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去唾液酸糖蛋白受体在乙型肝炎病毒感染者精子中表达的初步研究
目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)感染者精子中去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)的表达,并与HBV阴性男性精子比较,探讨ASGP-R是否参与介导HBV侵入人精子.方法 用ASGP-R单抗,通过免疫印迹(Western blot)和流式细胞术检测ASGP-R在乙肝表面抗原(+)/乙肝e抗原(+)[HBsAg(+)/HBeAg(+)]者(双阳性组,n=16)、HBsAg(+)/HBeAg(一)者(单阳性组,n=28)和HBsAg(-)者(阴性组,n=35)精子中表达差异.结果 ASGP-R于人精子的胞质中高表达,于胞膜低表达；胞质中ASGP-R水平在阴性组、单阳性组及双阳性组中逐渐升高,双阳性组和单阳性组的胞膜上ASGP-R的阳性率均高于阴性组(P均＜0.05).结论 人精子胞膜和胞质中均存在ASGP-R; HBV可能通过人精子表面的ASGP-R进入精子,且HBV可能通过某种机制使ASGP-R的表达量增加.
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肝去唾液酸糖蛋白受体显像:三维分段肝功能评估的前景
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是哺乳动物肝细胞表面的特异性受体,肝硬化和肝癌时ASGPR水平下降.利用99mTcGSA进行该受体的显像,能够得到HH15、LHL15、[R]0、R0等指标用于肝功能的评估;将这种功能性显像与单光子发射型计算机断层显像(SPECT)技术相结合,可以模拟肝脏切除的范围,并预测术后剩余肝脏的功能.此技术在国际上是一个新的课题,在国内尚无开展,用它来数字化的评估手术风险对患者手术方式的选择及预后具有重要影响.笔者结合正在进行的这方面部分研究,向读者作一介绍,以期在临床上发挥更好的作用.
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去唾液酸糖蛋白受体的研究现状
去唾液酸糖蛋白受体（ asialoglycoprotein receptor ， ASGPR），也被称为肝细胞半乳糖/N-乙酰基葡糖胺受体，或者 Ashwell-Morell 受体[1]。它主要表达于肝窦状间隙的肝实质细胞表面，是第一个被发现的凝集素。由于它结合配体的钙离子依赖性，因此属于 C 型凝集素。ASGPR 能够介导去唾液酸化的糖蛋白被肝细胞内吞降解[2]。目前已知的ASGPR 的配体非常多，提示其在糖蛋白代谢、脂代谢、凋亡细胞降解、调节凝血、介导病毒进入细胞和自身免疫性炎症反应等多个生理环节均发挥着重要的作用[3]。
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去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定
目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定.方法将ASGPR H1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-s tag)进行差异筛选.取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Western blot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性.结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族.噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Western blot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合.结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体.该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值.
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ASGPR单链抗体-蜂毒肽融合蛋白的构建及其溶红细胞效应
去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是一种异源低聚物的内吞受体,定位于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面,在介导肝脏疾病靶向治疗方面具有潜在应用价值.我们在获得抗ASGPR单链抗体C1的基础上[1],将C1作为靶向分子,与编码蜂毒肽(melittin)的寡核苷酸基因连接,并克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中融合表达,并探讨了融合蛋白(C1M)的体外溶红细胞效应.
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肝脏去唾液酸糖蛋白受体的研究进展
肝脏去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）与肝脏疾病的发生发展密切相关，去唾液酸糖蛋白受体用于临床，对于肝脏疾病的早期诊断以及指导治疗和评价预后有重要的临床意义。本文介绍了去唾液酸糖蛋白受体的发生发展过程及国内外的研究进展，并对其未来的发展方向做了展望。
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应用 Child-Pugh 评分、吲哚青绿15 min 潴留率、去唾液酸糖蛋白受体与肝瞬时弹性值建立肝切除患者肝储备功能定量评估系统的初步研究
目的联合运用Child-Pugh评分、吲哚青绿（ ICG）试验、去唾液酸糖蛋白受体（ ASGPR）及肝瞬时弹性值（ TE），建立肝切除患者肝储备功能定量评估系统。方法对2011年1月至2012年12月在我科行肝切除的104例患者，术前测定Child-Pugh评分、吲哚青绿15 min潴留率（ ICGR15）、肝细胞ASGPR荧光强度及TE，并使用术后2周Child-Pugh评分评估肝功能恢复情况。利用多元线性逐步回归分析法筛选影响术后肝功能恢复的指标，以术后肝功能Child-Push评分为因变量（Y值），以筛选指标为自变量（Xn），建立肝储备功能评估方程。结果利用多元线性逐步回归分析法筛选得出ASGPR、Child-Pugh评分、ICGR15与TE是影响术后肝功能恢复的敏感指标，并可建立多元线性回归方程为Y＝6.3050-0.0543 X1＋0.4980 X2＋0.1150 X3-0.0637 X4，该模型能够解释术后肝功能85.8％变差，而单独使用Child-Pugh评分仅能解释术后肝功能66.0％变差。结论术前联合应用Child-Pugh评分、ICGR15、ASGPR与TE能够提高Child-Pugh评分评估肝切除患者肝储备功能准确率，具有一定的临床应用价值。
关键词： 吲哚花青绿 去唾液酸糖蛋白受体 弹性成像技术 肝功能 Child-Pugh评分 -
去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值
目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein reeeptor,ASGPR)H1亚单位显性表位435 bp基因片段,构建表达重组质粒,进行表达、纯化,以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测自身免疫性肝炎(AIH)中抗ASGPR抗体的价值.方法 将ASGPRH1亚单位糖类识别区(CRDH1)435 bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH,经D-半乳糖诱导表达,表达产物用谷胱甘肽凝胶珠(Glutathione Sepharose4B)亲和纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)及蛋白质谱(MALDI-TOF)进行免疫活性鉴定,应用表达蛋白建立ELISA法.同时用该方法检测45例AIH、30例SLE、30例类风湿关节炎(RA)、10例原发性干燥综合征(SS)患者、30名健康献血者的抗ASGPR抗体阳性率.结果 经重组质粒测序结果证实,CRDHl/PEGH目的 基因已正确插入真核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDS-PAGE检测表达产物为l条相对分子质量42 500的蛋白表达条带.质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对,与ASGPR H1亚单位蛋白同源性为98.34%,WB分析表明,重组蛋白具有人ASGPR抗原反应性;间接ELISA检测血清结果显示,AIH组中抗ASGPR抗体的阳性率为35.6%(16/45),非AIH组均为阴性,差异有统计学意义(χ2=31.85,P<0.01).结论 成功克隆的ASGPR H1基因可在啤酒酵母菌中成功表达,且重组的自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化蛋白建_上的间接ELISA检测AIH抗ASGPR抗体具有较好的特异性.
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捕获噬菌体酶联免疫吸附法筛选抗去唾液酸糖蛋白受体单链抗体的价值
目的评价捕获噬菌体酶免疫吸附试验法(ELISA)在筛选抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体(scFv)中的价值.方法以含ASGPR基因的质粒(CRDH1/pET3b)为模板,通过聚合酶链反应扩增获得ASGPR H1亚单位糖识别区基因(CRDH1),定向克隆至原核表达载体pET-32c,并经IPTG诱导表达,其表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化;然后,采用捕获噬菌体ELISA对人源噬菌体抗体库进行筛选和鉴定,同时对筛选的抗CRDH1单链抗体进行DNA测序、表达、纯化和免疫印记鉴定.然后,与间接噬菌体ELISA比较.结果 CRDH1/pET-32c在原核系统中经诱导表达出分子量约35 000的融合蛋白,且以包涵体形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白后,采用捕获噬菌体ELISA进行四轮筛选,在60个噬菌体克隆中有45株与CRDH1特异性结合,其中仅1株与重组蛋白标签有交叉结合反应.DNA序列分析表明,有9株DNA序列各异,9株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的scFv,纯化的scFv也可特异性识别rCRDH1.计算该筛选方法的假阳性率为2%,低于间接噬菌体ELISA筛选的假阳性率(58%).结论捕获噬菌体ELISA筛选CRDH1特异性scFv可有效降低硫氧还蛋白标签(Trx·Tag)引起的假阳性,提高筛选阳性率,并成功筛选出9株具有rCRDH1特异性的scFv.
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基于去唾液酸糖蛋白受体的循环肝癌细胞磁性分选检测法及其改良
目的:介绍一种肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells,CTCs)富集和检测系统,并对该系统进行改良,以提高循环肿瘤细胞的检出率.方法:去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor,ASGPR)是一种特异表达于肝实质细胞膜的跨膜蛋白.我们建立了一种基于ASGPR的磁性分选和Hep par 1免疫鉴定的循环肝癌细胞富集和计数系统.首先以生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞结合,然后用抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记,从而磁性捕获循环肝癌细胞,接着用Hep par 1进行免疫荧光染色鉴定,并对阳性细胞进行计数.文献报道和实际操作中发现,检测过程中采用肝素抗凝会引起细胞悬液中出现凝胶,影响细胞通过分离柱,降低分离效率.我们将部分步骤改用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)替代肝素抗凝,采用Hep3B肝癌细胞掺入试验对两种方法回收情况进行比较.结果:部分步骤改用EDTA抗凝后,细胞悬液中未出现凝胶现象.细胞掺入试验显示,5 mL健康志愿者外周血中分别掺入10、30、90、270和810个Hep3B细胞,在每个掺入水平,改良法Hep3B细胞的平均回收率均≥70％,回收效率明显增加(P＜0.05).结论:基于ASGPR的循环肝癌细胞富集和计数系统是一种具有临床应用潜能的循环肝癌细胞检测方法.经改良后能够有效消除细胞悬液中凝胶形成的现象,肝癌细胞回收效率较原检测法明显提高.
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肝脏功能评估在临床中的应用与发展
术前肝功能评估对制定手术方案、判断预后非常重要.由各指标组成的综合评分系统,考虑了肝脏合成、分泌等功能及相关脏器的影响.各种代谢性肝功能定量评估试验反映肝脏功能的能力不一,与综合评分系统共同应用,能更好的评估肝功能和预后,但这些评估只是针对肝脏整体,肝脏体积计算可以获得各部分的体积,但在肝硬化肝功能受损时体积并不能准确的反映功能,去唾液酸糖蛋白受体显像技术可以三维反映肝脏功能,结合计算机技术,进行术前模拟切除,可以获得手术风险信息,判断预后,目前被认为是一个有前途的肝功能评估方法.
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乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究
目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体.HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列,体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用.
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应用去唾液酸糖蛋白受体及临床指标建立肝储备功能定量评估系统
目的：探讨应用肝细胞表面ASGPR流式细胞分析及临床指标建立肝储备功能定量评估系统，并与Child-Pugh评分进行比较，了解其在患者术前肝储备功能评估中的临床应用价值。方法选择32例肝占位病变行肝部分切除术患者，术前检测ICGR15与EHBF、R值与K值以及临床生化指标、Child-Pugh评分，以此作为自变量（Xn），以肝组织标本PHCASGPR+为因变量（Y），通过多元线性回归分析，建立肝储备功能定量评估系统，并与Child-Pugh评分进行比较，了解两种方法预测术后肝功能代偿情况的准确率。按照回归方程计算46例肝占位病变接受肝部分切除术及肝硬化并门脉高压症接受断流术患者肝储备功能定量值，评估肝储备功能情况，预测术后肝功能恢复情况，比较术前不同Child-Pugh分级与Y值患者术后肝功能恢复情况。结果在预测术后肝功能代偿良好准确率方面，Y值优于Child-Pugh分级（P =0.030）；而在预测术后肝功能代偿不良准确率方面，Y值与Child-Pugh分级无统计学差异（P =1.000）。结论新肝储备功能定量评估系统能一定程度提高肝切除或肝硬化患者术前肝储备功能评价准确度，具有临床应用价值。
关键词： 肝脏储备功能 去唾液酸糖蛋白受体 Child-Pugh评分 -
应用吲哚青绿试验与血栓弹力图替代去唾液酸糖蛋白受体分析定量评估肝储备功能
目的：应用吲哚青绿实验与血栓弹力图检测指标，替代肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体分析，建立肝储备功能定量评估系统，并与Child-Pugh评分进行比较，了解其在肝切除术患者肝储备功能评估中的临床应用价值。方法对2012年1月1日至12月31日于本科室行肝部分切除术肝占位病变的患者共55例，测量PHCASGPR+、ICGR15、EHBF、R值与K值，建立以PHCASGPR+为因变量（Y）， ICGR15、EHBF、R值与K值为自变量（Xn）的肝储备功能定量评估系统，与Child-Pugh评分进行比较，了解两种方法预测术后肝功能代偿情况的准确率。结果 Child-Pugh预测术后肝功能代偿良好准确率为56.67%，Y值预测术后肝功能代偿良好准确率为84.62%（χ2=5.374，P =0.020）；Child-Pugh预测术后肝功能代偿不全准确率为76.00%，Y值预测术后肝功能代偿不全准确率为96.55%（χ2=5.400，P =0.020）。结论建立的肝储备功能定量评估系统能够更全面评价肝切除患者围手术期肝储备功能。
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N-乙酰半乳糖胺修饰的肝靶向香豆素-6脂质体制备及评价
目的:本研究采用酶促法构建N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)修饰的脂质体作为荧光标记物-香豆素-6的载体,对其修饰的脂质体理化性质进行评价.方法:采用酶催化法偶联合成GalNAc-C8-Chol,利用MS,NMR对其结构进行表征,并以此作为导向性材料,采用薄膜分散-挤出法制备载香豆素-6的GalNAc修饰肝靶向脂质体(NGAL-LP),并对脂质体的包封率、粒径、Zeta电位、体外释放度及RCA120体外结合效率等性质进行了考察.结果:合成的GalNAc-C8-Chol经MS,NMR鉴定为目标产物.与普通香豆素-6脂质体(LP)相比,本研究所制备的主动肝靶向脂质体(NGAL-LP)的粒径、Zeta电位、包封率、体外释放等理化性质无显著差异,包封率≥98％,平均粒径为(86.74±1.7) nm,平均Zeta电位为(-51.47±0.9) mV.体外释放结果表明,36 h内香豆素-6脂质体在PBS和血浆中的累积释放率＜8％.RCA120凝集实验表明,只有GalNAc-C8-Chol修饰的脂质体可经RCA120诱导产生凝集效应.结论:采用酶促法成功构建了GalNAc修饰的香豆素-6肝靶向脂质体,以期望显著提高体内肝肿瘤的靶向治疗效果.
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半乳糖化壳聚糖-氟尿嘧啶偶合物的合成与表征
目的 合成肝靶向大分子前药半乳糖化壳聚糖-氟尿嘧啶偶合物(CC-FUA).方法 将乳糖酸以酰胺键偶合到壳聚糖(CS)上,得到半乳糖化壳聚糖(GC),再将经溴乙酸修饰的5-氟尿嘧啶(FUA)键合到GC上,得到目标产物GC-FUA,通过NMR和FT-IR对结构进行表征,并用1H-NMR测定乳糖酰基取代度(DSGC)和FUA取代度(DSFUA).结果 通过控制反应条件得到了乳糖酰基取代度不同的高分子载体GC,以及FUA取代度不同的偶合物GC-FUA.结论 成功地合成了肝靶向大分子前药GC-FUA.
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去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向脂质体配体的酶促催化合成研究
目的 用酶促催化乳糖酸与十八胺合成一种可用于镶嵌脂质体表面的去唾液酸糖蛋白靶向配体修饰物.方法 通过红外光谱(IR)、质谱(ESI-MS)和核磁共振(1H-NMR)对产物结构进行确证,并对酶种类、反应介质、酶的加入量、底物摩尔比、反应温度等影响因素进行考察.结果 二甲基亚砜作为反应介质；Novozym 435固定化脂肪酶作为催化剂、酶加入量为400U·mL-1、乳糖酸和十八胺的摩尔比为2:1、40℃下反应24 h,十八胺的转化率可达99％以上.结论 酶促催化法可用来合成肝靶向脂质体配体.
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有机相脂肪酶催化合成脂质体修饰物胆固醇癸二酸单烯酯
目的 在非水相中利用酶法合成胆固醇癸二酸单烯酯,并对其优合成工艺条件进行研究.方法 利用TLC、MS和NMR法对合成产物进行结构鉴定;通过正交试验对合成处方工艺进行优化.结果 佳反应条件为胆固醇与癸二酸二乙烯酯物质的量之比为1:6,Candida rugosa Lipase 10 mg/mL,异辛烷5mL,温度35℃,反应时间24 h.结论 该条件下酯化率可达95％以上.
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酶促合成3种半乳糖-胆固醇配体及其与肝靶向性的构效关系研究
目的 酶促法构建3种不同类型的半乳糖-胆固醇配体修饰的阿霉素(doxorubicin,DOX)脂质体,研究其在小鼠体内的药动学及组织分布特征.方法 利用脂肪酶在非水相中合成了3种不同结构的半乳糖-胆固醇配体:CHS-C8-GalNAc、CHS-C8-GAL、CHS-C8-LA;利用MS、NMR鉴定产物结构;采用薄膜分散-梯度载药法制备DOX脂质体并对其理化性质进行表征;以小鼠为实验对象,采用尾iv给药,通过比较3种配体修饰的DOX脂质体在小鼠体内的药动学与组织分布特征来阐明配体中半乳糖基的结构与去唾液酸糖蛋白受体之间的构效关系.结果 产物经MS、NMR鉴定均为目标产物,产率均＞90％;采用薄膜分散-梯度载药法制备的DOX脂质体粒径＜90 nm,PDI＜0.1,包封率＞99％,24 h渗漏率＜5％,Zeta 电位接近于0;3种配体分子对肝脏亲和力大小依次为CHS-C8-GalNAc＞ CHS-C8-LA ＞CHS-C8-Ga1;肝脏对CHS-C8-GalNAc修饰的脂质体的摄取几乎完全被预注射的asialofetuin所抑制(P＜0.01),而对CHS-C8-Gal及CHS-C8-LA修饰的脂质体无显著的抑制效果(P＞0.05).结论 含有N-乙酰半乳糖胺基(N-acetylgalactosamine,GalNAc)为末端的配体分子能被去唾液酸糖蛋白受体高效识别,而含有D-半乳糖基(D-galactose,Gal)或乳糖醇基(lactitol,LA)为末端的配体分子易被肝枯否细胞上的半乳糖粒子受体所竞争性结合.
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肝靶向性聚集超声分子显像的实验研究
去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是哺乳动物肝实质细胞特有的高效内吞受体,肝细胞表面ASGPR的量与肝功能状态明显相关,在肝细胞损害时,其表面的ASGPR会相应减少[1],该指标可以直接反映肝的储备功能.实验中针对ASGPR这一受体,将靶向纳米脂质微囊液态氟烷超声造影剂团注入正常大鼠体内,观察该靶向超声造影剂对正常大鼠的肝特异性显影,为超声造影在体评价肝功能提供实验依据.
