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一个类遗传性血小板无力症家系及其分子发病机制研究
目的 报告一个遗传性血小板功能障碍家系并探索其分子发病机制.方法 收集该家系临床资料,采用二代高通量测序法进行遗传性血液病和血小板功能相关近600种基因突变筛查.采用RT-PCR及一代测序法检测先证者及其父母RASGRP2基因部分转录本序列.结果 该遗传性血小板功能障碍家系临床表现符合变异型血小板无力症,表现为反复皮肤黏膜严重出血,先证者血小板对多种不同浓度的生理性诱聚剂反应低下甚至缺如.先证者未检出整合素αⅡbβ3基因突变,而存在RASGRP2 IVS3-1C＞G纯合突变,其父母均为该位点杂合突变.先证者在扩增区检测出2种转录本,功能型RASGRP2蛋白对应的正常转录本未检出,其父母同时存在正常转录本及异常转录本,但以正常转录本为主.结论 RASGRP2基因IVS3-1C＞G纯合突变是导致该家系先证者发生血小板功能障碍性出血的原因.RASGRP2基因IVS3-1C＞G突变导致RASGRP2异常剪接,发挥激活Rap1的RASGRP2蛋白缺失,进而导致血小板功能障碍.本研究为国内首次报道RASGRP2基因异常导致血小板功能障碍性出血,也是国际上首次报道该突变类型.
关键词： 遗传性血小板功能障碍 RASGRP2基因 剪接突变 -
低磷酸盐血症性佝偻病PHEX基因突变分析
目的 鉴定一个低磷酸盐血症性佝偻病家系的致病基因突变.方法 采集患者外周静脉血,提取基因组DNA.PCR扩增PHEX基因22个外显子及外显子/内含子交界区序列,进行DNA测序分析.结果 DNA测序结果表明患儿PHEX基因第20内含子受体位点突变,IVS20-1G＞T.结论 PHEX 基因新剪接突变IVS20-1G＞T导致该家系低磷酸盐血症性佝偻病的发生.
关键词： 低磷酸盐血症性佝偻病 PHEX 受体位点 剪接突变 -
罕见的CYP17A1基因外显子剪接突变导致17α-羟化酶缺陷的分子病因学研究
目的 对一例46XY性发育异常的患者进行CYP17A1致病基因分析,并探讨新的突变对患者表型的影响.方法 对患者及其父母的CYP17A1基因的8个外显子进行PCR扩增,扩增产物直接测序.将野生型和含有新突变位点的突变型PCR片段连入表达载体,构建Mini-gene系统,转染HEK-293T细胞,RT-PCR观察新突变位点对剪切的影响.进一步构建野生型和剪切异常的CYP17A1 cDNA全长表达质粒,转染HEK-293T细胞,体外检测CYP17A1酶活性.结果 基因分析显示患者的CYP17A1基因为复合杂合突变,其中一个等位基因为外显子6中c.985_987delinsAA突变,另一等位基因含有新的同义突变(c.1263 G＞A:GCG＞GCA).体外研究表明,这种同义突变会产生新的剪切位点,导致CYP17A1基因mRNA异常剪切,剪切产物中CYP17A1的415位氨基酸残基后缺失6或7个氨基酸.体外转染和酶活性检测证实异常剪切产物使酶活性丧失；但此突变对剪切的影响并不是完全的,在患者体内还应存在部分正常的剪切产物,发挥残余酶活性,与患者的表型相一致.结论 本研究首次报道了由于CYP17A1基因外显子剪切突变导致的17α-羟化酶缺乏的患者,并且启动对异常剪切体的功能研究.
关键词： 17α-羟化酶/17 20-裂解酶缺乏症 CYP17A1基因 剪接突变 -
幼年性透明蛋白纤维瘤病一例
报道1例幼年性透明蛋白纤维瘤病的临床表现及实验室特点.患儿1岁起病,以皮肤多发纤维瘤及牙龈增生为特征,智力发育正常.皮损组织病理检查显示表皮正常,结节由纺缍状成纤维细胞样细胞和细胞外均一性玻璃样物质混合构成,正常组织结构破坏.玻璃样物为非纤维性,嗜酸性,成纤维细胞胞质透明,可见模糊的束状排列,无细胞异形性和坏死.PCR扩增毛细血管形态发生因子-2基因17个外显子并测序显示:14号外显子发生纯合的剪接突变IVS14+1G→T,其父母均为该突变的携带者,符合常染色体隐性遗传方式.
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一先天性无虹膜家系PAX6基因的突变检测
目的 对一常染色体显性遗传的先天性无虹膜家系进行配对盒基因(PAX6)突变检测,以鉴定其致病基因.方法 收集一常染色体显性遗传的先天性无虹膜家系,采集该家系患者及其家族成员的外周血,提取基因组DNA,利用PCR扩增PAX6基因的全部外显子及外显子内含子连接处,直接测序,测序结果用DNAStar软件进行突变分析.并随机抽取100名健康人外周静脉血,进行PCR,测序检测,作为对照.结果 无虹膜家系中患者均发现PAX6基因在第9内含子与第10外显子交界处出现杂合突变(IVS9-1G＞ A),导致DNA剪接异常.结论 PAX6基因的IVS9-1G＞A突变使DNA剪接异常,导致蛋白质的改变,这可能是该常染色显性遗传家系先天性无虹膜的致病原因.
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1例肢带型肌营养不良1B型的临床和遗传学特点
本文报道1例LMNA基因新发剪接杂合突变所致的肢带型肌营养不良1B型(LGMD1B).患儿表现为进行性加重的行走乏力,肩胛带肌和下肢近端肌肉无萎缩,四肢肌张力正常,上肢肌力4级、下肢肌力4级,Gower征(+);CK 779 U/L;肌肉病理HE染色提示肌营养不良表现,免疫组化显示Lamin A蛋白表达无明显减少;二代基因测序显示患儿LMNA基因存在新发的c.810+2T>C剪接位点杂合突变,其父母LMNA基因该位点正常.GERP++RS软件预测该突变位点具有高度保守性;Human Splice Finder和Spliceman软件预测该突变可能为致病性突变;ExPASy预测新的剪接变体氨基酸序列变短.转录组测序提示患者肌肉的mRNA存在两种序列:一种为正常序列,占92.2％;另一种为部分4号内含子保留,占7.8％,即异常剪接变体.LGMD1B是由位于常染色体1q22的LMNA基因突变所致的常染色体显性遗传性肌病,本研究的发现扩展了LMNA基因突变谱,为LGMD1B诊断提供了帮助.
关键词： 肢带型肌营养不良1B型 lmna基因 剪接突变 儿童 -
家族性高胆固醇血症家系低密度脂蛋白受体基因剪接突变的研究
目的检测中国汉族家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)大家系低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)基因突变,探讨FH发病的分子机理.方法首先采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术检测载脂蛋白B100(apoB100)基因Q3500R突变,排除家族性apoB100缺陷症,再采用PCR扩增结合核苷酸序列分析检测1例临床诊断为FH纯合子患儿及其家系成员LDLR基因启动子和全部18个外显子片段,结果与GenBank公布的该基因正常序列对比找出突变,并在家系其他成员中证实该突变. 结果该患儿LDLR基因第3内含子剪接供体处存在INⅢ5′GT→AT纯合剪接突变,并且在家系中得到证实,一级和二级亲属中各发现2例相同位点和相同形式的杂合子,其基因型表现为野生型和突变型杂合现象.同时未检测出患儿及其父母 apoB100 Q3500R突变. 结论发现LDLR基因第3内含子G→A纯合剪接突变,可能是该FH家系发病的分子基础;检测该突变对临床干预和遗传指导有参考价值.
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一例由EXT1基因新的剪接突变c.1164+1G＞A导致的多发性骨软骨瘤
目的 对1个多发性骨软骨瘤家系EXT1基因进行突变分析,探索其致病机制.方法 PCR-测序分析家系成员外周血DNAEXT1/EXT2基因编码区及邻近序列;计算机及生物信息学分析预测变异;单核苷酸多态性筛查、TA克隆-测序分析先证者血组织的EXT1基因转录本,卡方检验统计分析比较其异常转录本数与正常对照的差异以探讨变异的致病机制.结果 基因测序发现先证者EXT1基因第3内含子5'剪接位点存在一新的杂合性点突变(c.1164+1G＞A),而正常个体未发现该突变;计算机及生物信息学预测突变位于保守区并可导致第3外显子跳跃或异常剪接;TA克隆测序及统计分析表明,与正常对照相比,先证者含第3外显子跳跃的转录本数出现增加(P＜0.05).结论 c.1164-+ 1G＞A导致较多拷贝的EXT1基因转录本第3外显子跳跃,导致具有肿瘤抑制功能的拷贝数减少,从而引起多发性骨软骨瘤的发生.
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COL1A1基因中一个导致Ⅰ型成骨不全的新剪接突变c.3208G＞A分析
目的 探讨COL1A1基因中一个新突变c.3208G＞A导致Ⅰ型成骨不全的致病机理.方法 应用标准的方法提取外周血全基因组DNA,PCR扩增基因的整个编码区域和内含子-外显子边界,应用ABI 3100/3130测序仪对PCR产物进行直接测序.从患者的EB病毒转化永生B细胞系中提取全RNA,用寡(dT) 18引物合成第一链cDNA,对PCR产物直接测序或者用TA克隆质粒DNA测序.结果 在一个Ⅰ型成骨不全大家庭中检测到一种位于COL1A1基因上的新突变c.3208G＞A,为剪接突变.结论 发现了COL1A1基因中的新的剪接突变c.3208G＞A.
