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补骨脂黄酮对乳鼠颅骨成骨细胞增殖和矿化成熟的影响
目的:探讨补骨脂黄酮对体外培养的成骨细胞增殖和矿化成熟的影响.方法:取新生SD大鼠颅骨,体外培养成骨细胞,取第1代细胞进行以下实验.①将细胞分为6组,A组不进行干预,B、C、D、E、F组分别采用终浓度为1×10-4 mol·L-1、1 × 10-5mol·L-1、1 ×10-6mol· L-1、1×10-7 mol·L-1、1×10-8 mol· L-1的补骨脂黄酮进行干预,检测细胞增殖情况.②将成骨诱导培养的细胞分为6组,a组不进行干预,b、c、d、e、f组分别采用终浓度为1×10-4 mol·L-1、1×10-5 mol·L-1、1×10-6 mol·L-1、1×10-7 mol·L-1、1×10-8 mol·L-1的补骨脂黄酮进行干预,9d后检测碱性磷酸酶活性,将碱性磷酸酶活性高者确定为补骨脂黄酮的佳浓度.③采用ELISA法检测a组和碱性磷酸酶活性高组成骨诱导培养3d、6d、9d、12d和15 d时培养液中骨钙素、骨形态发生蛋白-2、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的含量.④成骨诱导第12天,采用茜素红染色法检测a组和碱性磷酸酶活性高组钙化结节的形成情况.⑤采用PCR法测定a组和碱性磷酸酶活性高组成骨培养开始后72 h内碱性成纤维细胞生长因子mRNA、胰岛素样生长因子-1mRNA、转录因子Runx-2 mRNA和Osterix mRNA的表达水平.结果:①细胞增殖测定结果.6组吸光度值比较,差异无统计学意义[(0.512 ±0.046),(0.448 ±0.051),(0.528±0.043),(0.525±0.041),(0.522 ±0.039),(0.517±0.049),F=1.438,P=0.282].②碱性磷酸酶活性检测结果.6组吸光度值比较,差异有统计学意义[(2.637±0.221),(2.136±0.168),(3.678 ±0.235),(3.153 ±0.201),(3.001±0.224),(2.934 ±0.188),F=15.442,P=0.000];a组吸光度值高于b组(P=0.018),低于其余4组(P =0.000,P=0.003,P=0.016,P=0.043),c组高于b、d、e、f组(P=0.000,P=0.034,P=0.013,P=0.001).③骨相关蛋白检测结果.除3d外(P =0.264),c组骨钙素分泌量在6d、9d、12d和15 d均大于a组(P=0.027,P=0.002,P=0.005,P=0.033);除3d和15 d外(P=0.085,P=0.132),c组骨形态发生蛋白-2分泌量在6d、9d和12d均大于a组(P=0.023,P=0.001,P=0.002);除3d外(P=0.312),c组骨桥蛋白分泌量在6d、9d、12d和15 d均大于a组(P=0.022,P=0.008,P=0.001,P=0.038);除15 d外(P=0.785),c组Ⅰ型胶原蛋白分泌量在3d、6d、9d和12 d均大于a组(P=0.042,P=0.002,P=0.003,P=0.037).④钙化结节形成情况.成骨诱导培养12d后,c组的钙化结节明显多于a组.⑤成骨相关基因表达情况.除72 h外(P=0.255),c组碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达水平在6h、12h、24h、36 h和48 h均高于a组(P=0.027,P=0.009,P=0.002,P=0.006,P=0.022);除6h和72 h外(P=0.092,P=0.114),c组胰岛素样生长因子-1 mRNA表达水平在12h、24h、36 h和48 h均高于a组(P =0.007,P=0.005,P=0.003,P=0.026);除6h和72 h外(P=0.186,P=0.359),c组Runx-2 mRNA表达水平在12h、24h、36 h和48 h均高于c组(P =0.001,P=0.004,P=0.003,P=0.023);除72 h外(P =0.271),c组Osterix mRNA表达水平在6h、12 h、24h、36 h和48 h均高于a组(P=0.024,P=0.001,P=0.000,P=0.000,P=0.021).结论:补骨脂黄酮对体外培养成骨细胞的增殖并无明显影响,但可以促进体外培养的成骨细胞矿化成熟,有一定的促骨形成活性.
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水中微量铝的分光光度测定
水环境中的铝主要来源于地质风化,矿化冶金,金属及其制品尤其是铝制品在日常生活中的应用,以及铝化物广泛用于水的净化处理.人体长期摄过多的铝对健康有害,因此,世界卫生组织建议水中铝含量不应超过0.2mg/L[1].即将颁布的新的"生活饮用水卫生标准",也增加了卫生标准界限为0.2mg/L.
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山柰酚对成骨细胞株MG -63增殖分化的影响
目的 探讨山柰酚对成骨细胞增殖分化的影响.方法 将含有ERs配体结合域(LBD)的质粒pCMV - BD和pFR -Luci报告基因及内标质粒beta - gal共转染到MG -63成骨细胞中,检测山柰酚与雌激素受体的关系；Celltiter试剂检测山柰酚对细胞活力的影响,茜红素染色和pNPP法检测山柰酚对成骨细胞分化和矿化能力的影响,流式细胞仪检测山柰酚对细胞内游离钙的影响.结果 山柰酚能够激活雌激素受体的活性,促进成骨细胞增殖,提高成骨细胞分化和矿化能力.结论 山柰酚能够促进成骨细胞的增殖和矿化能力.
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二至丸含药血清对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响
目的 研究二至丸含药血清对体外培养大鼠成骨细胞(Osteoporosis,OP)增殖、分化及矿化的影响.方法 二至丸(9,4.5,2.25 g/kg/d)给大鼠连续灌胃7d,每天2次,于第8天灌胃后1～2 h眼眶取血制备含药血清,采用多次酶消化法获得大鼠原代成骨细胞,将含药血清加入成骨细胞培养液中,采用MTT比色法、碱性磷酸酶(ALP)染色法、茜素红染色法研究其对细胞增殖及功能的影响.结果 二至丸含药血清能不同程度地促进大鼠原代成骨细胞的增殖,二至丸中剂量在24,48,72 h均能显著促进大鼠原代成骨细胞的增殖(P＜0.05);二至丸中、小剂量能显著增加大鼠原代成骨细胞ALP活性(P＜0.05)和矿化结节的数量(P＜0.05),其中二至丸中剂量效果为显著(P＜0.01).结论 二至丸含药血清具有良好的促进成骨细胞增殖、分化、矿化的作用,其中二至丸中剂量组作用效果尤为显著.
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复方中药含药血清对大鼠成骨细胞增殖及矿化功能的影响
目的:观察补肾健脾活血方中药含药血清对大鼠成骨细胞增殖及矿化功能的影响.方法:制备补肾健脾活血方复方中药含药血清,取不同浓度剂量干预体外培养的成骨细胞,用MTT法检测成骨细胞增殖率,用茜素红染色法显示矿化结节的形成.结果:补肾健脾活血方含药血清能明显增加成骨细胞增殖率和矿化结节形成数,且与含药血清浓度呈正相关.结论:补肾健脾活血方能明显促进成骨细胞的增殖,并能促进成骨细胞对骨机质的矿化功能.
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1.0mT低频交变电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响
目的 探讨1.0 mT低频交变电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞活力、增殖及成骨分化的影响.方法 本研究选用1.0 mT正弦波电磁场进行实验,电磁场频率分别设置为10Hz,30 Hz,50 Hz和70 Hz.不同频率组大鼠骨髓间充质干细胞每天均接受8h暴磁处理,培养时间为2周.分别在不同时间点使用Live/Dead试剂盒检测不同频率电磁场对细胞活力的影响;使用DNA定量方法评价细胞增殖水平;使用Von Kossa染色方法检测细胞外基质矿化程度;并使用酶联免疫吸附和免疫组化方法检测各组骨钙素和骨形态发生蛋白-2合成情况.结果 实验结果显示,50 Hz及70 Hz电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞活力有明显影响;10 Hz电磁场可显著促进细胞增殖;暴磁2周后,发现50 Hz组骨钙素及骨形态发生蛋白合成水平明显高于其它暴磁组;并且50 Hz组中矿化结节数量及密度也较其它组明显增加.结论 不同频率1.0 mT低频交变电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞活力、增殖及成骨分化方面的影响各不相同,本研究结果为电磁场应用于骨组织再生医学提供更多理论依据.
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超声波与冲击波促进骨折愈合的基础研究与临床应用
骨折愈合的修复是一个复杂的生物学过程,涉及机体一系列细胞激活、细胞外基质的沉积、矿化的改变及空间结构的恢复.无论采用何种治疗方法,其目的都是希望大限度地改善骨骼的力学性能,从而尽快恢复骨骼的生理功能.
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具有骨诱导活性的仿生骨基质材料的制备
目的 将一种具有与骨形态发生蛋白2相似骨诱导活性的多肽p24共价结合于改性聚(丙交酯-co-乙交酯)基质材料上,以制备出具有骨诱导活性的仿生骨基质材料.方法 将活性多肽p24通过交联剂共价结合于改性PLGA材料上作为实验组;以未加交联剂多肽溶液和材料简单混合反应为对照组,通过X射线光电子光谱法和扫描电镜检测交联情况;同时对两组材料进行钙离子吸附实验,初步评价其仿生矿化能力.结果 XPS检测结果表明,实验组及对照组材料表面均已结合硫元素,两者含有硫元素含量分别为1.50%及0.09%;钙离子吸附实验结果表明,12 h及24h时实验组材料的钙离子吸附量分别为0.126 mg及0.231 mg;12 h及24 h时对照组材料的钙离子吸附量分别为0.053、0.102 mg.多肽交联之材料较混合之材料的钙离子吸附能力显著增强.结论 在改性PLGA三嵌段材料上固定了BMP2活性多肽,为以后发挥其骨诱导活性修复骨缺损奠定了良好基础.
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模拟微重力对人牙髓干细胞-PLGA复合物矿化的影响
目的:研究模拟微重力(SMG)对人牙髓干细胞(hDPSCs)在聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上矿化的影响.方法:采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,并进行鉴定.hDPSCs常规接种于PLGA支架,24 h后,模拟微重力环境和普通环境下分别矿化诱导.矿化诱导第3、5、7、10、14天时进行碱性磷酸酶活性检测,第21天时进行茜素红染色以观察人牙髓干细胞在PLGA支架上矿化结节形成情况.结果:模拟微重力环境下的碱性磷酸酶活性明显低于普通环境(P＜0.01),茜素红染色显示模拟微重力环境下形成的矿化结节较普通环境下的小且数量少.结论:模拟微重力环境抑制hDPSCs在PLGA支架上的矿化.
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体外诱导培养大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达
目的:观察体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白合成的变化.方法:原代培养法获得大鼠牙乳头细胞,在条件培养基中进行诱导培养,在不同时间进行钙结节染色,ALP染色和定量测定,ELISA法和RT-PCR法测定细胞Ⅰ型胶原蛋白的量和mRNA表达水平.结果:体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞形成含钙化物的细胞结节,体外培养至12 d的诱导组细胞ALP高于对照组(P＜ 0.05),细胞内1型胶原表达量高于对照组(P＜0.05),且Ⅰ型胶原mRNA表达水平上调(P＜0.05)；培养15d后诱导组细胞分泌的Ⅰ型胶原高于对照组(P＜0.05).结论:大鼠牙乳头细胞在体外分化的过程中碱性磷酸酶活性明显增高,矿化能力增强,并不断合成和分泌Ⅰ型胶原形成胞外基质.
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微阵列芯片分析成牙骨质细胞矿化过程中microRNA表达谱的差异
目的:诱导小鼠成牙骨质细胞矿化,研究在成牙骨质细胞矿化过程中microRNA表达谱的变化.方法:体外培养小鼠成牙骨质细胞系OCCM30,使用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松诱导成牙骨质细胞矿化.实时荧光定量PCR(qPCR)检测碱性磷酸酶和骨钙蛋白表达量变化来验证矿化情况.应用miRNA microarray芯片技术,分析成牙骨质细胞矿化过程中miRNA表达谱的变化.QPCR对芯片结果进行验证.结果:成功诱导了成牙骨质细胞的矿化.MiRNA microarray芯片检测发现成牙骨质细胞矿化过程中miRNA表达谱出现明显改变,其中上调的有4个,下调的有39个.QPCR证明芯片结果准确可靠.结论:建立了小鼠成牙骨质细胞矿化的细胞模型,应用miRNA芯片发现小鼠成牙骨质细胞矿化过程中差异表达的miRNA,提示这些miRNA可能参与成牙骨质细胞矿化过程的调控.
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信号素3A对成牙骨质细胞系OCCM-30增殖和矿化功能影响的实验研究
目的:初步探讨信号素3A(Semaphorin3A,Sema3A)对成牙骨质细胞增殖、矿化的影响.方法:采用不同浓度的重组人Sema3A(0、0.5、1 mg/L)处理成牙骨质细胞OCCM-30.MTT法检测Sema3A对成牙骨质细胞增殖的影响,酶比活性法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的变化,实时荧光定量PCR法检测骨钙素(OCN),骨桥蛋白(OPN)和Runx2基因的表达,茜素红染色法检测矿化结节的形成.结果:Sema3A对成牙骨质细胞的增殖和ALP活性无明显影响.Sema3A抑制OCN和Runx2基因的表达(P＜0.05),并抑制矿化结节的形成.结论:Se-ma3A对成牙骨质细胞的增殖无明显影响,但对细胞的矿化功能起到抑制作用.
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TNF-α对根尖乳头干细胞体外增殖及成牙成骨向分化能力的影响
目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对根尖乳头干细胞(SCAP)外增殖及成牙成骨向分化能力的影响.方法:采用酶消化法结合组织块法获得根尖乳头干细胞,免疫荧光免疫组化法鉴定细胞来源,通过不同浓度的TNF-α进行干预后检测对SCAP增殖,矿化成牙成骨能力的影响.结果:MTT检测显示各浓度组TNF-α均能刺激SCAP的体外增殖,10、50 mg/L的TNF-α实验组可明显促进SCAP增殖(P＜0.05),差异具有统计学意义;茜素红染色显示与对照组(0 mg/L TNF-α)相比,实验组(5、10、50 mg/L TNF-α)染色明显变浅,矿化结节形成的较小,对照组形成红色结节范围大且呈深橘色;免疫组化染色显示SCAP胞浆中DSP、BSP均有表达,实验组部分细胞胞浆染色且染色较浅,呈褐色为阳性表达,对照组(0 mg/L TNF-α)细胞胞浆完全着色呈深褐色,为强阳性表达.结论:不同浓度TNF-α对SCAP的生长增殖均有促进作用,TNF-α在不同程度上对SCAP矿化及成牙成骨向分化有抑制作用.
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硫酸软骨素蛋白聚糖对MC3T3-E1细胞株矿化的影响
目的:观察硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)对前成骨细胞株MC3T3-E1矿化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和钙离子沉积量的影响.方法:MC3T3-E1细胞株在含不同浓度CSPG(0、5、10、15 mg/L)诱导液中培养,不加CSPG组为对照组,其余3组为实验组,细胞诱导14d时行ALP染色和活性检测,21d时行茜素红染色和钙离子沉积量检测.结果:与对照组比较,各实验组ALP和茜素红染色面积随CSPG浓度增加逐渐减小,颜色变浅;定量分析结果显示,钙离子沉积量整体差异有统计学意义(P＜0.05),ALP活性整体差异无统计学意义.结论:在本实验周期内,CSPG以剂量依赖方式抑制MC3T3-E1细胞株钙离子的沉积.
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模拟微重力对人牙髓干细胞在裸鼠体内矿化能力的影响
目的:研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上的人牙髓干细胞(human dental pulp stemcells,hDPSCs)在裸鼠体内矿化能力的影响.方法:分离、培养hDPSCs并进行鉴定,然后将hDPSCs接种到PLGA支架上培养72 h后随机分为两组,普通重力组和模拟微重力组,经矿化诱导液培养1周后分别将细胞支架复合物移植到裸鼠体内,植入术后4周取材,进行组织学(HE和Vonkossa)和免疫组织化学(DSPP)检测.结果:HE染色均可见有血管生成,Vonkossa染色均为阳性,模拟微重力组DSPP的表达水平明显高于普通重力组(P＜0.05).结论:模拟微重力有利于hDPSCs在裸鼠体内的矿化.
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低分子量猪釉原蛋白和氟离子共同作用对磷灰石晶体矿化作用的研究
目的:利用双膜体外矿化模型研究低分子量猪釉原蛋白(LMWPA)与氟离子(F)共同作用对磷灰石晶体矿化的作用.方法:将LMWPA,LMWPA+ 1mg/L F,LMWPA+2 mg/L F分别加入双膜系统的反应空间内反应,同时设DDW(双蒸水),BSA(牛血清白蛋白),BSA+1 mg/LF,BSA+2 mg/LF组作为对照,37℃,反应3d后,扫描电镜(SEM)、能谱分析(EDX),X线衍射法(XRD)检测矿化产物.结果:与空白对照组相比,BSA和LMWPA的加入均能显著改变晶体的形态,但对晶体成份无明显作用,均为磷酸八钙(OCP).与氟离子共同作用后,LMW-PA组形成了磷灰石晶体,而BSA组则形成了透钙磷石.结论:LMWPA与氟离子的共同作用可能是釉质矿化过程中重要的调控机制.
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被动吸烟对大鼠牙槽骨内DSP和OPN表达的影响
目的:观察被动吸烟对大鼠牙槽骨内牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达的影响.方法:20只6周龄健康雄性Wistar大鼠随机等分为对照组和实验组,每个大组再等分为30 d 和60 d两个亚组.采用单纯烟熏法建立大鼠被动吸烟模型,免疫组织化学法检测DSP和OPN在大鼠牙槽骨内的表达.结果:与对照组大鼠相比较,实验组大鼠牙槽骨内DSP和OPN表达均明显上调;在本实验周期内,上述变化随实验时间的延长而加重.结论:被动吸烟上调大鼠牙槽骨内矿化相关非胶原蛋白DSP及OPN的表达,推测DSP和OPN在被动吸烟抑制牙槽骨矿化的发病机制中发挥一定的作用.
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胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中表达的实验研究
目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中的表达.方法:利用组织块法体外培养人牙髓细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂.培养14 d后,免疫细胞化学检测牙本质涎蛋白的表达;von kossa染色检测矿化结节的形成.培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白1及碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果.结果:培养14 d,实验组牙本质涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组牙本质涎蛋白表达阴性,von kossa染色阴性.RT-PCR结果显示碱性磷酸酶及LIM矿化蛋白1在实验组和对照组各时段均表达.培养期间,实验组LIM矿化蛋白1的表达显著性高于对照组,其中培养第2天及9天时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.8倍及3.0倍.培养期间,碱性磷酸酶的表达显著性增高,其中培养14 d时约为对照组的2.0倍.结论:首次发现LIM矿化蛋白1与人牙髓细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白1可能在牙髓细胞的分化及矿化中发挥一定作用.
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牙周韧带细胞体外矿化的研究——骨唾蛋白与骨桥素在矿化过程中的表达
目的:研究骨唾蛋白与骨桥素在体外培养的人牙周韧带细胞矿化过程中的表达.方法:体外培养的人牙周韧带细胞,经地塞米松矿化液诱导,分别于不同的时间在相差显微镜下观察其矿化结节的形成,采用免疫细胞化学的方法观察骨唾蛋白与骨桥素的表达情况.结果:矿化培养1周细胞呈复层生长,骨桥素呈阳性染色;两周细胞密集呈结节状,骨唾蛋白与骨桥素均为阳性,胞浆染成黄褐色;3周出现矿化结节,矿化以后骨唾蛋白与骨桥素保持稳定表达.结论:牙周韧带细胞在适当的条件下可以向成骨细胞表型分化,表达矿化相关蛋白,形成矿化结节.
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局部注射维生素D对Wistar鼠牙齿移动后新骨生成影响的实验研究
矫正后的牙列稳固在新位置,达到新的结构,功能平衡,是一个慢长的过程,主要因为错牙合矫正后仍长时间潜在许多的不稳定因素,其中牙槽骨改建未完成是主要原因之一.有研究表明:1,25(OH)2D3与骨代谢关系密切,能调节骨生成与矿化.由此本实验从骨组织形态学方面研究1,25(OH)2D3在牙齿移动后骨生成过程中的作用,为临床正畸局部使用生物化学因子缩短保持时间提供实验依据.
