基因探针和PCR方法在菌痢流行病学研究中的应用

目的探讨基因探针和PCR方法在F2a志贺氏菌痢暴发的流行病学研究中的意义.方法对43株自患者粪便和食物中分离到的F2a志贺氏菌进行16srRNA、ipaH基因Southern杂交,随机PCR和set1/set2毒力基因PCR分析.结果随机PCR、ipaH基因Southern杂交将43株F2a志贺氏菌分为两个不同的基因型,set1/set2毒力基因PCR分为三个不同的基因型,16srRNA基因Southern杂交均为同一基因型.结论基因分型方法能更准确、深入地揭示菌痢暴发过程中各分离株之间的流行病学联系.其中set1/set2毒力基因PCR方法具有较高的分辨率,在F2a志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要的作用.

狂犬病固定毒Vero细胞适应株3aG-V的生物学特性研究

对狂犬病固定毒Vero细胞适应株3aG-V的生物学特性进行了研究,包括病毒的形态、抗原结构、培养条件、致病性、免疫原性、纯毒试验及其在中枢神经系统是否形成尼氏小体检查.结果表明狂犬病病毒3aG-V 株具有抗原性好,培养产毒量高,保持有aG固定株弱毒性、传代稳定、无变异,可作为替代地鼠肾细胞狂犬病疫苗aG毒株,用于Vero细胞培养病毒生产出毒液毒力高,灭活后效力高,安全性好的纯化Vero细胞狂犬病疫苗的生产用疫苗株.

华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达

目的构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因重组质粒,分析其编码序列,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定. 方法根据RPEF基因已知序列设计一对引物,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段;将目的基因PCR产物和空质粒pGEX-4T-1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL21.将构建的重组质粒pGEX-4T-1-RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western-blot方法鉴定其原核表达效果. 结果成功构建出RPEF基因原核重组质粒pGEX-4T-1-RPEF.SDS-PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL21系统中得以高效表达,其融合蛋白分子量大约45kD,与理论值相符.Western-blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别,融合蛋白具有GST免疫反应性.结论筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因,并成功构建原核表达载体及在E.coliBL21系统中高效表达.

家庭内不同感染者间HIV-1的遗传关系的初步分析

目的通过对存在于一个收养家庭内部的HIV-1的变异情况及其相互间的遗传关系的研究,推测该家庭内存在的HIV-1是否属同一来源.方法从我省发现的某个家庭内HIV感染者成员的样品中扩增HIV-1的env基因的V3-V5区,进行序列测定和分析.并由其DNA序列推导对应的编码氨基酸.使用clustalX软件进行核酸序列和氨基酸序列的多重排列,利用PHYLIP软件包进行离散率分析、绘制进化树等.结果该家庭3个感染者体内存在的HIV-1均为AE重组病毒,在HIV-1毒株的遗传关系上,存在于养父母间毒株的亲缘较近,养子与养父母的亲缘关系较远.特别是在V3区的氨基酸序列特征上,养子的序列与养父母的序列有较为明显的不同.结论可能有不同来源的病毒造成该家庭内成员的HIV-1感染.

牙鲆迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株感染症及其病原特性研究

目的分离鉴定了牙鲆(Flounder, Paralichthys olivaceus L.)病原迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株(E.tarda indole-negative) 并对其特性进行了研究.方法对牙鲆迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染病例进行了自然病例检验,病原细菌的分离与鉴定、血清型检定、致病力检验、荧光抗体检验及药物敏感性测定.结果通过对牙鲆迟钝爱德华氏菌感染病例发病情况、临床特征、病理变化等方面的检验及细菌的分离与鉴定,表明所检病例为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株感染.对分离后做纯培养的20株菌进行了主要生物学性状及血清型的测定,表明20株分离菌对所测各项特征的结果一致,且均为同种血清型.分离代表菌株做对健康牙鲆鱼的人工感染试验表明了相应的原发病原学意义及较强的致病作用.药敏试验结果表明,对供试37种抗菌药物中的头孢唑啉等22种药物敏感、对青霉素G等7种药物耐药、对氨苄青霉素等8种药物表现了株间差异.以荧光抗体技术对纯培养物、人工感染病死鱼肝脏中细菌的检验,均呈现了特异荧光反应.结论从牙鲆病例分离鉴定了迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株,研究报告了其主要生物学特性,为对由此类病原菌引起的牙鲆感染症的有效检验与防治及进一步研究等奠定了基础.

幽门螺杆菌vacA毒性片段与cagA融合基因的构建与表达

目的构建幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)毒性片段和细胞毒素相关蛋白(CagA)的融合基因(vlc),在原核细胞中表达,为Hp双价融合蛋白候选疫苗的研究提供材料.方法用Gene SOEing技术将vacA毒性亚单位片段(v)与cagA保守片段(c)用疏水性多肽接头 (Gly4Ser)3进行拼接,构建融合基因vlc,将vlc定向插入原核表达质粒pQE30,经DNA测序分析确认后,转化E.coli DH5a,IPTG诱导表达,Western blot分析其抗原性.结果 DNA序列分析表明融合基因的连接顺序、方向正确,有一个碱基发生了无义突变.工程菌诱导后可表达相对分子量为58×103的融合蛋白,与预期分子量一致,约占菌体总蛋白的8%.Western blot显示融合蛋白具有良好的抗原性.结论融合基因vlc构建成功,表达的融合蛋白具有良好的抗原性,有望进一步进行免疫保护性机制的研究和Hp疫苗的制备.

鹦鹉热衣原体重组主要外膜蛋白诱导肉鸡免疫应答观察

用鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)重组主要外膜蛋白(Recombinent Major Outer-Membrane protein,r-MOMP)制作成油佐剂疫苗,经颈部皮下免疫5 d肉鸡.在免疫前1 d、免疫后14 d、21 d和30 d分别翅静脉采血,以常规血凝抑制试验检测抗体效价;用MTT法检测全血淋巴细胞对r-MOMP的特异性增殖反应;免疫30 d使用鹦鹉热衣原体强毒株(BJF5株)攻毒,观察临床症状,计算病变程度和保护率.结果表明免疫14 d后产生抗体,效价达4.2(log2),免疫后30 d效价达到5.0(log2);免疫组血液T淋巴细胞对r-MOMP的增殖指数明显高于对照组(P ＜0.05).试验表明r-MOMP在肉鸡体内可诱导对Cps特异性的体液免疫和细胞免疫应答,并能抵抗Cps强毒的攻击,显示r-MOMP免疫肉鸡具有良好的免疫原性和保护性.

一个新的TonB依赖的基因岛的分布特征研究

目的为揭示首次在尿道致病性大肠杆菌CFT073菌株中发现的TonB依赖的基因岛在其他菌属中是否存在及分布特点.方法根据组成该基因岛的全部基因设计引物,利用PCR方法进行检测分析,并以Southern blot和Dot blot方法予以证实.结果该基因岛主要存在于多种大肠杆菌和志贺氏菌中,在41株被检测的沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、克雷伯氏菌、枸橼酸杆菌等其他菌属的标准菌株中均没有完整的该基因岛结构.在33株从腹泻病患者粪便标本分离的包括6种血清型的福氏志贺氏菌株中有30株携带该基因岛.17株ETEC临床分离菌株中仅有1株菌阳性;19株EPEC临床分离株中仅有1株阳性;7株EAEC菌中均为阴性.在183株从腹泻病患者粪便标本分离的不属于已知的五类致泻性大肠杆菌中发现有123株携带该基因岛,阳性率为67.2%,其中130株携带HPI毒力岛的大肠杆菌中有95株携带该基因岛(阳性率为73%),53株非携带HPI大肠杆菌有28株携带该岛(阳性率为52.8%).结论该基因岛的结构比较保守,五个组成基因协同存在,主要分布在亲缘关系较近的大肠杆菌和志贺氏菌属,在大肠杆菌中与HPI毒力岛无明显的协同存在规律.

结核杆菌ERP蛋白的表达及其与肺结核进展关系的研究

目的研究结核杆菌ERP蛋白的表达及其与肺结核进展关系以及该蛋白的免疫学功能.方法应用聚合酶链式反应法(PCR),扩增ERP蛋白的编码区,克隆表达ERP蛋白.用结核病不同进展阶段的患者血清作为抗体进行免疫印记反应检测ERP蛋白.另外,还对ERP抗原诱导的人外周血淋巴细胞增殖反应和IFN-活性进行了测定.结果 ERP蛋白被空洞型结核患者的血清所识别.ERP作为抗原刺激PBMCs引起强烈的特异性增殖反应,14名 PPD+的健康献血者中10名 SI≥5 (71%),但是,在同样的刺激条件下10名 PPD-的健康献血者中仅有3人 SI≥5.几何平均值PPD+者为6.2,而PPD-者仅为2.76,存在显著性差异(P＜0.01).同时ERP刺激PBMCs引起了明显的IFN-γ分泌增加(分泌量≥5 U/ml).结论 ERP蛋白是结核菌感染晚期表达的蛋白,极有可能参与诱导宿主的体液免疫和细胞免疫.

狂犬病病毒糖/核蛋白基因疫苗和IL-18在犬的免疫试验研究

目的检测狂犬病病毒糖/核蛋白"二价"基因疫苗及IL-18在犬体内的免疫效果,并确定不同包裹剂对基因疫苗免疫效果的影响.方法本试验以pIRES1neo和人用灭活苗分别作为阴、阳性对照,以糖/核蛋白双基因共表达载体pIGN单独或与IL-18的真核表达载体pIIL18混合,以司苯-甘油混合或以生理盐水溶液形式,按每条犬200μg DNA/ml,接种3次(其中1组第3次加强免疫时采用浓缩的狂犬病灭活苗),间隔2周的免疫程序,经股四头肌进行注射免疫.通过间接ELISA、细胞中和试验及淋巴细胞转化试验分别检测体液和细胞免疫水平.结果与结论结果显示,1. 所有试验组在第3次加强免疫后特异性抗体和中和抗体水平显著高于阴性对照组;pIGN-pIIL18组诱导的细胞免疫水平高于无pIIL18的pIGN免疫组; 2. 以司苯-甘油作为包裹剂的基因疫苗诱导产生的免疫应答水平与裸质粒(生理盐水溶液)形式的基因疫苗间无显著差异;3. 以糖/核蛋白二价基因疫苗pIGN作为基础免疫,再以狂犬病浓缩灭活苗加强免疫后,能迅速诱导较高的体液免疫应答水平.以上结果说明,狂犬病病毒糖/核蛋白"二价"DNA疫苗具有实际应用于免疫预防的潜力.

大鼠天然抗体相关的弓形虫抗原基因的免疫筛选与克隆

目的研究大鼠对弓形虫感染的天然抗性分子,为弓形虫病疫苗的研制提供新的抗原分子.方法用正常大鼠血清作为探针筛选弓形虫速殖子cDNA文库,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定.结果从cDNA文库2×105个噬菌斑中筛选出5个阳性克隆,其插入片段大小分别为0.55～1.8kb.对P1、P4、P6和P8四个克隆进行测序,将所得序列查询基因序,结果显示:P8与弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)基因相同.P4为弓形虫的新基因序列(GenBank中的登录号为AY349162),命名为T.g P4.T.g-P4编码96个氨基酸的跨膜蛋白.PROSCAN分析显示T.g-P4含有4个蛋白激酶C磷酸化位点,3个N-肉豆酸酰化位点,1个核糖体蛋白L29信号.P1和P6为新基因片段.阳性克隆的分子鉴定正在进行中.结论阳性克隆的筛选和鉴定为抗弓形虫病疫苗的研制奠定基础.

日本血吸虫7个基因全长cDNA的获取和分析

目的从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析全长cDNA序列,为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点.方法从构建日本血吸虫成虫cDNA文库中挑取重组阳性克隆进行5'测序获取表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST),在此基础上进行引物延伸法(primer extension)测序,直至获取全长cDNA序列,将获取的基因登录GenBank,并进行生物信息学分析.结果获得7个日本血吸虫全长cDNA序列(GenBank登录号分别为AY336493～AY336499),其中6个为日本血吸虫新基因:类转录因子BTF3(similar to transcription factor BTF3)、延长因子1-α(elongation factor 1-alpha,EF1-α)、富含谷氨酰胺四联重复肽(small glutamine-rich tetratricopeptide,TRP)、鸟氨酸氨基转移酶(ornithine aminotransferase,OA)、内皮差异相关因子1(endothelial differentiation-related factor 1,EDF-1)和类基因转录增强因子(similar to testis enhanced gene transcript protein,TEGT);另1个是精氨酸酶(arginase)基因,比原发现的基因序列长456bp.生物信息学分析发现类基因转录增强因子为跨膜蛋白,具有6个跨膜区;各基因与人、鼠、蟾和曼氏血吸虫等物种的基因有37%～85%的同源性;蛋白结构和功能预测分析显示各基因分别含有NAC基元、精氨酸酶家族特征性序列、TEF基元、TRP基元、转氨酶基元、HTH-XRE基元和NAF位点,预示各基因分别具有相应的功能.结论 EST技术和引物延伸法有助于快速、经济地获取和研究日本血吸虫表达基因.

人胃黏膜细胞cDNA文库和pGBKT7-p37重组质粒的构建

目的构建人胃黏膜细胞cDNA文库,并选取VacA毒素的p37片段将其克隆到pGBKT7以表达BD-p37融合蛋白作为诱饵.为进一步用所此诱饵来筛选所构建文库以其找到与VacA相互作用的蛋白奠定基础.方法用TRIzol试剂从胃腺癌病人手术切除的正常胃黏膜细胞中抽取总RNA经LD-PCR得到双链cDNA,参照Clontech 的MATCHMAKER Library Construction and Screening Kit 构建cDNA文库并用文库所含的独立克隆数和含插入片段的克隆数占总克隆数的比例来评价酵母双杂交文库的质量.用PCR从Helicobacter pylor基因组中扩增出p-37基因将其克隆入pGBKT7载体并使插入片段与GAL4 BD同框,插入片段的大小和序列的正确性由双酶切和测序得以证实.结果文库中共有1.9×106个独立克隆,含插入片段克隆所占比例为91.7%.双酶切和测序结果表明p37的正确插入,Western blot 结果证明了融合蛋白的表达.结论构建了较高质量的cDNA文库和与GAL4 BD融合的诱饵蛋白,为进一步的研究奠定了基础.

蛔虫性哮喘免疫治疗肺组织病理变化的动态观察

目的为了观察人蛔虫变应原免疫治疗哮喘豚鼠后肺组织超微结构的动态变化,以及探讨蛔虫变应原致喘机理.方法用人蛔虫变应原激发豚鼠哮喘后1、24和72·!h,电镜观察不同实验组肺组织病理学变化.结果阴性对照组和佐剂对照组豚鼠在激发后1h、24h、72h肺泡间质无明显炎性细胞浸润,气血屏障结构完整、清晰.I型、II型肺泡上皮细胞结构正常.而阳性激发组豚鼠肺组织支气管粘膜上皮细胞纤毛脱落或缺失,分泌物增多;并对肺泡上皮细胞、气血屏障造成严重的损伤,使细胞器出现空泡、肿胀或呈碎裂状改变;肺泡表面活性物质合成减少.结论用蛔虫变应原诱发豚鼠哮喘后,使得大量炎性细胞渗出、浸润,对气道上皮形成炎性损伤,进一步引起肺功能降低.

问号钩体鞭毛蛋白相关基因分析

目的分析问号钩体黄疸出血群赖型赖株鞭毛蛋白相关基因,为进一步实验研究提供信息和线索.方法使用在线数据库和分析软件NCBI/Blast,ProDom/Blast等对问号钩体全基因组ORF基因进行诠释,对编码蛋白进行在线分析,并将问号钩体的鞭毛蛋白基因与E.coliK-12、伯氏疏螺旋体(BBU)和苍白密螺旋体(TPA)的鞭毛蛋白基因进行了比较.结果确定了问号钩体黄疸出血群赖型赖株染色体上约55个与鞭毛相关蛋白的基因,同其他3个细菌的鞭毛相关基因进行比较分析,推测出了钩体鞭毛结构模型图及其装配过程.结论通过比较,不同螺旋体的内生鞭毛形成机制存在差别,但是FlgF蛋白缺失可能是其一个共同机制;尽管为内生鞭毛,问号钩体鞭毛在结构组成和鞭毛装配过程上却与E.coli相似;问号钩体的钩形成调控和鞭毛丝结构与E.coli不同;在鞭毛形成过程中的转录调控机制也存在差异.

弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的构建及筛选

目的构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体,建立基因敲除突变株,为进一步探讨SAG3功能和弓形虫侵入宿主细胞机制提供可行的研究方法.方法用基因克隆方法将 SAG3 1.53kb和 2.81kb 两个同源序列分别插入TUB5/CAT质粒中,构建置换型打靶载体,氯霉素乙酰转移酶( CAT) 抗性基因作为筛选标记,采用电转移转染细胞方法进行基因打靶,建立突变型的弓形虫株,采用PCR、酶切分析和Southern Blot 杂交方法筛选鉴定. 结果构建了弓形虫RH株5 'SAG3-TUB5/CAT-3 ' SAG3置换型载体,获得了敲除SAG3 基因的弓形虫突变株,建立基因敲除突变株,获得了阳性的筛选克隆,经鉴定证明基因打靶结果准确.结论通过构建基因打靶载体,可有目的地敲除弓形虫膜抗原基因,为进一步研究弓形虫侵入机制,探讨弓形虫病防治提供可行的方法.

牛结核病诊断技术的研究进展

结核病是人类已知的古老的疾病之一,一直严重威胁着人类和动物的健康,造成了巨大的经济损失.由于卡介苗(BCG)的使用,结核病的发病率比过去有所下降,但是近年来由于艾滋病、器官移植等导致的免疫抑制,耐药菌株的出现,以及吸毒、酗酒、贫困、国际旅游、难民迁移等多种原因,该病的发病率又渐呈上升趋势.

肺炎衣原体与社区获得性肺炎

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae, Cpn)是一种常见的呼吸道病原体, 是社区获得性肺炎(Community Acquired Pneumonia, CAP)常见三种病原体(肺炎球菌、支原体和肺炎衣原体)中之一,大约10%的社区获得性肺炎病例与Cpn相关.

科罗拉多蜱传热

科罗拉多蜱传热(Colorado tick fever)也叫山林热和山林蜱热,是在美国和加拿大洛矶山脉地区早发现的常见的一种蜱传病毒性疾病,临床上类似一般感冒样症状,以双峰热和白细胞减少为特征.虽然大多数病例是自限性的,少数病人有脑炎症状,但也有更为严重的并发症,甚至死亡.病原体因在科罗拉多首先发现,又是蜱传播的,故名科罗拉多蜱传热.

幽门螺杆菌感染动物模型的选择应用

人类疾病动物模型是研究疾病发生、发展、转归及防治的重要工具, 好的动物模型是筛选药物, 研制疫苗所不可缺少的关键环节.动物模型的缺乏一度成为该疾病研究的限制因素.

美国《Emerging Infectious Diseases》2004年第10期有关人兽共患病论文摘译

福建沿海某渔港家鼠型流行性出血热疫源地的调查

近年来我省沿海某渔港船民中连续发生临床表现为发热伴有头痛、眼眶痛、腰痛及面部潮红的患者,部分病人经临床及血清学检测确诊为流行性出血热(EHF).为了减少发病、控制流行,我们在渔船上开展灭鼠的同时,对该港口居民区及渔船上的特殊环境进行EHF的宿主动物种类、密度、带毒率、病毒抗原型别及人群免疫水平等调查,为港区进一步制订防制对策,提供重要基础材料.

脑囊虫病患儿细胞免疫功能研究

脑囊虫病是一种严重危害小儿健康的人兽共患病,为了研究脑囊虫病患儿的细胞免疫功能,我们对云南大理白族28例小儿脑囊虫病外周血T淋巴细胞亚群,IL-2,sIL-2R、IL-6及IL-8水平进行测定,报告如下.

鼬獾咬伤引发7例狂犬病

我县地处浙西山区,人口44万.自1986年报告后1例狂犬病,时隔16年后于2002年4月再次发生狂犬病疫情,截止2004年6月共报告临床确诊病人8例,其中因野生动物鼬獾咬伤致病7例,呈明显上升高发趋势.现就7例因鼬獾咬伤致病个案流行病学分析如下.

斯氏狸殖吸虫转换宿主的研究

斯氏狸殖吸虫1959年由陈心陶首次报道,是中国独有虫种.我们在狸殖吸虫宿主转换的系列研究中,对犬与斯氏狸殖吸虫的生物学关系及宿主相容性进行了研究,本文报道斯氏狸殖吸虫在犬体内的分布、发育与转换宿主的特点.

脑脊液玻片离心染色法在新型隐球菌检测中的应用

隐球菌脑膜炎主要是由新型隐球菌引起的,干燥的隐球菌直径只有1 μm,多存在于土壤及鸽子粪中,可随尘埃一起被人吸入呼吸道内,先引起肺部病变,当人体抵抗力下降时,隐球菌由肺部经血流进入中枢神经系统,引起隐球菌脑膜炎.表现为轻度间歇性头痛,以后渐渐转为持久性,并逐渐加重,发热一般在38 ℃左右,也可高至40 ℃,病情严重时出现烦躁,神志不清甚至抽搐等.

家蝇显微解剖方法的研究

蝇类的解剖以往多用于形态学方面的种类鉴定与分类.随着科学技术的发展,蝇类解剖的意义已由单纯的对蝇类的形态学分类转向对蝇类机能学的研究.因此,简单的解剖方法已不能满足现代科学研究的需要,迫切需要寻找一种新的解剖方法,以取得蝇类胸腹段消化系统及完整的生殖系统.为今后蝇类不同的功能性研究打下良好基础.特探索四种不同的解剖方法,已取得良好效果,现报告如下.