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用于肠道病毒71型灭活疫苗纯度分析的毛细管区带电泳法研究
目的:建立毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)方法,用于肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗纯度检测及分析.方法:以样品检测峰高度、分离度、信噪比为判断标准,对不同运行缓冲液、样品缓冲液、毛细管长度、上样时间等进行选择优化,确定毛细管区带电泳条件,同时采用HPLC法分离及免疫共沉淀法对各样品检测峰进行鉴定.利用建立的CZE方法对7批EV71灭活疫苗原液进行检测,采用面积归一法,计算疫苗原液纯度.结果:当运行缓冲液为pH 8.2硼酸缓冲体系、盐浓度为150 mmol· L-1、SDS浓度为10 mmol· L-1时,上样时间为100 s、毛细管有效长度为50 cm时,主检测峰高度高、信噪比优和分离度大于1.5.以含SDS 10 mmol·L-1的150 mmol·L-1 pH8.2硼酸盐缓冲液为运行缓冲液,5 mmol·L-硼酸盐缓冲液为上样缓冲液,以长50 cm、内径为50 μm的无涂层石英毛细管作为色谱分离柱,对EV71灭活疫苗原液纯度进行检测,可见2个样品检测峰,经HPLC法及免疫共沉淀法鉴定,样品检测峰1为EV71病毒颗粒,迁移时间6.98 min、样品检测峰2为杂质,迁移时间8.42 min;连续进样6次,2个样品检测峰的峰面积、峰起时间、峰止时间和保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均＜2.0％.应用该方法对7批EV71灭活疫苗原液纯度进行检测,为95.3％ ～99.4％,均大于95％.结论:初步建立了可用于EV71灭活疫苗原液纯度测定的毛细管区带电泳方法,为该疫苗的质量研究、工艺过程控制及稳定性研究奠定了基础.
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重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂(rExendin-4)原液质量研究
目的:对重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂(rExendin-4)原液进行质量研究.方法:采用紫外光谱、肽图、飞行时间质谱及N端氨基酸序列分析对rExendin-4原液进行结构确证;采用凯氏定氮法、BCA法及氨基酸分析法测定rExendin-4原液的蛋白含量,建立高效液相色谱法测定原液纯度,通过纯度校正计算原液中rExendin-4含量.结果:确证了rExendin-4原液的结构,测得原液含量为2.21 mg·mL-1.结论:本研究所用的rExendin-4原液结构正确、测定含量结果准确可靠,可作为HPLC外标法含量测定用对照品,用于rExendin-4同质对照品的赋值,也可作为理化对照品用于rExendin-4工艺中间体的评价和原液放行检验.
关键词： rExendin-4原液 结构确证 含量测定 纯度测定 -
注射用糜蛋白酶的比活与纯度研究
目的 分别建立一种适用于注射用糜蛋白酶比活测定的方法以及RP-HPLC纯度测定方法.方法 采用凯氏定氮法测定注射用糜蛋白酶中的总蛋白质含量,再结合效价计算出比活.纯度采用Grace 214TP C4色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以0.1％三氟乙酸水溶液和0.09％三氟乙酸乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速1.0ml/min,检测波长214nm,柱温30℃.由凯氏定氮法得到的比活结果与采用RP-HPLC法测得的纯度结果呈显著正相关(r=0.940,P＜0.01,n=5).结果 两种方法重复性、精密度和加样回收率均良好,可用于注射用糜蛋白的质控.结论 对于多组分的生化药物,在主成分能与杂质分离的情况下,可采用纯度法来控制投料质量,而对于成分复杂者,则可考虑用比活代替纯度来进行质量控制.
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亚硝酸钠纯度的测定及其不确定度的评定
目的:对半自动生化分析仪检定用杂散光标准物质所用溶质--亚硝酸钠的纯度进行测试.方法:采用滴定法对亚硝酸钠的纯度进行测定,对所测纯度的不确定度进行评定,并用平行试验对所评定的亚硝酸钠纯度不确定度进行验证.结果:亚硝酸钠的纯度为99.81%,不确定度为0.86%.结论:纯度的不确定度通过了验证,说明纯度测试是可靠的,其不确定度的评定是合理的.
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药物中杂质对照品的标定项目与纯度测定方法研究进展
药物中的杂质是否能被全面准确地控制,直接关系到药品的质量可控与安全性.《中国药典》多采用主成分自身对照法规定有关物质的限度,而国外药典中多用到杂质对照品进行检测,这也就要求杂质对照品符合一定的质量标准后方可使用.对照品的标定中常涉及的项目包括纯度测定、结构确证、含量测定等,考虑到杂质对照品的微量性,标定时选择合适的分析方法十分重要,如进行纯度测定可使用高效液相色谱法、差示扫描量热法等试样用量少的分析仪器.
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差示扫描量热法测定7种药物纯度
目的用差示扫描量热(DSC)法测定药物纯度及探讨影响测定结果的因素.方法用DSC法测定吲哚美辛等7种不同类别药物的纯度,并与<中国药典>规定方法结果进行对照.结果 DSC法测定药物纯度的准确性好;试药的用量、纯度、升温速度对测定结果产生影响.结论本法测定高纯度药物简便、结果准确.
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氢化黄原素的质量标准研究
目的 建立氢化黄原素质量标准.方法 采用高效液相色谱法(HPLC)测定纯度,采用薄层色谱法(TLC)进行鉴别；并对干燥失重和灼烧残渣进行限度控制.结果 氢化黄原素的TLC斑点清晰,专属性强；HPLC主峰与相邻杂质分离度＞1.5,主峰的重现性、日内精密度分别为0.72％,1.04％；干燥失重不超过3％,灼烧残渣不超过0.5％.结论 所建立的方法专属性好,操作方便,重现性好,结果可靠,可用于氢化黄原素的质量控制.
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饮用水中5种典型挥发性卤代烃标准样品研制
饮用水中挥发性卤代烃是由天然水中的腐殖质与消毒剂共同作用产生,水源水受到工业或医药废水的污染时,也可导致饮用水中挥发性卤代烃的增加[1-2].三卤甲烷(三氯甲烷、二氯一溴甲烷、一氯二溴甲烷、三溴甲烷)和四氯化碳具有致畸、致癌、致突变性[3-4],且难以进行微生物降解和光化学降解,可通过呼吸、皮肤接触或饮水进入人体,对人体健康造成危害[5].三卤甲烷和四氯化碳等挥发性卤代烃是自来水中常见和出现频率较高的污染物[6],并开展相关检测方法研究[7-9].我国《生活饮用水卫生标准》将其列为监测指标[10],其标准限值分别为三氯甲烷(0.06 mg/L)、四氯化碳(0.002 mg/L)、三氯乙烯(0.07 mg/L)、四氯乙烯(0.04 mg/L)、一氯二溴甲烷(0.1 mg/L)、二氯一溴甲烷(0.06 mg/L)和三溴甲烷(0.1 mg/L).目前,国内外均有分析校准标准样品,但是还没有三卤甲烷和四氯化碳混合的质量控制标准样品.为了满足我国饮用水中典型挥发性卤代烃的监测和质量控制工作的迫切需要,开展饮用水中5种典型挥发性卤代烃质量控制标准样品研制十分重要.
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薄层扫描在人血白蛋白纯度测定中的应用
人血白蛋白是从健康人血浆中提取的药用白蛋白,主要用于治疗因失血、创伤及烧伤等引起的休克、脑水肿及大脑损伤所致的脑压增高.该制品的纯度测定,在<中华人民共和国生物制品规程>中,采用电泳后用NaOH溶液洗脱,分光光度法测定,繁琐费时.本实验采用电泳薄层扫描法测定,归一化法计算白蛋白纯度,结果证明此法具有操作简便、迅速、准确等优点,实测数据与规程法比较,结果一致,且稳定性、重现性较好.
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高效液相色谱法对新型吡啶类活性物质XY-4的纯度测定
目的 建立新型吡唑[3,4-b]吡啶类活性物质XY-4的高效液相色谱法测定含量的方法.方法 采用高效液相色谱法,以Phenomenex Gemini 5μm C18110(4.6 mm×250 mm,5μm)为色谱柱,甲醇-水(75:25)为流动相,流速1 ml/min,柱温30℃;检测波长为230 nm.结果 XY-4的量在20～100μg/ml的浓度范围内与峰面积积分值线性关系良好(r=0.9999),平均加样回收率为97.6％,RSD为1.45％.结论 该方法简便易行,准确可靠,可用于指导XY-4的合成.
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差示扫描量热法测定肌醇纯度
目的:使用差示扫描量热法(DSC)对肌醇纯度进行测定.方法:使用密封式铝坩埚封装样品,测定的佳条件为升温速率约1 ℃*min-1,样品量约2.5 mg,氮气流速为20～40 mL*min-1.结果:纯度测定的RSD为0.02%,通过F检验及t检验,该方法与药典法无显著差异.结论:该方法简便、快速、准确,适合肌醇产品的定量测定.
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蛇毒血凝酶纯度分析方法研究
目的:建立蛇毒血凝酶纯度测定方法.方法:分别采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和等电聚焦法(IEF),对凝胶考染并扫描；采用体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC),使用TSK G3000SW(7.8 mm×300 mm)凝胶柱,流动相为55mmol·L-1柠檬酸钠-0.01％ Tween 80溶液；流速0.5 mL·min-1,检测波长280 nm；采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),使用C8 Vydac(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为0.1％三氟乙酸溶液(A)-含0.1％三氟乙酸的90％乙腈(B),梯度洗脱,流速0.8 mL·min-1,；柱温为45℃,检测波长:280 nm.结果:4种方法测得蛇毒血凝酶的纯度分别为89.3％,88.5％,95.4％,87.4％.结论:对于蛇毒血凝酶纯度测定,非还原SDS-PAGE、IEF及RP-HPLC法均可准确地反映其样品纯度.
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毛细管区带电泳法测定艾塞那肽纯度及在稳定性研究中的应用
目的:建立毛细管区带电泳(CZE)方法测定艾塞那肽纯度,并初步考察其稳定性.方法:采用未涂层熔融石英毛细管(48.5 cm× 50 μm,有效长度40 cm),考察了运行缓冲液pH及浓度、分离电压、温度、添加剂乙腈浓度对分离效果的影响,终确立电泳条件:运行缓冲液为200 mmol·L-1磷酸二氢钠-磷酸氢二钠溶液(pH 6.2;含15％乙腈),分离电压为20 kV,温度25℃,检测波长214 nmm,压力进样5 kPa× 10 s.结果:艾塞那肽质量浓度在0.05 ～4.0 mg ·mL-1(r =0.999 9)范围内线性关系良好;检测限为3.3 μg·mL-1,定量限为8.0μg·mL-1;主峰迁移时间的日内和日间RSD分别为1.07％(n=6)和0.91％(n-9),纯度的日内和日间RSD分别为0.08％(n=6)和0.10％(n=9).该方法与HPLC法比较,纯度测定结果基本一致,本法分离效果更好,分析时间缩短,能有效检查艾塞那肽的纯度.结论:该方法可用于艾塞那肽的质量控制和稳定性研究.
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PEG化重组人促红素质量控制方法和标准研究
目的:建立PEG化重组人促红素质量控制方法和质量标准.方法:用正常小鼠网织红细胞计数法测定体内生物学活性,使用iCE毛细管等电聚焦电泳分析异构体,用离子色谱确定N-糖链指纹图谱,反相HPLC进行Lys -C蛋白内切酶酶切的肽图分析以及纯度测定.其余检测项目按2010年版中国药典三部方法进行.结果:建立的方法经过比较和对PEG化重组人促红素的检测,结果稳定可靠,重复性好,各指标符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2010年版中国药典三部的要求.结论:本研究建立了一套完善的PEG化重组人促红素质量控制体系.
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注射用绒促性素中纯度测定方法的研究
目的:建立了分子排阻法测定注射用绒促性素中纯度的方法,并在2010年度国家药品质量评价性抽验工作中,按照所建方法对国产注射用绒促性素进行了测定和评价.方法:采用两根TSK G3000SWXL凝胶色谱柱(7.8 mm ×300 mm,5μm)串联,预柱为TSK SWXL(6.0 mm ×40 mm,5μm),以0.05 mol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.0) -乙腈(80∶ 20)为流动相,流速0.6 mL·min-1,检测波长214 nm,面积归一化法定量.结果:卵泡刺激素(FSH)和绒促性素(HCG)分离完全,各辅料均无干扰,绒促性素的效价比活和纯度呈正相关.目前法定检验标准中无此检查项,76批样品全部合格,没有发现问题；若按本法进行纯度检查,则样品的不合格率显著增加.结论:本法具有较高的选择性,结果稳定、准确可靠,通过测定绒促性素的纯度可达到监控制剂生产过程中所使用原料的效价比活的目的.在此次专项抽验中发现现行标准存在缺陷,仍有待进一步提高,可采用专属性较强的仪器分析法如分子排阻法检查该品种的纯度或进行鉴别.
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抗体偶联药物抗HER2单抗-MCC-DM1质控方法的建立
目的:建立抗体偶联药物(ADC)抗人表皮生长因子受体-2(HER2)单抗-马来酰亚胺基-环己烷-1-羧化物(MCC)-美登素衍生物(DMn)(trastuzumab-DM1,T-DM1)的质控方法.方法:利用人乳腺癌BT-474细胞增殖抑制实验测定T-DM1的生物学活性;利用生物分子间相互作用分析核心技术(biomolecular interaction analysis core-technology,BIAcore)测定其结合常数(KD);利用HER2抗原和抗DM1抗体双夹心酶联免疫法(ELISA)对T-DM1进行鉴别;利用液质联用法和紫外分光光度法测定药物抗体偶联比(DAR);利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定游离药物DM1的含量;利用十二烷基磺酸钠-毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)和分子排阻色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;利用成像毛细管等点聚焦电泳(iCIEF)分析电荷异质性,其他各项指标均符合现行版中国药典的要求及其他相关要求.结果:T-DM1 生物学活性相对效价为(94.04±2.60)％,KD为(1.03±0.02) E-9 mol·L-1,RSD均小于5％;ELISA鉴别为阳性;液质联用法和紫外分光光度法测得的DAR分别为3.21及3.25;RP-HPLC法测定游离药物DM1的含量为(0.822 2±0.050 5)％,RSD小于10％;非还原CE-SDS主峰面积为(96.63±0.07)％,RSD为0.07％;SE-HPLC主峰面积为(97.65±0.005 8)％,RSD为0.005 8％;iCIEF分析可以将每个偶联数的抗体药物分开,达到很好的鉴别.结论:建立ADC中T-DM1质控方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国ADC的质量检测提供了参考依据.
