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人衰老相关DNA片段的筛选及特征分析
目的:探索衰老相关新基因.方法:采用RAPD法筛选衰老相关的DNA片段,采用Southern blot 分析基因状态,Northern blot 分析mRNA水平.结果:筛选出衰老特异的DNA片段,长894 bp,命名为sad.将sad片段克隆、测序,查询GenBank,确认为一种新的衰老相关序列,基因登录号为AQ324104.Southern blot分析表明,sad基因可能是一种单拷贝基因;sad在衰老2BS细胞中的Southern blot图谱不同于年轻细胞,而与人胃癌细胞系BGC-823类似.Northern blot分析显示,sad基因具有表达活性,其RNA长约0.5 kb,相对水平在各代龄的细胞间差异无显著性.结论:sad是一种新的与衰老相关的DNA片段,sad基因可能为单拷贝基因,具有表达活性.
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人体基因治疗用VEGF质粒DNA的纯化与质控
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是特异性促进血管内皮细胞增殖的多肽生长因子.本文对用于基因治疗的人VEGF121真核表达质粒进行了批量纯化技术路线的研究,并率先在国内建立了人体基因治疗用表达质粒的质控指标.通过QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit提取的pcD2/VEGF121质粒DNA,纯度好,超螺旋比例高,可直接用于基因治疗,动物实验已取得良好的效果.
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外周血DNA提取方法及其特点
为适应临床检验工作的需要,介绍几种外周血提取DNA的常用方法及其各自特点.全血酸性柠檬酸葡萄糖溶液B抗凝后,进行有核细胞分离,离心去上清,得到白细胞沉淀物,用于外周血DNA的提取.经典酚/氯仿提取法,可有效去除蛋白质及色素等物质,使DNA达到较高的纯度,但自行配制饱和酚费时耗力,而在市场上购买的饱和酚大多达不到pH 8.0,根据相似相溶原理,酸性酚会使DNA溶于其中,降低提取量,此外沉淀DNA时需要一价阳离子的参与.盐析法提取DNA可不用饱和酚,费用低,且沉淀DNA时不需加一价阳离子,目前多数实验均采用此法.碘化钾法提取DNA步骤少且时间短,DNA获得率较高,所用试剂价格便宜、性质稳定,不需特殊实验条件及蛋白酶K.煮沸裂解法提取DNA,可导致上清液中模板核酸量减少、抑制扩增效率,实验室除做一些感染性的指标外很少采用此方法.就实验本身而言,需根据实际情况合理选择提取方法,以节省时间和经费,顺利完成实验.
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两种微量DNA提取方法的比较
目的:比较Promega Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(PWGDPK)和国产星普液体微量DNA提取试剂盒(SLDPK)提取DNA的效果,探讨从冷冻保存的人外周血中提取基因组DNA的佳方案.方法:采用反复冻融3次并在-20℃冻存1年的12例健康成人外周血样品,分别应用两种试剂盒提取基因组DNA,并采用吸收光谱法、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增等方法分别对提取的基因组DNA进行对比鉴定.结果:PWGDPK提取的DNA浓度为15.0～130.0 mg·L-1[(74.8±39.3)mg·L-1],而SLDPK为15.5～37.0 mg·L-1[(26.6±6.2)mg·L-1],前者显著高于后者(t=4.119,df=11,P＜0.005).但两种试剂盒提取的基因组DNA纯度都不高,大多数样品A260/A280比值偏离了1.8～2.0范围.PWGDPK提取的12个基因组DNA样品,琼脂糖凝胶电泳后都可见电泳带,9个条带较深,3个条带较浅.SLDPK提取的样品中,只有7个可见较浅的电泳带.应用两种试剂盒提取的12个基因组DNA样品作为模板进行PCR反应后,在rs1171558SNP位点均有11个样品(91.7%)获得目的片段;在rs2248745 SNP位点,应用SLDPK只有4个样品(33.3%)获得目的片段,应用PWGDPK有10个样品(83.3%)获得目的片段,后者明显优于前者.结论:PWGDPK比SLDPK更适合于从长期冷冻保存且反复冻融过的全血中提取基因组DNA.
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DNA自动测序中的常见影响因素及测序反应体系的优化
目的:分析和研究DNA测序过程中影响因素及其测序反应体系的优化.方法:对DNA测序体系中模板、引物、测序产物的纯化及3种测序反应体系对测序结果的影响进行比较.结果:采用5 μL(含1 μL TRR)、5 μL(含2 μL TRR)和10 μL(含4 μL TRR)测序反应体系对同一质粒DNA进行测序,其可判读序列都能达到720 bp以上.结论:DNA自动测序的质量与模板的纯度、浓度、所用引物、测序反应体系及测序反应产物的纯化有直接的关系.采用5 μL(含1 μL TRR)测序反应体系在保证测序质量的同时可降低DNA测序成本.
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提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究
目的:确定从石蜡包埋组织中提取DNA的佳条件.方法:改变石蜡切片厚度、组织脱蜡时间、消化液蛋白酶K浓度、组织消化时间等参数,组合出96种不同提取DNA的条件,比较各种条件下所提取DNA的数量和质量.结果:各种条件均可以提取出一定数量的DNA,但有些条件所提取的DNA不适合于做PCR及DNA 序列测定.结论:从石蜡包埋组织中提取DNA的佳条件为,10.0 μm组织切片;切片脱蜡2次,脱蜡时间分别为2 h和12 h;消化液中蛋白酶K浓度500 mg*L-1;组织消化12 h.
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磁珠法半自动提取全血基因组DNA条件的优化
目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案.方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度.采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响.结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P＜0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80％时,DNA平均浓度高.磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013).当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μ1时,OD260/OD280的比值较好.磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P＜0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80％时,OD260/OD230的比值更好.结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80％的提取条件；而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得优DNA提取效果.
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三种不同DNA提取法对血链球菌随意引物PCR鉴定影响的研究
目的:研究不同DNA提取法对随意引物聚合酶链反应(AP-PCR)鉴定血链球菌的影响.方法:采用3种DNA提取法,利用25碱基引物5′AAG AGA GGA GCT AGC TCT TCT TGG A 3′对不同菌种的血链球菌DNA进行AP-PCR.结果:不同菌种的血链球菌DNA经AP-PCR扩增后产生不同的DNA片段;用不同方法提取同种血链球菌DNA可以得到相同的DNA片段.结论:不同DNA提取法不影响鉴定结果.
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真核细胞基因组DNA的制备
介绍本实验室常用基因组DNA的提取方法:对来源于培养的细胞或血细胞,一般采用蛋白酶K和去垢剂温和破碎的方法,而对于组织来源的细胞,还要先采用物理方法如匀浆法、超声波法、液氮破碎法等破碎细胞,再行分离.
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不同的液化方法对痰液DNA提取的影响
为探讨不同固定液化方法对痰液中DNA提取的影响,应用3种不同的痰液液化固定方法即:Saccomanno法;DTT法;Saccomanno法和DTT法联合应用.对经3种方法处理的痰液分别提取DNA,应用分光光度仪测量其波长为260 nm和280 nm处光密度值(OD值),以OD260/DD280作为衡量DNA纯度的指标.结果表明用Saclomanno法和DTT活联合应用方法固定和液化的痰液中DNA提取效果佳,这为痰液作为呼吸系统疾病分子诊断样本提供依据.
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改良酚/氯仿法提取人全血DNA的研究
目的 对传统酚/氯仿法进行改良,以期提取到高纯度的DNA,提高回收率.方法 采用改良酚/氯仿法提取人全血基因组DNA,与传统酚/氯仿法在DNA纯度、质量浓度和聚合酶链反应(PCR)扩增短串联重复序列(STR)位点等方面进行比较.结果 改良前后酚/氯仿法提取到的DNA纯度比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；改良酚/氯仿法提取DNA的量明显高于酚/氯仿法,二者比较,差异有统计学意义(P＜0.05).改良后酚/氯仿法提取2μL全血DNA仍可准确进行CFS1PO分型.结论 改良酚/氯仿法提取DNA具有较高纯度和较高回收率的特点,可能在微量检材DNA提取中有一定应用价值.
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提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的佳条件
目的确定提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的佳条件. 方法回收的基本步骤遵循试剂盒附带的厂家说明,在此基础上,改变其中所用试剂的剂量,或者添加原试剂盒中没有的试剂,并在不同条件组合下分别进行DNA回收. 电泳后,通过比较条带的亮度来比较不同条件下DNA回收效率的大小,逐步确定佳的胶回收条件. 结果提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的佳条件为: 切胶要尽量的小;每l g胶用600 μL的S1;溶胶时间:55℃, 10 min;沉淀时加入3/5总体积的异丙醇和1/10总体积的乙酸钠(3 mol*L-1, pH 5.2);沉淀时间20 min;沉淀温度为25℃(室温);用T1液溶解效率高于用水溶;溶解时间为20 min (55℃).这些佳条件中,大部分都对原来的条件进行了改良. 结论应用了改良后的胶回收条件后,胶回收的效率提高到原来的3～4倍.
