实验用生物样品的啮齿类微生物污染的检测管理
摘要： 实验用生物样品在生物医学研究中有着广泛的应用.生物样品的微生物污染可危及实验动物设施的生物安全以及对动物实验研究造成负面影响.因此在将生物样品接种到啮齿类动物之前,要对其进行检测以确保无啮齿类动物传染性病原体的污染.因为检测技术和经济上的限制和局限性,不可能对所有的啮齿类动物传染性病原都进行检测.本文依据科学文献、笔者的经验以及专家的意见,尝试着去阐述如何建立一个有效可行的生物样品微生物污染检测计划.笔者建议对一些重要的微生物进行检测,并简要综述了选取这些微生物的理由即它们对科研、实验动物生物安全以及职业健康安全的影响.
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生理性衰老小鼠的感染免疫模型建立
目的 生理性衰老导致机体免疫功能下调,进而使老年人群感染免疫应答能力降低,针对新发突发传染病的病原体如重症流感病毒的易感性上升,罹患感染后,临床症状也更严重,预后不佳.因此,本课题组建立一个拟合临床重症流感病毒感染的老年小鼠模型,用于评价老年宿主感染免疫应答特征.方法 采用不同毒力的流感病毒H7N9(高致病性)、H9N2(低致病性)分别滴鼻感染老年C57小鼠(18～24月龄),分析其感染后体重变化和生存情况,并动态检测肺内病毒的复制,炎症因子的表达以及肺的病理损伤.结果 与成年对照组小鼠(6～8周龄)相比,老年小鼠感染H9N2后7天体重下降了30％(成年对照仅下降10％),生存率降低至50％(成年对照为100％).老年小鼠肺内H9N2病毒复制更高(P<0.01),感染后第2天达到峰值(每克肺内RNA病毒拷贝为3.2×104);以炎症因子IL?6、趋化因子MCP?1为代表的肺内炎症过量表达,是成年对照的100～1000倍;肺病理染色提示老年小鼠肺损伤更严重,感染后修复时间更长.结论 成功建立老年小鼠感染模型,在感染生存、肺病毒复制和炎症损伤等方面可以重现临床感染免疫应答的现象.可应用于深入理解老年宿主感染相关的机制研究与抗感染药物评价.
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七氟醚对新生大鼠神经干细胞的增殖作用
目的 研究七氟醚对新生大鼠神经干细胞增殖影响.方法 取出生7 d的SD大鼠48只,体重15～20 g,随机分3组:对照组(Con组)、1％七氟醚组(S1组)、3％七氟醚组(S2组).S1组和S2组分别吸入1％、3％七氟醚4 h.各组新生鼠麻醉开始前腹腔注射5-溴脱氧尿苷100 mg/kg,于麻醉结束后6 h处死大鼠并分离脑室区和脑室下区组织.采用免疫组化法进行Nestin与BrdU染色,计算检测脑室区和脑室下区神经干细胞增殖率;Western blot法检测Nestin、Cyclin D1、BMP2、Smad4蛋白的表达.结果 与对照组比较,S1组和S2组大鼠脑室区和脑室下区组织Nestin蛋白表达降低、神经干细胞增殖率降低,Cyclin D1表达下降,BMP2、Smad4表达上调(P<0.05).结论 七氟醚可抑制新生大鼠神经干细胞的增殖,其机制可能与Cyclin D1、BMP2、Smad4蛋白表达变化有关.
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聚吡咯/聚乳酸生物材料联合骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的基础研究
目的 研究聚吡咯(polypyrrole,PPy)/聚乳酸(PLA)/骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)复合治疗脊髓损伤的可行性,并探讨其可能机制.方法 制备聚吡咯/聚乳酸支架材料.从大鼠骨髓中分离、培养BMSCs;制作大鼠脊髓全横断模型,在T8水平脊髓头尾端完全横断脊髓,用虹膜剪刀去除长度约2.5 mm的脊髓组织.根据植入材料的不同将实验分为PPy/PLA组、PPy/PLA/BMSCs组及损伤组,损伤组无材料及细胞植入.术后6周处死大鼠,观察不同移植组体内轴突和血管生长情况.结果 免疫荧光、电镜及qPCR结果证实复合移植可以显著促进轴突和血管生长,同时也提供了神经保护作用.结论 PPy/PLA/BMSCs 可以促进大鼠脊髓损伤修复,其机制可能包括材料支架作用和BMSCs在体内促进血管生成,改善局部的微环境,因此促进新轴突生长而保护局部的神经元.
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CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用
目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法.方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008～2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照.结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝.标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432％.对1344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本.TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min.结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测.
关键词： CAR菌 16S rRNA基因 小沟结合物探针 实时荧光定量PCR 快速检测 -
参乌胶囊及其有效成分二苯乙烯苷对老年大鼠海马区神经生长因子及其受体表达的影响
目的 观察本室自行研制的中药新复方参乌胶囊(SW)及其有效成分何首乌四羟基二苯乙烯苷(TSG)对老年大鼠海马区神经生长因子(NGF)及其受体表达的影响.方法 老年SD大鼠从21月龄始,分别灌胃给予SW低、高剂量(0.8g/kg、1.6 g/kg)和TSG低、高剂量(0.03 g/kg、0.06 g/kg)至24月龄.以6月龄大鼠为青年对照,未给药的24月龄大鼠为老年对照.应用实时定量PCR方法检测大鼠海马区NGF及其受体TrkA的mRNA表达水平,免疫组织化学染色和Western blot方法检测海马区NGF及TrkA表达水平.结果 从基因和蛋白质水平观察到,老年大鼠海马区NGF及其受体TrkA的mRNA表达和蛋白表达明显降低.老年大鼠灌胃给予SW能够上调其海马区NGF mRNA和TrkA mRNA水平；SW和TSG对NGF蛋白表达有明显的增高作用,高剂量SW和TSG对TrkA表达的上调作用显著.结论 SW和TSG能够增高老年大鼠海马区NGF及其受体水平,提示它们可作用在神经元信号转导通路的起始端,有利于提高神经元的存活和功能.
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不同品系大鼠RTI基因抗原表达数量的研究
目的 研究不同品系大鼠RT1A、RT1B和RT1D基因表达的抗原总数量,以及在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞上表达的数量,为免疫学研究提供数据支持.方法 采集四种品系BN、Lewis、F344、SHR大鼠的静脉血,制备淋巴细胞,与有荧光标记的单克隆抗体反应,应用流式细胞术检测抗原数量.结果 发现RT1A、RT1B和RT1D基因表达的抗原在不同品系大鼠体内表达的数量不同,其中F344大鼠表达的RT1A抗原多,BN大鼠表达的RT1B抗原和RT1D抗原均为多.RT1A、RT1B和RT1D基因表达的抗原在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞上表达的数量也不同,Lewis大鼠在CD4+ T细胞上表达的RT1A抗原多,BN大鼠在CD4+ T细胞上表达的RT1B和RT1D抗原多.F344大鼠在CD8+ T细胞上表达的RT1A抗原多;F344大鼠在CD8+ T细胞上表达的RT1B和RT1D抗原多.同一品系大鼠之间雌雄动物RT1A、RT1B和RT1D基因表达的抗原也不同.结论 不同品系大鼠RT1A、RT1B和RT1D基因的抗原总表达数量之间差异有显著性,在CD4+ T细胞上和CD8+ T细胞上表达的数量差异也有显著性.
关键词： 主要组织相容性复合体 RT1基因 疾病模型 -
食蟹猴与猕猴血液生理和生化指标的比较
目的 检测食蟹猴和猕猴血液生理、血液生化指标,分析食蟹猴和猕猴的生物学特性,初步建立食蟹猴和猕猴的常规血液生理生化检测指标.方法 用日本光电MEK-5126K血球计数仪(动物芯片)、配套试剂盒检测及人工涂片染色镜检血液生理指标;贝克曼全自动生化分析仪CX5型分析血液生化指标.并对食蟹猴和猕猴猴雌雄之间及食蟹猴和猕猴之间进行比较.结果 猕猴AST/ALT;食蟹猴的嗜酸性细胞、ALP、CK、GGR、CREA雌雄之间差异显著.食蟹猴与猕猴之间WBC、MCH、MCHC、嗜酸、单核、ALB、ALB/GLB、AST、AST/ALT、CK、LDH、GGR、CREA差异显著,其它指标差异不显著.结论 初步建立了猕猴和食蟹猴的常规生物学数据,为评价食蟹猴和猕猴的生物学特性提供一定的数据基础,为其应用提供数据参考.
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恒河猴脊髓半断模型行脑和脊髓fMRI检查麻醉方案的实验研究
目的 为需要进行核磁共振扫描的恒河猴及其他大型实验动物提供一种简捷、迅速、安全的麻醉方法.方法 采用军事医学科学院实验用恒河猴7只,均为雌性,体重4-7 kg,采用基础+持续静脉麻醉(氯胺酮+丙泊酚)基础麻醉应用氯胺酮10 mg/kg,im,待猴入睡后开放静脉建立持续静脉通道,三通连接丙泊酚200 mg/100mL 0.9％氯化钠注射液,丙泊酚以0.3 mg/kg/min持续输注,氯胺酮1 mg/kg/30 min间断给予.fMRI中将恒河猴置于特制的实验架上并将门齿托起以保持呼吸道通畅,试验中监测呼吸、心率、角膜反射及瞳孔状态.结果 共进行实验44次,未发生动物躁动、呼吸抑制、心律失常、动物死亡等严重并发症,实验中恒河猴心率、呼吸维持平稳,整个实验顺利完成.实验结束停药后,实验动物很快清醒,并安全返回.结论 在较长时间的核磁共振恒河猴实验中氯胺酮基础麻醉+丙泊酚持续静脉麻醉是一种全新的安全、便捷,实用的麻醉方式.
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雪貂感染流感病毒H3N2动物模型的建立
目的 建立甲型流感病毒H3N2感染的雪貂动物模型.方法 按实验要求筛选出流感抗体反应阴性的雪貂,经兽用氯胺酮轻度麻醉后进行滴鼻感染H3N2流感病毒株A/Brisbane/10/07,设立两个稀释度106和107TCID50,每个稀释度接种3只雪貂,感染后第5天安乐处死.感染前采集鼻甲骨活检,感染后1～5 d鼻甲骨活检检测病毒载量,每天记录雪貂一般临床变化.处死时取雪貂肺、肝、脾、小肠、脑组织作病毒滴度检测,肺组织做病理检查.结果 106和107TCID50的H3N2病毒分别感染雪貂,没有雪貂死亡.雪貂感染后都出现一过性的体温升高,体重的下降,流涕、打喷嚏等症状.在鼻甲骨活检物中可测到病毒载量,肠组织可分离到病毒.肺组织以轻度性间质性肺炎为主要病理变化.结论 雪貂感染H3N2病毒株A/Brisbane/10/07后,临床表现、病毒学、分子生物学、病理学方面的检测都可以证实雪貂感染H3N2病毒动物模型已建立,其中106TCID50病毒滴度的是一个建立感染动物模型比较合适的剂量.
关键词： A/Brisbane/10/07 H3N2 雪貂 模型 动物 -
结核病生物诊断试剂豚鼠模型建立
目的：建立结核病生物诊断试剂模型。方法通过在豚鼠腹股沟皮下单次和多次注射不同剂量灭活H37 Rv全菌体，制备结核病生物诊断试剂模型，采用0.1 mL（5 IU）标准结核菌素（ TB-PPD）对模型效果进行评价。结果三组剂量（0.2 mg/mL，0.3 mg/mL和0.5 mg/mL）致敏豚鼠均能建立模型，其中0.2 mg/mL剂量组皮试后24 h和48 h红斑纵横径值均大于0.3 mg/mL和0.5 mg/mL剂量组，致敏效果好；多次致敏皮试红斑纵横径值与单次致敏比较无显著差异；第1次皮试后24 h红斑纵横径值大于第2次、第3次和第4次皮试后红斑纵横径值（P≤0.05）；此外，灭活H37Rv全菌体致敏后，豚鼠体重持续增加，部分豚鼠注射部位有溃烂发生。结论应用0.2 mg/mL灭活H37 Rv全菌体单次致敏豚鼠，可以建立良好的用于结核病生物诊断试剂评价的模型。增加致敏剂量和致敏次数不能增加变态反应强度。
