LC-MS/MS法测定大鼠脑微透析液中7-乙基-10-羟基喜树碱的浓度
摘要： 目的:建立一种能够测定大鼠脑微透析液中7-乙基-10-羟基喜树碱(7-Ethyl-10-Hydroxycamptothecin,SN-38)浓度的分析方法.方法:采用LC-MS/MS法,色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18反相柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸,梯度洗脱；流速为0.3 ml/min；柱温为35℃.采用电喷雾离子化,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)测定大鼠脑微透析液中SN-38(m/z 393.1 →349.1)的浓度.结果:空白透析液无干扰；SN-38在0.1015～1015 ng/ml范围内线性关系良好(r=0.9995),定量下限为0.1015 ng/ml；回收率为97.54％～100.60％;精密度和稳定性均良好；脑微透析液中SN-38的浓度呈明显药动学过程,给药220 min后达到顶峰.结论:本实验所建立的LC-MS/MS分析方法专属性强、灵敏度高,可用于分析大鼠脑微透析液中SN-38的浓度.
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合并病毒性肝炎HIV感染患儿接受高效抗逆转录酶病毒治疗后肝功能变化
目的：观察获得性免疫缺陷综合征（ AIDS ）患儿合并乙型肝炎病毒（ HBV）/丙型肝炎病毒（ HCV ）感染与否在接受1年高效抗逆转录酶病毒疗法（ HAART）后肝功能的变化情况。方法：收集2011年3月至2012年3月河南省141例AIDS患儿HAART治疗1年前后临床资料，分为HIV＋HBV＋HCV组（ n＝78），HIV＋HBV组（ n＝19），单纯HIV组（ n＝44）。治疗前后分别用逆转录PCR检测血浆HIV RNA载量，流式细胞术检测CD4＋T细胞数，酶联免疫吸附试验检测HCV抗体和HBV表面抗原，全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶（ ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和总胆红素（TB）水平。结果：HAART治疗1年后，90．34％（127/141）患儿HIV RNA载量下降到检测水平以下（ t＝2．61， P＜0．01）， CD4＋T细胞数从（170．187±132．405）个/μl上升到（796．014±158．491）个/μl（t＝3．17， P＜0．01）。 HAART治疗后患儿的转氨酶均升高（ t＝2．02，均P＜0．05），奈韦拉平治疗组的ALT和AST分别由治疗前（18．28±13．74） U/L和（24．23±8．09） U/L升高到（55．35±22．40）U/L和（69．97±26．72）U/L（t＝3．80、4．11，均P＜0．01），同时奈韦拉平治疗组的 ALT 和AST变化量亦明显高于依非韦伦治疗组（均P ＜0．01）；使用奈韦拉平治疗的HIV＋HBV＋HCV合并感染患儿ALT和AST的变化量亦显著高于使用依非韦伦治疗患儿（均P＜0．01）。结论：无论是否合并HBV/HCV感染，HAART均能有效抑制病毒复制，使CD4＋T细胞计数上升，但同时会一定程度损伤肝细胞，尤见于合并感染者；正确选择用药方案，能够减少药物不良反应。
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整合素连接激酶基因敲降和黑色素瘤分化相关基因过表达慢病毒载体构建和鉴定
目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP，构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒；根据人mda7基因序列，设计引物扩增mda7全长，并插入慢病毒载体pLVX-Puro，构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293 T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后，用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体，四质粒系统共转染293 T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293 T细胞的感染效率在90％以上，并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。 ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果佳（P＜0．05），mda7的表达水平远高于对照组（P＜0．05），且持续稳定表达至少1个月。 ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用，并对其迁移亦有显著抑制（均P＜0．05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体，可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具，也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。
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运用聚乙二醇6000沉淀筛检巨催乳素血症患者
目的：运用聚乙二醇6000沉淀筛检血清催乳素（ PRL）水平升高患者中巨催乳素血症并进行临床样本验证。方法：运用聚乙二醇6000沉淀去除PRL升高患者血清中的巨催乳素分子（MPRL）。采用Sephacryl S-100HR层析柱联合化学发光免疫分析法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳联合蛋白质印迹法检测聚乙二醇6000沉淀血清MPRL的效果。采用聚乙二醇6000沉淀及化学发光免疫分析法检测PRL升高患者血清样本中的MPRL并筛查巨催乳素血症。分析真性高催乳素血症、高催乳素血症＋巨催乳素血症、真性巨催乳素血症患者不同临床表现。结果：聚乙二醇6000沉淀后，血清样本中MPRL峰或MPRL杂交信号明显降低，但对大分子催乳素（ BPRL）和小分子催乳素（ SPRL）无明显影响。1538例血清PRL升高患者中，16．1％（247/1538）为巨催乳素血症，其余83．9％（1291/1538）为真性高催乳素血症。247例巨催乳素血症样本中，93．5％（231/247）为真性巨催乳素血症，6．5％（16/247）为巨催乳素血症＋高催乳素血症。508例真性高催乳素血症患者中86．2％（438/508）有月经不调、停经/闭经、不孕不育或垂体瘤疾病，85．7％（6/7）高催乳素血症＋巨催乳素血症患者有上述临床表现，真性巨催乳素血症患者仅15．5％（11/71）有上述临床表现。结论：血清PRL升高患者中有一定比例的真性巨催乳素血症（假性高催乳素血症），运用聚乙二醇6000沉淀检测能简便有效地区分真性或假性高催乳素血症患者。
关键词： 沉淀素试验 聚乙烯二醇类/诊断应用 高催乳素血症/诊断 催乳素 普查 -
生活质量评估对慢性阻塞性肺疾病患者临床预后的判断价值
目的：探讨慢性阻塞性肺疾病（ COPD）评估测试（ CAT）在评估COPD患者临床预后中的应用价值。方法：将入选舟山市普陀区人民医院门诊COPD稳定期患者100例进行CAT评分和BODE指数评分，对两者结果做Spearman相关分析。记录3年随访患者病情急性加重次数和生存情况，并分析两种指标评估预后的差异。结果：CAT评分1、2、3和4级患者分别为28、30、29和13例，而根据BODE评分1、2、3和4级患者分别为31、29、28和12例。 CAT评分与BODE指数总分、4个变量得分均存在显著的相关性（ r＝-0．237、-0．772、0．789、-0．767、0．888，均P＜0．05）。多元回归分析结果显示CAT与BODE中的气流阻塞程度、呼吸困难程度、运动能力3个变量相关。随着CAT分级级别增加，COPD患者急性加重发作次数和病死率也相应增加两种指标在评估各级COPD患者急性加重发作次数之间差异无统计学意义（P＞0．05）；病死人数两者之间差异亦无统计学意义（1级：χ2＝0．919，2级：χ2＝0．001，3级：χ2＝0．177，4级：χ2＝0．322，均P＞0．05）。结论：CAT评分与BODE指数相关性较好，CAT适用于评价COPD患者生活质量，便于医师和患者简易快捷地了解病情，指导和监督治疗。
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Toll 样受体2／4-核因子κB 信号通路在人结核分枝杆菌侵入小鼠树突细胞2．4中的作用
目的：研究人结核分枝杆菌侵入抗原提呈细胞后诱导树突细胞（ DC ）成熟的机制。方法：选择小鼠DC2．4细胞株为抗原提呈细胞的效应细胞，建立人结核分枝杆菌H37 Rv株的细胞混合培养模型。在不同混合培养时段，采用实时荧光定量PCR检测DC2．4细胞Toll样受体2（TLR2）、TLR4 mRNA的表达量；蛋白质印迹法检测DC的核因子κB （ NF-κB ） p65蛋白的表达；免疫酶联吸附试验定量检测DC产生α肿瘤坏死因子（ TNF-α）的水平；采用间接免疫荧光法和流式细胞术检测DC2．4表面CD80和CD86的表达情况。结果：H37 Rv与DC2．4共培养2 h后开始有细菌侵入；共培养6、8、10、12 h后，细菌侵入率分别为（37．9±5．6）％、（51.2±7．6）％、（57．2±8．9）％、（63.9±12．4）％；TLR2、TLR4 mRNA也开始增量，共培养10 h时达高峰，之后开始下降；共培养6 h时，NF-κB p65的表达量明显增高；TNF-α的表达量在共培养6 h开始上调，8 h时达高峰，随后逐渐下降；共培养6 h时，DC2．4表面CD80、CD86表达量明显增高。结论：人结核分枝杆菌侵入DC2．4时，通过激活TLR2/4-NF-κB 信号通路，诱导 DC 成熟，提高其抗原提呈能力。
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2013年杭州市手足口病患儿及其接触人群流行病学调查
目的：了解2013年杭州市手足口病（ HFMD）流行特征、不同HFMD病原体与疾病严重程度关系以及人肠道病毒71型（ HEV71）阳性重症HFMD患儿接触人群HEV71携带率。方法：采集2013年杭州市儿童医院收治的HFMD疑似患儿咽拭子或粪便标本，采用实时荧光定量PCR检测HFMD病原体，了解轻症和重症HFMD患儿中HFMD病原体的分布。选取54例HEV71阳性重症HFMD患儿家属中密切接触和一般接触者各1名，检测其粪便标本中的HEV71并随访1个月。分析杭州市儿童医院2011～2013年检出的HFMD病原体构成比差异和优势病原体转变。结果：849例HFMD疑似患儿中确诊641例，男女患儿比例1．4∶1，1～3岁患儿占80．3％。 HFMD患儿标本中24．3％（156/641）检出HEV71，4．7％（30/641）检出A组16型柯萨奇病毒（CVA16），71．0％（455/641）检出其他肠道病毒。75．6％（118/156）HEV71感染病例为重症HFMD，但CVA16和其他HFMD病毒感染病例中仅分别有13．3％（4/30）和6．2％（28/455）为重症HFMD，三者间差异有统计学意义（χ2＝43．28， P ＜0．05）。2011、2012年 HFMD 优势病原体为HEV71，2013年为其他肠道病毒。54例密切接触者和54例一般接触者中分别有9例和10例检出HEV71（ P＞0．05），且均无HFMD临床表现。结论：2013年杭州市HFMD流行季节、好发年龄与性别无明显变化，HEV71感染易引发重症HFMD，但其他肠道病毒已替代HEV71成为HFMD优势病原体。
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肠内序贯营养支持在重症卒中患者中的应用研究
目的:探讨肠内序贯营养支持对重症卒中患者营养状况及并发症的影响.方法:将符合入组标准的49例患者随机分为序贯营养组(n=24)和常规营养组(n=25).序贯营养组先采用短肽型肠内营养制剂,并逐步过渡到整蛋白型肠内营养制剂;常规营养组直接采用整蛋白型肠内营养制剂;比较两组患者的营养指标及并发症发生率.结果:住院期间两组患者各项营养指标均有下降,但与常规营养组相比,序贯营养组血红蛋白及血清白蛋白下降程度较轻,差异有统计学意义(P＜0.05).体重、体重指数、三头肌皮褶厚度、上臂围及上臂肌围两组之间无明显差异(P＞0.05).在并发症发生率方面,序贯营养组较常规营养组的感染率有下降,差异有统计学意义(P＜0.05),胃肠道出血率亦有下降趋势.结论:与常规营养支持相比,肠内序贯营养支持可减轻重症卒中患者的营养状况恶化,降低感染等并发症的发生率,可能是重症卒中患者理想的营养支持方案.
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低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达
目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达.方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1 αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF.采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体.检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达.结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高.以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为(48.93±3.86) ng/mL.结论:本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部.
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超氧化物歧化酶复合微球的制备及其活性考察
目的:制备超氧化物歧化酶(SOD)的聚乳酸羟乙醇酸(PLGA)微球及海藻酸-壳聚糖-PLGA复合微球,考察制备因素对SOD活性的影响,并比较测定微球中SOD包封率及活性.方法:采用W/O/W复乳法制备SOD-PLGA微球,乳化法和离子交联法制备海藻酸-壳聚糖微囊,并进一步分散入PLGA制成复合微球.应用考马斯亮蓝法测定SOD浓度,用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性.结果:SOD活性对温度较不敏感,对酸碱、有机溶剂、未加冰浴的超声和高速搅拌等制备因素敏感.PLGA(50∶ 50)微球、PLGA (70∶30)微球、海藻酸-壳聚糖双重微囊、50∶50复合微球、70∶30复合微球制备得到的SOD包封率分别为36.42％±1.81％、66.18％±0.05％、91.08％±1.28％、87.30％±3.89％和83.19％±3.48％.体外释放试验比较PLGA(50∶ 50)微球和50∶50复合微球1h、8h及1 w释出的蛋白活性,均为复合微球大于PLGA微球.结论:海藻酸-壳聚糖-PLGA复合微球作为SOD的缓、控释剂型可明显提高药物的包封率,提高其活性.
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三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究
目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得优化的方法.方法:分别采用不同剂量(1.25 μl、2.0 l、2.5 μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率.结果:HilyMax组的转染效率为(86.85％±2.32％),较Lipofectamin2000组(48.33％±3.24％)、Gbfectene-Elite组(37.35％±5.41％)高(F=18.882,P＜0.05);其中,HilyMax 2.5μl组的转染效率高为(90.53％±1.15％).Lipofectamin2000组的细胞存活率(65.76％±5.78％)明显低于HilyMax组(89.54％±0.86％)、Gbfectene-Elite组(82.45％±3.56％) (F=90.676,P＜0.05).结论:HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有好的转染效率和低的细胞毒性,推荐使用2.5 μl HilyMax:1μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染.
关键词： 转染 质粒DNA/遗传学 鸡胚成纤维细胞/细胞学 绿色荧光蛋白质类 细胞毒性
