10-7mol/L)有反应,并且VRI拮抗剂(capsazepine 10-5mol/L)能完全阻断此内向电流. 结论:表达的VRI对甲醛刺激发生反应.验证了Nielsen假设的正确性.
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非洲爪蟾卵非细胞翻译体系的建立及应用
目的当前人类基因组研究的重心正在由"结构"向"功能"转移.而基因功能的研究离不开基因的表达,这就迫切需要一种操作简便,适用范围广的表达工具来表达有功能的蛋白质.方法非洲爪蟾注射HCG催卵,2%半胱氨酸去胶膜,高速离心制备卵提取物,即为非洲爪蟾卵非细胞翻译体系.通过亚克隆技术将TFAR19基因克隆到体外转录质粒中,通过酶切线性化模板,体外转录,加帽合成cRNA,将其加入到制备的蛙卵提取物中进行体外翻译.结果用Western blot鉴定,获得了高效翻译,并且加入亚精胺和ATP再生系统可以提高翻译的效率.结论非洲爪蟾卵非细胞翻译体系为表达有功能的蛋白提供了一种极有应用前景的表达工具.
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Kir2.1/ Kir2.3嵌合体的构建与表达
目的 构建Kir2.1/ Kir2.3通道嵌合体,为进一步研究Kir2.1和Kir2.3通道的调控机制打下基础.方法 利用重叠延伸PCR方法构建不同的Kir2.1/ Kir2.3嵌合体质粒:N1P3C3,N3P1C1,N3P3C1,N1P1C3,NIP3C1,N3P1C3.将不同的嵌合体质粒分别用NheI线性化后,转录为cRNA表达于非洲爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳记录电流.结果 不同的Kir2.1/ Kir2.3嵌合体质粒构建成功,在非洲爪蟾卵母细胞上可以记录到电流表达.结论 成功构建Kir2.1/ Kir2.3嵌合体并完成了嵌合体通道的异源性表达和电压钳记录.
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稳心颗粒对人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道2电生理特性的影响
目的探讨稳心颗粒对人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道2(HCN2)电生理特性的影响.方法将人HCN2的mRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞,孵育1～2天后,采用双电极电压钳技术观察0.5,1,2,4g/L稳心颗粒对HCN2通道电流的作用.结果①测试电位-90 mV时,0.5,1,2,4g/L稳心颗粒分别使HCN2瞬时电流增加17.74%±6.04%,49.26%±8.74%,86.05%±16.15%和124.38%±11.62%,瞬时电流增加50%的药物浓度(EC50)为1.54±0.24g/L(n=8).②在测试电位-140 mV到-100 mV水平上,2g/L稳心颗粒延长HCN2通道激活时间常数:(226.74±31.37 ms vs 143.68±21.45 ms;-140 mV,n=10,P＜0.05)③2g/L稳心颗粒延长HCN2通道去激活时间常数(1 293.54±95.03ms vs 647.13±61.36 ms;-140 mV,n=10,P＜0.05).结论稳心颗粒呈浓度依赖性增强HCN2瞬时电流,减缓通道激活和去激活过程.
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非洲爪蟾卵母细胞内源性及外源性ATP和GABA受体介导的膜反应比较
目的:对非洲爪蟾卵母细胞表达的ATP和GABA激活电流进行比较.方法:包括mRNA和cDNA的提取、卵母细胞的微量注射及双电极电压钳技术.结果:①在表达P2X2或P2X4的卵母细胞上,外加ATP可分别诱导一被Zn2+增强的内向电流.②在表达鸡脑mRNA的卵母细胞上,可记录到GABA激活电流,且此电流可被bicuculline(一种GABAA受体选择拮抗剂)所阻断.③在表达了人视网膜ρ1亚基cRNA的卵母细胞上,外加GABA可引起一不被bicuculline阻断的内向电流,后者可被I4AA(一种GABAC受体特异性拮抗剂)阻断.④在具有滤泡膜的卵母细胞上可记录到3种形式的ATP激活电流和一外向的慢的GABA激活电流.⑤在除去滤泡膜的卵母细胞上均未记录到ATP和GABA激活电流.结论:卵母细胞上存在内源性的嘌呤受体、GABAB和GABAC受体;且此内源性受体存在于滤泡膜上;P2X2、P2X4嘌呤受体及GABAA和GABAC受体均可在卵母细胞上表达,表达的受体所介导的激活电流与内源性受体介导的激活电流有明显区别.
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双(7)-他克林对非洲爪蟾卵母细胞表达的Kv4.2和Kv1.2编码钾通道的作用
目的 用非洲爪蟾卵母细胞表达之Kv4.2和Kv1.2编码的快和慢钾通道,检验双(7)-他克林对此两种通道是否有抑制作用.方法 应用爪蟾卵母细胞注射mRNA进行表达,电压钳记录Kv4.2和Kv1.2钾电流(IK).结果 双(7)-他克林抑制IK(Kv4.2)和IK(Kv1.2)的IC50值分别为(0.23±0.05)μmol/L和(0.24±0.06)μmol/L.结论 此种抑制效应可能与在双(7)-他克林作用下表达的Kv4.2和Kv1.2钾通道激活曲线向超极化电压方向偏移有关.
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大鼠背根神经节神经元瞬时外向钾电流与非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv4.2通道电流特性的比较
目的 为终揭示大鼠背根神经节神经元上天然瞬时外向钾通道的结构与功能调节提供依据.方法 采用双极电压钳技术记录非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv4.2电流,用全细胞膜片钳技术记录大鼠背根神经节神经元上瞬间外向钾电流(IA),并对二者进行动力学特征的比较.结果 背根神经节神经元上IA和Kv4.2通道电流①均具有明显的A型电流特征;②半数大激活电位分别为(-29.5±3.1) mV和(-3.9±1.0) mV;③半数大失活电位分别为(-78.5±3.4) mV和(-48.5±0.6) mV;④失活后再激活恢复时间常数(τ)分别为(32.0±4.8) ms和(71.4±13.2) ms.结论 Kv4.2通道电流可能是背根神经节神经元上IA电流的主要成分, 但不是唯一成分.
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非洲爪蟾卵母细胞上内源性ATP及GABA激活电流的比较
实验用双电极电压钳技术在具有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上记录三磷酸腺苷(ATP)与γ-氨基丁酸(GABA)激活电流.并对两者进行了比较.结果显示,在不同的非洲爪蟾卵母细胞上,ATP和GABA受体分布的种类和数目不同;且ATP和GABA激活电流均与K+通道有关.
