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儿童癫痫患者外周血B淋巴细胞CD20的表达
目的 探讨癫痫患儿外周血B淋巴细胞CD20表达的变化与癫痫发作的关系.方法 应用流式细胞仪测定本院2008年1月至2010年12月就诊的620例儿童癫痫患者外周血B淋巴细胞CD20的表达,并与健康对照组(n=36)进行比较.同时分析96例儿童癫痫患者(症状性癫痫患者37例,特发性癫痫患者59例)应用静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗前后的B淋巴细胞CD20表达的改变,并评价IVIG治疗各型癫痫的有效率.结果 癫痫儿童外周血B淋巴细胞CD20+比例较健康对照组明显升高[(21.50±8.41)％比(16.13±4.19)％,P＜0.05].96例儿童癫痫患者经IVIG治疗6个月后外周血B淋巴细胞CD20+细胞比例较治疗前下降[(16.74±5.12)％比(21.61±8.03)％,P＜0.05].IVIG治疗癫痫总体有效率为76.04％(73/96),症状性癫痫治疗有效率为86.49％ (32/37),特发性癫痫治疗有效率为69.49％(41/59).结论 儿童癫痫患者存在B淋巴细胞功能异常,IVIG治疗能改善癫痫患儿的细胞免疫功能.
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CAR技术在多发性骨髓瘤治疗领域的研究进展
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是在B淋巴细胞分化为浆细胞过程中因遗传基因发生突变所致的血液系统恶性肿瘤,化疗是目前主要治疗的手段;随着蛋白酶体抑制剂等药物的开发,患者的总体生存率得到了提高,但耐药等因素仍然会导致治疗的失败.嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T淋巴细胞治疗是近5年来肿瘤过继免疫治疗的新方法,通过基因修饰的手段,使T细胞能够能特异性识别靶抗原,并以非组织相容性抗原(major histocompatibility complex,MHC)限制性的方式杀伤靶细胞,从而产生特异性的杀伤作用.目前,CAR-T治疗越来越被人们所关注,尤其在B系来源的白血病和淋巴瘤中取得了惊人的成绩.然而,就多发性骨髓瘤的CAR技术治疗而言,未见系统的文献复习.因此,本文就可查阅到的以不同靶点的CAR技术在多发性骨髓瘤体内及体外实验中所获得的研究成果作一综述.
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健康成人外周血B淋巴细胞流式细胞术免疫表型分析:慢性B细胞白血病/淋巴瘤诊断参考值
本研究建立中国健康成人外周血B淋巴细胞各种免疫标志的参考范围,为临床正确诊断B淋巴细胞增殖性疾病提供基础信息.采用全血溶RBC法和SSC/CD19设门技术以三色流式细胞术对来自41名健康成人EDTA-K2抗凝静脉血进行免疫表型分析.结果表明: 外周血B淋巴细胞几乎全部表达CD22,CD20,CD62L,CD40,CD24,CD79b,CD79a和FMC-7分子,几乎不表达CD11a,CD80,CD103,CD10,CD40L,CD54,CD95L,CD86和CD95分子,CD18,CD44,CD23,CD5,CD11c和CD43的阳性率各不相同,78%的B细胞为IgD阳性、κ/λ比例为1.26.结论:为了对患者的免疫分型资料进行准确判读和对B淋巴细胞增殖性疾病作出正确的诊断,必须考虑正常B细胞群体中各种标志的表达情况.同时,在临床工作中不宜直接套用国外的标准,而必须注意中国人和西方人群之间在某些B细胞标志方面可能存在的差异.
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流式细胞术在免疫相关性全血细胞减少症诊断中的临床意义
本研究探讨流式细胞术检测在诊断免疫相关性全血细胞减少症(immonorelated pancytopenia,IRP)的临床意义.50例全血细胞减少症患者入院后进行了血清铁蛋白(SF),叶酸(FA)及维生素B12浓度,免疫学检查,血小板抗体,乙肝六项,甲肝及丙肝抗体、溶血相关检查、骨髓涂片及染色体核型分析等常规检查.50例患者分为A组(未明确诊断组)和B组(明确诊断组),另设正常对照组(30名正常人).A组:22例拟诊为IRP.B组:28例恶性血液病患者,其中再生障碍性贫血7例、阵发性睡眠性血红蛋白尿2例、骨髓增生异常综合征10例、巨幼细胞性贫血9例.对照A组和B组均采用流式细胞术测定骨髓造血干/祖细胞、有核红细胞、髓细胞结合的自身抗体,同时检测外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞的比率.时正常对照组仅进行外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞的比率检测.结果表明:A组22例拟诊免疫相关性全血细胞减少症患者中20例骨髓自身抗体检测结果阳性,阳性率为90.90%.抗体结合类型以IgG型多见,其次为IgM型,IgA型较少;B组中2例骨髓自身抗体检测结果阳性,阳性率为7.14%.前者抗体检出率显著高于后者(p<0.01).A组外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比例显著高于B组及正常对照组(P<0.01),后两组相比无显著差异(P>0.05).结论:利用流式细胞术进行骨髓造血细胞自身抗体及外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞的检测能为免疫相关性全血细胞减少症的诊断提供可靠的依据,为全血细胞减少症的鉴别诊断提供了更多的检测手段,而且还有利于制定更有效的治疗策略.
关键词： 流式细胞术 全血细胞减少症 免疫相关性全血细胞减少症 自身抗体 B淋巴细胞 -
共刺激信号分子对免疫性血小板减少症患者B淋巴细胞免疫功能的影响
目的:探讨共刺激信号分子(CD80、CD86)的表达对免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血B淋巴细胞数量及功能的影响.方法:选取初诊ITP患者30例、完全缓解ITP患者25例为研究对象,健康志愿者25例为正常对照者.采用流式细胞术检测CD19+ CD5+、CD19+ CD80+、CD19+ CD86+、CD41a+IgG、CD41a+IgM及CD19+B细胞内IgG和IgM的表达,并与ITP患者的临床指标进行相关性分析.结果:初诊ITP患者B1(CD19+ CD5+)细胞数均显著高于完全缓解组和健康对照组(P＜0.05).初诊组ITP患者CD19+ CD80+细胞数均明显高于完全缓解组和健康对照组(P＜0.05).初诊组ITP患者CD19+B胞内抗体IgG和IgM表达水平均明显高于完全缓解组和健康对照组(P＜0.05).治疗后完全缓解组ITP患者IgG和IgM的表达水平均明显低于治疗前水平(P＜0.05),难治组ITP患者治疗前后IgG和IgM表达水平无统计学差异(P＞0.05).CD19+ CD80+细胞数与Thl的表达水平及Thl/Th2的比例呈正相关(r=0.502,r=0.471,P＜0.05).CD19+ CD80+细胞数与IgG和IgM表达水平呈正相关(r =0.552,r =0.467,P＜0.05),与外周血血小板计数呈负相关(r=-0.424,P＜0.05).IgG和IgM表达水平与血小板计数呈负相关(r=-0.658,r=-0.526,P＜0.05).结论:ITP患者外周血CD19+B细胞共刺激信号增强,导致B淋巴细胞异常活化,介导免疫系统发生紊乱,参与ITP发病.
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长链非编码RNA NONHSAT040475在健康人外周血白细胞中的表达分布
目的:探讨长链非编码RNA NONHSAT040475 (long noncoding RNA,lncRNA NONHSAT040475)在健康人外周血白细胞亚群中的表达分布情况.方法:采集10例健康志愿者的新鲜外周血,利用流式细胞分选法纯化分选CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD56+ NK细胞及粒细胞,利用定量PCR方法检测lncRNA NONHSAT040475在健康人白细胞各亚群中的表达分布情况.结果:lncRNA NONHSAT040475在健康人白细胞各亚群中均有不同程度表达,其中在B淋巴细胞中表达相对较高,在T淋巴细胞和NK细胞及粒细胞中表达均相对较低(P＜0.01).结论:lncRNA NONHSAT040475在健康人外周血白细胞各细胞亚群中广泛表达,并且主要表达于B淋巴细胞.
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重组CYP2D26主要B细胞表位在Ⅱ型自身免疫性肝炎小鼠模型构建中的效应研究
目的 研究在大肠杆菌中以重组病毒样颗粒形式表达的人Ⅱ型自身免疫性肝炎标志蛋白 CYP2D6主要抗原表位aa262-270免疫小鼠后对构建小鼠自身免疫性肝炎模型的效应.方法 设计人Ⅱ型自身免疫性肝炎标志蛋白主要抗原表位aa262-270 (WDPAQPPRD)的下负链寡核苷酸片段,经退火后插入表达乙肝核心蛋白 HBcAg的质粒pNP中(pNP质粒由pThioHisA质粒插入HBcAg基因片段构建而成).构建成质粒pNP-AIH2;转染大肠杆菌DH5α感受态细胞；以IPTG诱导重组蛋白表达,经硫酸铵沉淀、洗涤,密度梯度离心纯化和脱盐后,肌肉注射免疫小鼠3次,以ELISA和western blot检测免疫后小鼠特异性抗体的产生和水平,通过转氨酶检测和肝脏石蜡切片HE染色观察炎症反应.结果 SDS-PAGE结果显示重组菌诱导表达的目的蛋白分子量为19kD,与预期相符;电镜证实其以可溶性的病毒样颗粒形式存在;ELISA显示,免疫小鼠血.清与包被的肝脏匀浆蛋白特异反应,检测到持续存在的特异抗体,滴度至少为1∶2000; western blot检测表明,抗血清在分子量约为55 kD的地方产生了一个特异的条带,与小鼠CYP2D6蛋白大小一致.与正常对照相比,实验组小鼠转氨酶水平未明显升高,肝切片HE染色没有观测到明显的病理特征.结论 携带人Ⅱ型自身免疫性肝炎标志蛋白 CYP2D26主要表位的病毒样颗粒免疫小鼠后,可刺激产生较强的特异抗体水平,但在观测时间内,未见诱导小鼠产生明显的肝脏炎症反应.
关键词： 肝炎 自身免疫性 表位 B淋巴细胞 细胞色素P450 CYP2D6 -
滤泡型淋巴瘤中t(14;18)染色体易位的分析及其临床意义
目的 探讨滤泡型淋巴瘤(FL)的分子遗传学特征及其在病理诊断中的意义.方法 收集55例FL石蜡标本,对照组小B细胞淋巴瘤28例和反应性滤泡增生(RFH)10例,应用套式PCR技术检测FL中,免疫球蛋白重链基因(IgH)的克隆性重排;应用标准PCR技术检测55例FL中t(14;18)易位,以10例RFH做对照;采用双色荧光原位杂交(FISH)技术检测20例淋巴结FL中t(14;18)易位,以4例RFH作为对照;并与PCR检测结果进行比较.结果 (1)55例FL中,结内49例,结外6例.男性33例,女性22例,男女比为1.5∶1.发病年龄36～79岁(中位年龄57岁);FL分级:FL1～3分别为25例、19例和11例.(2)55例中50例(90%)检出β-肌动蛋白(actin),该50例中FR3A阳性24例(48%),FR2阳性25例(50%),其中15例(30%)呈FR3A和FR2双阳性,共34例(68%)IgH基因重排.对照组小B细胞淋巴瘤28例中,25例检出β-actin,其中FR3A阳性18例(64%),FR2阳性17例(61%),共24例(86%)可检测出克隆性IgH基因重排.4例RFH均未检出IgH基因重排.(3)在44例结内FL中检出15例(34%)t(14;18)易位,其中14例在MBR,1例在mcr.(4)20例中,有16例(80%)可检出t(14;18)易位.结论 (1)IgH克隆性重排在FL中的检测率比其他小B淋巴细胞低.(2)FISH检测石蜡包埋组织中t(14;18)易位有助于FL的诊断.FISH比PCR的敏感性更好,操作简便,可用于检测石蜡包埋组织中的分子遗传学改变.
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滤泡树突细胞及Ki-67分布方式在小B细胞淋巴瘤鉴别诊断中的意义
目的 观察在不同类型小B细胞淋巴瘤(SBL)中滤泡树突细胞(FDC)网架的破坏情况和FDC分布特征,结合Ki-67阳性指数高低和分布方式存在的差异,探讨其在SBL鉴别诊断中的价值.方法 回顾性研究北京大学肿瘤医院2008年11月至2012年6月间诊断的68例SBL,观察CD21及CD23免疫组织化学染色显示的FDC网架破坏情况、分布形式及Ki-67阳性指数及分布形式.使用统计学软件分析其与不同SBL类型的关系.结果 68例患者年龄28 ～ 85岁,平均55.2岁；男女比1.2∶1,发病部位为淋巴结内55例(80.9％),结外13例(19.1％).复习并依据2008 WHO造血与淋巴组织肿瘤分类标准确诊病理诊断:低级别滤泡性淋巴瘤(FL,1级和2级)22例,边缘区淋巴瘤(MZL) 19例,套细胞淋巴瘤(MCL) 17例,以及慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)10例.在FL中CD21及CD23标记的FDC网架是以中心破坏为主,发生比例占90.9％(20/22).而在MZL中则以FDC网架周边结构破坏为主,为14/19；在CLL/SLL则表现为散在个别FDC或者无FDC网架；对于MCL,有7/17的病例表现为散在个别FDC或者无FDC网架,另有7/17的MCL出现了FDC的不规则网状增生.FDC网架按照破坏及分布情况在不同的淋巴瘤分型中差异具有统计学意义(P＜0.01).Ki-67显示的肿瘤细胞增殖活性在4种不同SBL间差异也具有统计学意义(P＜0.05),增殖活性从高到低依次为:MCL、FL、SLL、MZL.Ki-67在FL病例可以看到滤泡中心散在表达且极向消失,MZL病例中可见残余生发中心外的肿瘤较为一致散在表达,而且两者均普遍低于残留非肿瘤性生发中心的阳性指数；在MCL中可见较为一致的分布,但个体间阳性指数差异较大(5％～90％)；在CLL/SLL病例中肿瘤的“增殖中心”Ki-67呈灶状增高.结论 通过常规使用CD21和CD23免疫组织化学染色,显示FDC网架的破坏情况,并联合Ki-67显示细胞的增殖活性,观察两者分布形式,对于明确区分各种类型的SBL具有鉴别意义.
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经典型Richter综合征转化前后IgVH基因克隆重排及突变分析
目的 检测经典型Richter综合征的IgVH基因克隆重排及突变状态,分析转化前后IgVH基因的分子特征及其与预后的关系,并对可能涉及的分子机制进行初步探讨.方法 用基因扫描和测序分析IgVH基因.另外用免疫组织化学LAB-SA法检测两种肿瘤中zeta链结合蛋白激酶70(ZAP70)、p53、干扰紊调节因子(IRF)-4等可能潜在危险因子的表达,并结合随访资料进行生存率分析,筛选危险因子.结果 (1)B-CLL/DLBCL克隆相关(18/23,78.3%),克隆不相关(5/23,21.7%);(2)在16例克隆相关中,12例转化前B-CLL及转化后DLBCL携带未突变IgVH基因;(3)转化前后IgVH基因使用是非随机的,在克隆相关的病例中,B-CLL/DLBCL常使用VH3-23、VH3-74、VH1-2,各占11.1%;(4)转化后DLBCL仅部分表达CD5(32.1%)和CD23(14.3%)及ZAP70(23.8%),绝大多数表达p53(80.6%)和IRF-4(82.6%);(5)17例转化后DLBCL患者中位生存时间为7个月;(6)统计学分析生存时间与B-CLl/DLBCL转化前后克隆相关与否、IgVH基因的突变状态、ZAP70、p53、IRF-4的表达不相关.结论 (1)转化后DLBCL中克隆相关与克隆不相关的比例为2:1;(2)克隆相关的DLBCL多由携带未突变型IgVH基因的B-CLL患者转化而来;(3)发生转化的B-CLL中IgVH基因使用的偏向性提示了抗原在转化中的可能作用;(4)转化后DLBCL与普通DLBCL在IgVH基因的使用、突变状态,免疫表型及预后的不同,提示其可能是一种新的DLBCL亚类.
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伴有MYC、bcl-2和bcl-6基因重排的高级别B细胞淋巴瘤的临床病理特征
目的 探讨伴有MYC、bcl-2和bcl-6基因重排的高级别B细胞淋巴瘤(HGBL)的临床和病理学特点.方法 应用双色分离探针MYC、bcl-2和bcl-6对2016年1月至2017年4月中国医学科学院 北京协和医学院血液病医院收集的158例B细胞淋巴瘤患者的石蜡组织切片进行荧光原位杂交(FISH)检测,并结合临床病理资料进行分析.结果 158例B细胞淋巴瘤中MYC、bcl-2和bcl-6基因重排的HGBL为3例,1例合并CCND1/IgH阳性.3例均为中老年男性,多部位受累,乳酸脱氢酶(LDH)水平升高,Ann Arbor分期均为Ⅳ期;2例行高强度化疗,未缓解,生存期分别为9个月和11个月;1例未治疗,正在随访中.3例具有不同形态谱系,初诊分别为淋巴母细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤.免疫表型检测示2例为生发中心B细胞型,1例为非生发中心B细胞型,Ki-67染色示3例均具有较高的增殖指数(60%~90%).结论 伴有MYC、bcl-2和bcl-6基因重排的HGBL侵袭性强,以多器官受累为主,分期晚,疗效差.需要结合病理组织学和FISH检测确诊,并需要与多种淋巴瘤鉴别.其生存期短,需要早期诊断与强化治疗.
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骨髓间充质干细胞对异体外周血B淋巴细胞的免疫调节作用
目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)在体外对异体外周血B淋巴细胞的免疫调节作用.方法 用密度梯度离心法从骨髓中分离、培养MSC,从外周血中分离单个核细胞,L-亮氨酸甲酯去除单核细胞,以2-氨乙基硫脲溴化物(AET)处理绵羊红细胞(SRBC)的花环形成法,去除T淋巴细胞获得纯化的B淋巴细胞.用羊抗人IgM单克隆抗体(anti-IgM)刺激与或未与MSC或其培养上清共培养3d的B淋巴细胞,应用MTT法测8淋巴细胞的增殖,ELISA法测培养上清中免疫球蛋白IgG、lgM的产生,应用流式细胞术分别检测与MSC共培养24、48h后B淋巴细胞的凋亡.结果 MSC及其培养上清抑制由anti-IgM诱导的B淋巴细胞的增殖和分泌IgG、IgM,且随着MSC细胞数量及其培养上清浓度的增加,这种抑制越明显.流式细胞术结果显示,与MSC共培养不同时间的B淋巴细胞的凋亡变化无统计学意义,MSC抑制B淋巴细胞的增殖存在暂时性和可逆性.结论 MSC对异体外周血8淋巴细胞存在免疫调节作用,并且这种调控机制是复杂的,不仅与MSC细胞数量有关,还与细胞间的相互作用和MSC分泌的细胞因子有关.
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人类B细胞转化为抗体分泌浆细胞的体外研究
目的 体外示踪不同刺激条件下人类B细胞转化为抗体分泌浆细胞的能力.方法 对5名健康自愿者采用B细胞阴性选择磁珠分离法分离和体外培养B细胞,观察4种培养条件下(培养液对照组、PWM组、细胞因子组及PWM+细胞因子组)、不同时间点B细胞转化为抗体分泌浆细胞的能力.采用双荧光标记(FTTC-CD27、PE-CD38)流式细胞技术监测B细胞4种表面标志物的动态变化;采用酶联免疫法(ELISA)测定不同时间点培养上清液中Ig浓度;采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定不同时间点抗体分泌B细胞数.结果 B细胞产生抗体浓度明显与培养条件有关.PWM刺激的B细胞培养上清液中Ig浓度高(P=0.003);PWM+细胞因子组次之;细胞因子组与对照组差异无统计学意义.流式细胞分析结果显示,培养第7天浆细胞前体达峰,第10天浆细胞百分率达峰.活细胞数以细胞因子组多,培养10 d后仍呈增殖状态;而PWM组很快下降.ELISPOT法测定的Ig分泌B细胞数也以PWM组佳,:PWM+细胞因子组次之.结论 从Ig产生能力看,以PWM组佳;从细胞增殖和浆细胞的存活来看,以细胞因子组佳.表明体外诱导B细胞产生抗体不仅需要有效的刺激原,同时还需要必需的细胞因子信号促使细胞增殖和维持细胞的存活.
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编码人分化抗原5C5全长cDNA的克隆及功能初探
目的 编码5C5分化抗原全长cDNA的克隆及功能探索.方法 构建人活化B细胞株3D5细胞的λgt11 cDNA文库,以核苷酸杂交法从cDNA文库中筛选阳性克隆,作核苷酸序列分析,编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析,Northern blot测5C5 mRNA转录本长度,用RT-PCR检测5C5 mRNA在不同细胞株的表达,观察单抗5C5-G1对3D5细胞增殖的影响.结果 从人活化B细胞株3D5的λgt11 cDNA文库筛选到长905bp的5C5-1 cDNA及754bp的5C5-2 cDNA.5C5-1 cDNA序列内有1个开放阅读框架(19～537bp),编码179个aa的蛋白质.此蛋白质内有一穿膜螺旋结构(94～114aa),其N端在胞内.5C5-2 cDNA从163到459为开放阅读框架,编码99个aa的蛋白质.从Northern blot见0.9kb左右和0.7kb左右2条杂交带.由RT-PCR见5C5 mRNA在3D5细胞强表达,在Daudi细胞表达次之,在Jurkat细胞表达弱.单抗5C5-G1有增强cpBCGF诱导3D5细胞增殖的作用.结论 长905bp的5C5-1 cDNA为1个全长cDNA.编码1个膜蛋白,可能参与3D5细胞的增殖反应.
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Anti-IgM诱导人B淋巴瘤Daudi细胞凋亡的信号传导通路
目的研究B细胞抗原受体（BCR）介导的细胞凋亡，探索其可能的信号传导通路，阐明B细胞凋亡的分子机制。方法 3H掺入法检测细胞生长，应用FACS方法分析细胞周期和细胞凋亡。Western blot检测anti-IgM刺激引起Daudi细胞信号分子的变化。结果 anti-IgM可导致人B淋巴瘤Daudi细胞发生凋亡。细胞凋亡的数量与anti-IgM浓度呈正相关。Western blot结果显示,anti-IgM刺激引起Daudi细胞内酪氨酸蛋白分子磷酸化水平的变化速度与浓度相关；但随时间的延长，变化状况趋于稳定；在48～72*!h，许多被激活的、呈现磷酸化的酪氨酸蛋白分子又回复到低磷酸化或去磷酸化的静止状态。另外，虽然JNK1和ERK2蛋白水平未发生明显改变，但JNK/SAPK的重要下游分子之一，c-Jun的蛋白表达水平及其63和73位点的丝氨酸磷酸化水平立即升高并维持在高水平状态。结论 anti-IgM刺激激活JNK/SAPK，JNK/SAPK通路可能参与了anti-IgM引起的Daudi细胞的凋亡过程。
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CD154(CD40L)诱导人Ramos B淋巴细胞株中转录因子NF-κB活化研究
目的对CD40配体CD154(CD40L)在人B淋巴细胞中刺激转录因子NF-κB活化进行研究.方法应用重组CD154刺激EBV/LMP1阴性人Ramos B细胞,观察对NF-κB luciferase(萤光素酶)活化的作用,判断CD154刺激对NF-κB抑制蛋白IκB-α、-β及-ε磷酸化和降解的影响,并对CD154刺激诱导进入细胞核NF-κB亚单位进行分析. 结果 CD154刺激:(1) 导致NF-κB luciferase活性升高,且与CD154剂量正相关; (2) 引起细胞内IκB-α、-β及-ε蛋白总量减少,IκB-α、-β及-ε阳性细胞也明显减少; (3) 主要诱导p50、p65及c-Rel亚单位从细胞浆进入细胞核; (4) 诱导p65磷酸化. 结论在人Ramos B细胞中,CD154通过诱导IκB-α、-β及-ε降解释放p50、p65及c-Rel进入细胞核及p65磷酸化激活NF-κB.
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人扁桃体B淋巴细胞mRNA的差异显示分析及活化B细胞表达的新EST的分离
目的 分离新的B细胞活化基因.方法 采用差异显示反转录PCR技术(DDRT-PCR)对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异显示情况进行分析,对显示片段进行克隆并行Northern分析,对Northern杂交阳性的cDNA片段进行测序并比较同源性.结果 差异显示分析共获得明显差异表达的cDNA片段62条,选择主要表达于活化B细胞上的20条cDNA片段克隆到pGEM-T载体上,并逐一对静止和活化B细胞RNA进行Northern分析,其中6条cDNA片段在活化B细胞中呈Northern杂交阳性且与差异显示情况相符, 对它们进行测序,然后通过国际互联网与GenBank, EMBL和DDBJ的DNA数据库比较序列同源性,发现其中4个克隆与已发现的基因具明显同源性,一个克隆是新的, 另一个克隆虽然与人T细胞分泌的趋化因子I-309同源性达95%,但二者转录本不同.结论 通过DDRT-PCR分离到两个可能为新的B细胞活化基因的cDNA片段,这为进一步克隆新的B细胞活化基因奠定了基础.
关键词： 扁桃体 B淋巴细胞 聚合酶链反应 Northern分析 -
人B细胞活化相关基因BC-1514全长cDNA的克隆与原核表达
目的克隆与B细胞活化相关的新基因及其原核表达. 方法采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析,差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行人活化B细胞cDNA文库的筛选.将所获得的阳性克隆的编码区经PCR扩增后克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,重组质粒经酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌BL-21,以IPTG诱导表达融合蛋白. 结果以在活化B细胞高表达的EST32为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库获得一个新的全长为1?514bp的cDNA克隆(命名为BC-1514).重组的BC-1514蛋白可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,其表达量约占细菌总蛋白量的14.3%左右.BC-1514 cDNA的GenBank的登录号为AF304442. 结论获得了1条新的与B细胞活化相关的cDNA克隆并在E.coli BL-21中得到了有效表达.
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特异性敲除 T 细胞中 Blimp-1 对小鼠脾淋巴细胞数量及功能的影响
目的 研究B淋巴细胞诱导成熟蛋白( Blimp-1)对脾脏淋巴细胞数量及功能的影响.方法 实验小鼠分为T细胞Blimp-1敲除组( Blimp-1CKO)和对照组( wild-type,WT). 获取小鼠脾脏单个核细胞并计数,流式细胞仪检测T、B淋巴细胞各亚群细胞数、比例及其分泌的细胞因子、表面受体CCR7、S1P1表达. 结果 与对照组小鼠相比,Blimp-1CKO小鼠脾脏单个核细胞数,T、B淋巴细胞总数及CD4+T、CD8+T、CD19+CD5+CD1d+B 细胞绝对数均明显升高(P<0.05),Blimp-1CKO 小鼠CD19+CD5+B细胞的数量和比例均显著上升(P<0.01). Blimp-1CKO组CD4+T和CD8+T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-2水平较对照组增高(P<0.05). Blimp-1CKO小鼠CD8+T细胞表面的CCR7表达较对照组降低(P<0.05),而两者S1P1表达水平差异无统计学意义. 结论 Blimp-1对T细胞的数量、亚群平衡、表型、功能的维持都具有重要作用,特异性敲除T细胞Blimp-1对淋巴细胞的影响不仅局限在T细胞,还影响到B细胞亚群.
关键词： B淋巴细胞诱导成熟蛋白 T淋巴细胞 B淋巴细胞 -
丙型肝炎病毒Ⅱ型阳性PBMC永生化细胞株的生物学特性
目的观察丙型肝炎病人外周血B细胞长期存活状态下其中是否仍有丙型肝炎病毒（HCV）存在，探讨建立HCV体外复制细胞模型的可能性。方法利用EB病毒转化B淋巴细胞技术，建立丙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC ）HCV阳性传代细胞株（LCL），并应用细胞培养、染色体显示、流式细胞荧光染色、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化、原位RT-PCR及电镜等技术研究其分子生物学和免疫学特性。结果（1） LCL细胞核型47，XX，+mar，细胞表面CD19、CD20抗原阳性，CD21分子消失。（2）传代培养细胞中HCV RNA正链持续12个月阳性，而培养上清中则呈间断性阳性，无明显规律。HCV RNA负链在LCL细胞中也呈间断阳性。HCV基因分型为Ⅱ型株。（3）免疫组化、原位PCR和电镜发现HCV抗原蛋白、HCV RNA和病毒颗粒均存在于LCL细胞浆中；电镜发现HCV病毒颗粒呈圆球型，双层膜结构，定位于细胞胞质空泡内。直径多为45～70nm，个别为110nm。结论 HCV可以在EB病毒转化病人B细胞株中长期存活、复制和分泌。
