微卫星体简单重复序列锚定PCR扩增技术(SSR-PCR)及其在寄生虫基因研究中的应用
摘要： 寄生虫基因变异现象是普遍存在的,了解其变异情况有助于寄生虫的防治控制及疫苗研制.早期的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)等分子生物学技术的运用极大地推动了寄生虫遗传变异研究的深入发展.
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siRNA特异性干扰EgRad9基因表达对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响
目的 研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性干扰EgRad9基因表达后对细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤机制的影响. 方法 利用电穿孔法将EgRad9-siRNA干扰序列和阴性对照干扰序列转染细粒棘球蚴原头节,实验分为EgRad9-siRNA-354、-614、-971干扰组,阴性对照组和空白对照组.电转染3d后,加入自然状态下原头节大耐受浓度的H2O2处理1h,伊红染液染色后,倒置荧光显微镜下观察原头节活性并计算存活率.收集各组原头节的培养液,进行碱性磷酸酶活性的检测.电转染3d后,加入自然状态下原头节耐受H2O2的大耐受浓度处理1h后,TRIzol法提取总RNA.实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测EgRad9mRNA的表达.采用彗星实验检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤情况,活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测干扰EgRad9基因表达后细粒棘球蚴原头节体内ROS的含量,采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析. 结果 自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受H2O2的大浓度为0.4 mmol/L,干预时间为1h;电穿孔法可将绿色荧光干扰序列有效的导入原头节体内,实验组和阴性对照组的原头节体内均有明亮的绿色荧光斑点;而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点.EgRad9-siRNA-354、-614、-971干扰组原头节的存活率分别为(42.99±4.03)％、(29.86±5.87)％和(56.48±4.64)％,初步筛选有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.siRNA-354、-614、-971干扰组碱性磷酸酶活性分别为0.024±0.001、0.004±0.001、0.039±0.002,其中EgRad9-siRNA-614组碱性磷酸酶活性与阴性对照组(0.095±0.001)和空白对照组(0.099±0.001)相比,差异均有统计学意义(t=10.227、10.934,均P＜0.01),表明该组原头节EgRad9基因经干扰后对其活性影响大,有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.EgRad9-siRNA-354、614、971干扰组EgRad9 mRNA表达量分别为0.432±0.055、0.291±0.079、0.612±0.032,其中经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,EgRad9 mRNA表达量与阴性对照组(1.001±0.020)和空白对照组(1.001±0.012)相比均显著下调(t=7.874、7.663,均P＜0.01),可确定有效干扰序列为EgRad9-siRNA-614.相同电泳条件下,EgRad9-siRNA-614干扰组原头节DNA碎片离开核向阳极迁移,形成拖尾;EgRad9-siRNA-614干扰组彗星尾距OTM值为13.901±2.263,与阴性对照组(0.074±0.020)和空白对照组(0.047±0.034)相比,差异有统计学意义(t=12.845、13.251,均P＜0.01).经EgRad9-siRNA-614序列干扰后,原头节体内ROS含量为13.024±0.154,与阴性对照组(2.728±0.083)和空白对照组(2.555±0.007)相比,差异有统计学意义(t=9.296、10.134,均P＜0.01). 结论 EgRad9基因在细粒棘球蚴原头节DNA氧化损伤过程中发挥重要作用,EgRad9-siRNA-614干扰片段可特异性干扰EgRad9基因的表达,并降低原头节修复DNA氧化损伤的能力.
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ACT1-qPCR定量分析弓形虫内参引物的筛选与鉴定
目的 运用PCR对刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH、PRU、VEG株速殖子和HFF、Vero细胞系以及SPF级昆明鼠脑组织所得DNA样品进行特异性扩增,鉴定并筛选出适合用作弓形虫实时荧光定量PCR(qPCR)分析的内参引物. 方法 体外培养并无菌收集HFF、Vero细胞系及弓形虫RH、PRU、VEG株速殖子,SPF级昆明鼠经颈椎脱臼处死无菌采集脑组织,并提取基因组DNA.合成弓形虫MIC6基因(ToxoDB:TGME49_218520)特异性引物P1/P2,经PCR扩增鉴定所得样品是否含有弓形虫DNA成分,设空白对照.依照ToxoDB数据库弓形虫ACT1基因参考序列(ToxoDB:TGME49_209030)设计引物,经NCBI Primer-BLAST比对分析后进行合成特异性引物P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10和P11/P12,预期片段大小均为121 bp.以弓形虫RHDNA为模板,采用梯度PCR优化ACT1基因内参引物的退火温度.运用已优化条件对待检DNA样品进行PCR特异性扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出适合用于弓形虫qPCR定量分析的内参引物. 结果 PCR扩增弓形虫RH、PRU和VEG株DNA.MIC6基因时均出现一条长度约为1050 bp的条带,且空白对照和其他样品无此条带,与预期结果一致,表明所得DNA样品可用.优化退火温度时发现,除P7/P8外其他引物均不受退火温度影响,56℃适合用于PCR或qPCR扩增ACT1基因目的片段的退火温度.以56℃为退火温度对待检DNA进行检测时发现,扩增弓形虫阳性样品时所有引物均能产生1条大小约为121 bp的条带,空白对照无此条带,与预期结果一致.此外,引物P7/P8、P9/P10扩增Vero细胞系和引物P3/P4、P5/P6、P9/P10扩增昆明鼠脑组织DNA样品时均有杂带出现,且有杂带大小约为121 bp;引物P11/P12扩增弓形虫阴性DNA样品时均无杂带出现. 结论 引物P11(5 ′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′)和P12(5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)适合分别用作弓形虫qPCR定量分析时扩增ACT1靶基因的上游和下游引物.
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上海市1例输入性罗阿丝虫病的临床特征与诊断
目的 对上海市1例输入性罗阿丝虫病的临床特征与诊治进行分析. 方法 收集患者临床资料,进行相关流行病学调查;采集患者骨髓及外周血,制作涂片瑞氏染色后镜检;提取患者血样DNA,用丝虫核糖体内转录间隔区1 (ITS-1)通用引物PCR进行扩增,对扩增产物进行基因测序检测并进行BLAST比对分析.根据诊断结果给予相应治疗. 结果 患者,浙江仙居人,2015年5-11月在刚果(金)务工,回国后于2016年1月发现左上肢远端皮肤肿胀,伴皮肤颜色加深.当地医院血检显示嗜酸粒细胞计数升高,核磁共振检查示左前臂部分肌群及腕关节肌腱炎性病变,诊断为“嗜酸性筋膜炎”,服用甲泼尼龙片(美卓乐)治疗1年余,无明显效果.2018年2月27日至上海市瑞金医院皮肤科就诊.查体:皮肤黝黑,无皮疹、肿块及淋巴结肿大,其余均无异常.外周血嗜酸粒细胞计数8.2×109/L,外周血、骨髓涂片查见微丝蚴,8ml全血离心浓缩后检出较多微丝蚴.PCR扩增出457 bp的阳性条带,条带序列与罗阿丝虫(GenBank登录号:DQ995497)ITS1的相似性为100％.根据微丝蚴形态学和PCR检测结果诊断该病例为罗阿丝虫病,给予伊维菌素150 μg/(kg· d)单剂口服,治疗2周后复查,外周血厚、薄血膜中均未查见虫体,8 ml全血离心浓缩后检出12条微丝蚴,外周血嗜酸粒细胞计数为6.39×109/L,伊维菌素治疗有效. 结论 经病原学和分子生物学检测确诊病例为输入性罗阿丝虫病例.
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氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果评价
目的 研究氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果. 方法 从感染细粒棘球蚴绵羊肝脏中收集原头节;从感染长爪沙鼠腹腔中分离多房棘球蚴,加入预先接种人肝癌细胞的DMEM培养基中培养2个月后,收集直径为1～5 mm囊泡.实验分氯舒隆组(实验组)、奥硝唑组(实验组)、阿苯达唑组(阳性对照)和0.2％二甲基亚砜(DMSO)组(溶剂对照组).每种药物设2个平行孔,终浓度均为40 μmol/L,重复2次.每孔加细粒棘球蚴原头节约100个或多房棘球蚴囊泡25～35个.药物处理细粒棘球蚴原头节24、48、72、96、120、l44和168 h后,显微镜下观察原头节形态,用台盼蓝染色,计算原头节存活率,组间存活率的比较采用方差分析.药物处理多房棘球蚴囊泡36 h和120 h后,显微镜下观察囊泡的形态学改变,测定培养上清液中碱性磷酸酶的活性,组间酶活性的比较采用卡方分析. 结果 氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用于原头节后,原头节颜色变深、钙颗粒减少、头钩脱落、头节外翻并伸长,0.2％ DMSO对原头节形态无影响.氯舒隆、臭硝唑和阿苯达唑作用24、48、72、96、120、144和168 h后,原头节存活率分别为79％、70％、56％、42％、33％、16％、15％,86％、67％、63％、48％、32％、28％、21％和85％、71％、45％、36％、21％、15％、8％;0.2％ DMSO组原头节存活率为100％.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组原头节存活率与0.2％ DMSO组相比差异均有统计学意义(X2=147.83、130.58、170.37,P＜ 0.05).氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用后,多房棘球蚴囊泡均塌陷、皱缩,0.2％ DMSO对多房棘球蚴囊泡形态无影响.作用36 h后氯舒隆、奥硝唑、阿苯达唑和0.2％ DMSO组培养上清液碱性磷酸酶的吸光度(A405)值分别为0.196±0.030、0.186±0.004、0.244±0.049和0.131±0.020,作用120 h后分别为0.431±0.006、0.271±0.004、0.423±0.007和0.116±0.004.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组与0.2％ DMSO组相比差异均有统计学意义(t=0.006、0.004、0.007,P＜ 0.05). 结论 氯舒隆和奥硝唑对体外培养的细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴均具有较强的作用,是潜在的抗棘球蚴药物.
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山丘型血吸虫病传播阻断示范区血吸虫病传播高危风险因素分析
目的 调查长江南岸一山丘型血吸虫病传播阻断示范区内血吸虫病传播的高危风险因素. 方法 收集长江南岸一山丘型血吸虫病传播阻断示范区2016、2017年人畜血吸虫病疫情资料及相关数据.另在示范区内选取乌石河滩、水泥沟、田间沟、泄洪沟、干渠、荒地、荒滩等7个调查点,在相应区域内以系统抽样结合环境抽样开展钉螺调查,捡获的钉螺应用环介导等温扩增技术(LAMP)进行血吸虫核酸检测.连续3个月在7个调查点捕捉野鼠,每月投放1次鼠笼或鼠夹,每次持续3d.捕获的野鼠取肝脏组织,匀浆后显微镜下检查虫卵,应用毛蚴孵化法检测野鼠粪便和在调查区域内检获的所有肉眼观察到的野粪. 结果 该示范区2016、2017年本地居民共查病12 232人次,血清血吸虫抗体阳性152例,无粪检阳性病例.本地耕牛血检688头次,血清血吸虫抗体阳性1头,无粪检阳性病畜.7个调查点共调查钉螺2152框,捡获钉螺1401只,其中活螺为427框1398只,平均密度为3.27只/框.LAMP检测结果显示,24管钉螺(每管15只钉螺)混合DNA中,5管呈阳性反应,分布在水泥沟、田间沟、干渠等3个调查点.投放鼠笼或鼠夹共825个,捕获野鼠35只,分布在除乌石河滩的其余6个调查点.野鼠粪便孵化均为阴性,肝脏组织镜检发现2只野鼠感染华支睾吸虫.购得的2份野猪肝脏和1只野兔,镜检和粪便孵化均为阴性.捡获野粪137份,较多的2个调查点分别为54份和44份,野粪来自牛、羊、马、猪、犬等5种家畜,其中牛粪多(66份),猪粪少(4份).经毛蚴孵化检查,26份野粪为阳性,阳性率为19.0％,其中牛粪15份阳性,马粪、羊粪、猪粪、犬粪分别为2、3、3、3份阳性. 结论 示范区内人群调查未见血吸虫感染.示范区的有螺环境内存在多种家畜传染源格局,家畜野粪阳性率为19.0％,是该类地区血吸虫病传播的高危风险因素.
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TLR4/NF-κB信号通路在微小隐孢子虫感染中的作用机制
目的 探讨Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信号通路在微小隐孢子虫(Cryptosporidium Darvum)感染小鼠致肠黏膜损伤中作用的分子机制. 方法 30只4周龄雄性BALB/c小鼠随机分成感染1周组、感染2周组和未感染组,每组10只.感染组每鼠经口灌胃微小隐孢子虫卵囊(1×105个/只),未感染组小鼠正常饮食、饮水.感染组小鼠分别于感染后第1周和第2周剖杀,未感染组小鼠于第2周剖杀.取小鼠肠组织,HE染色观察小鼠肠黏膜的病理变化.抽提肠黏膜组织总RNA,逆转录成cDNA,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测TLR4和NF-κB p65的mRNA相对表达量.蛋白质印迹(Western blotting)检测肠黏膜组织中TLR4和NF-κBp65的相对表达量.ELISA检测肠黏膜组织中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平.结果 HE染色结果显示,感染组小鼠肠绒毛明显萎缩变短、脱落,黏膜下层水肿,与肌层间形成明显的间隙;未感染组小鼠肠绒毛结构完整.qRT-PCR结果显示,感染1周组和感染2周组小鼠肠黏膜组织中TLR4的mRNA相对表达量分别为2.3±0.4、3.5±0.1,均高于未感染组(1.0±0.0) (P＜0.05,P＜0.01);NF-κB p65的mRNA相对表达量分别为2.6±0.3、3.6±0.2,均高于未感染组(1.1±0.1) (P＜ 0.05,P＜0.01).Western blotting结果显示,感染1周组和感染2周组小鼠肠黏膜组织中TLR4的相对表达量分别为0.4±0.0、0.6±0.0,均高于未感染组(0.2±0.0) (P＜ 0.05,P＜0.01);NF-κB p65的表达量分别为0.6±0.0、0.8±0.1,均高于未感染组(0.4±0.0)(P＜ 0.05,P＜0.01).ELISA检测结果显示,感染1周组和感染2周组小鼠肠黏膜组织中IL-1β的表达量分别为33.3±2.2、46.1±2.5,均高于未感染组(22.3±5.0) (P＜ 0.01);TNF-c的表达量分别为45.7±2.0、55.4±3.6,均高于未感染组(25.7±9.3)差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 微小隐孢子虫感染小鼠后,通过激活TLR4/NF-κB信号通路,可上调TLR4和NF-κB p65的表达,促进IL-1β和TNF-α的释放,诱发肠黏膜炎症反应.
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虫种特异性基因检测小鼠无虫病理组织裂头蚴感染的可行性研究
目的 研究用细胞色素C氧化酶1基因(cox1)及内转录间隔区1(ITS-1)特异性序列检测小鼠无虫病理组织中裂头蚴感染的可行性. 方法 6～8周龄昆明小鼠20只,采用随机抽签法分为感染组(15只)和未感染组(5只),感染组小鼠经口感染蛇源裂头蚴(5条/只),未感染组不作任何处理.感染后第14天剖杀小鼠,取感染组小鼠皮下含裂头蚴肌肉组织(含虫组织)、去除裂头蚴肌肉组织(无虫组织)及未感染组小鼠相应部位肌肉,制作组织切片,苏木精-伊红染色法(HE)染色后观察.用改良的蛋白酶K消化法提取未染色肌肉组织切片的DNA,PCR扩增cox1(2对引物,对应cox1-1和cox1-2片段)和ITS-1序列.选取从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1进行克隆并测序,与GenBank中猬裂头蚴序列(KJ418421、KF990161、GQ999947)进行比对.以猪囊尾蚴感染的小鼠肌肉组织同法制作切片并提取DNA,评价cox1和ITS-1 PCR扩增的特异性. 结果 感染组含虫组织DNA经1次PCR即可扩增出414 bp(cox1-1)、151 bp (cox1-2)、822 bp(ITS-1)的条带.感染组无虫组织DNA第1次PCR未扩增出条带,以第1次PCR产物为模板再次PCR,扩增出相同大小的3条条带.未感染组DNA第1次和第2次PCR均未扩增出条带.序列比对结果显示,从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1序列与KJ418421、KF990161、GQ999947序列的同源性分别为98.2％、99.1％、99.1％.猪囊尾蚴感染组织DNA没有扩增出条带. 结论 以cox1和ITS-1序列为靶序列进行重复PCR,能鉴定小鼠无虫病理组织裂头蚴感染.
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IL-18对pVAX1/SjRPS4·CB质粒疫苗免疫小鼠抗日本血吸虫感染的免疫调节作用
目的 探讨pVAX1/IL-18联合pVAX1/SjRPS4·CB质粒疫苗对小鼠抗日本血吸虫感染的免疫调节作用. 方法 70只BALB/c雌鼠按随机数字表法均分为生理盐水组(NS组)、pVAX1空质粒组、pVAX1/IL-18组、pVAX 1/SjRPS4·CB组和pVAX1/SjRPS4· CB+pVAX1/IL-18组等5组(每组14只),每组小鼠在左后腿股四头肌注射相应质粒100 μg或等量生理盐水,每隔2周加强免疫1次,共免疫3次.小鼠感染前(免疫后3周)尾尖部取血,ELISA检测小鼠血清特异性抗体IgG以及抗体亚类IgG1、IgG2a水平.同时,各组小鼠经腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴, (20±1)条/鼠.感染后8周,门静脉灌注法收集日本血吸虫成虫,计算减虫率;取肝组织,显微镜下计数虫卵数,计算减卵率.无菌取脾脏,称重,计算小鼠脾脏指数,噻唑蓝(MTT)法测脾淋巴细胞体外增殖水平.分别于小鼠感染前(免疫后3周)以及感染后2、4、6、8周尾尖部取血,ELISA检测小鼠血清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)水平. 结果 5组小鼠免疫后3周,ELISA检测结果显示,pVAX1/SjRPS4· CB+pVAX1/IL-18组IgG、IgG1、IgG2的吸光度(A450值)分别为1.03±0.17、0.32±0.08、0.78±0.12,IgG2a/IgG1比值为2.44,均高于其他4组.pVAX1/SjRPS4· CB+ pVAX1/IL-18组的减虫率、减卵率分别为52.0％、63.2％,均高于其他3组(P＜0.05).脾脏指数结果显示,pVAX1/SjRPS4· CB+pVAX1/IL-18组小鼠脾脏指数为3.32±0.37,高于其他4组(P＜0.05).MTT法检测结果显示,pVAX1/SjRPS4· CB+pVAX1/IL-18组淋巴细胞体外增殖水平A570值为4.45±0.34,高于其他4组(P＜0.05).小鼠感染前以及感染后2、4、6、8周,pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18组IFN-γ含量分别为(569.07±21.15)、(560.66±30.84)、(577.46±36.45)、(605.03±36.91)、(636.33±37.35) pg/ml,均高于其他4组(P＜0.05);各组IL-4含量在感染前后差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 IL-18可增强pVAX1/SjRPS4· CB疫苗抗日本血吸虫感染的免疫保护效果,且诱导小鼠产生较高的以Th1为主的免疫应答.
关键词： 日本血吸虫 白细胞介素-18 pVAX/SjRPS4·CB 疫苗 -
2015年黑龙江省人体重点寄生虫感染现状调查
目的 了解黑龙江省人体重点寄生虫感染现状,为制定全省人体重点寄生虫病防治对策提供科学依据. 方法 2015年4-6月按照全国人体重点寄生虫病现状调查方案和实施细则要求开展调查.采用分层整群随机抽样法从全省40个县(市、区)抽取104个农村调查点和15个城镇调查点,每个调查点调查人数不少于250人.收集受检者粪样,采用改良加藤厚涂片法检测土源性线虫、带绦虫、华支睾吸虫等蠕虫虫卵并计数,直接涂片法检测肠道原虫包囊或滋养体,3～6岁儿童透明胶纸肛拭法检测蛲虫卵和带绦虫卵. 结果 共调查30280人,肠道寄生虫总感染率为2.5％ (751/30 280),未检出肠道原虫.检出蛔虫、鞭虫和华支睾吸虫等3种肠道蠕虫,感染人数分别为3、1、747人,其中华支睾吸虫感染者占总感染人数的99.5％ (747/751).蛔虫、鞭虫均为轻度感染,华支睾吸虫轻、中、重感染度的患者构成比分别为82.3％ (615/747)、16.9％ (126/747)、0.8％ (6/747).农村、城镇人群肠道寄生虫感染率分别为2.8％ (737/26456)和0.4％ (14/3824),差异有统计学意义(x2=80.875,P＜0.05);男、女性感染率分别为3.1％ (464/15171)和1.9％ (287/15109),差异有统计学意义(x2=42.037,P＜0.05);30～39岁组人群感染率高,为3.3％ (148/4430),不同年龄组间差异有统计学意义(x2=121.628,P＜0.05);农(牧、渔)民人群感染率高,为3.2％ (695/21914),不同职业组间差异有统计学意义(x2=165.864,P＜0.05);汉族人群感染率高,为2.5％ (743/29487),不同民族间差异有统计学意义(x2=8.482,P＜0.05);初中组人群感染率高,为3.5％ (500/14425),不同文化程度间差异有统计学意义(X2=123.031,P＜ 0.05). 结论 黑龙江省查到3种主要感染人体的寄生虫,华支睾吸虫感染占99.5％,以轻度感染为主.感染人群的分布存在性别、年龄、职业、民族、文化程度等方面的差异.
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热休克蛋白47-shRNA调节肝星状细胞膜受体对日本血吸虫鼠肝纤维化的影响
目的 了解热休克蛋白47-短发夹RNA (HSP47-shRNA)调节肝星状细胞(HSCs)膜受体对日本血吸虫鼠肝纤维化的影响. 方法 建立日本血吸虫鼠肝纤维化模型,感染前(健康对照组)和感染后第4、9、14周,分别随机取5只小鼠,提取肝脏组织总RNA,采用RT-PCR检测HSP47 mRNA相对表达水平,蛋白质印迹(Western blotting)检测HSP47蛋白表达情况,用RM-6240BD型多道生理信号系统动态检测模型鼠门静脉压力,流式细胞术检测HSCs膜内皮素受体(ETAR和ETBR)的平均荧光强度(MFI),免疫组织化学法检测感染前和感染后14周的模型鼠肝组织膜受体表达情况,采用线性相关分析方法分析各时间点的HSP47 mRNA相对表达水平与门静脉压力、ETAR和ETBR相对表达量的关系.用HSP47-shRNA质粒转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3细胞和血吸虫肝纤维化模型鼠,并设阴性对照组(空质粒)和空白对照组(PBS),每组12只血吸虫感染模型鼠.采用RT-PCR检测NIH/3T3细胞转染0、24、48 h及模型鼠干预至第14周的HSP47 mRNA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA相对表达水平,Western blotting检测对应蛋白的表达情况,流式细胞术检测膜受体(ET、TGF-β及PDGF的受体)的MFI.两组间均数的比较采用Student-t检验,多组间采用单因素方差分析. 结果 模型鼠感染日本血吸虫后第4、9、14周,RT-PCR结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平分别为0.592±1.031、1.253±2.101和0.651±1.532,较感染前(0.253±0.120)均升高(P＜ 0.01);Western blotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;门静脉压力分别为(3.010±0.250)、(8.850±0.63)和(12.390±0.830) mm Hg,感染后第14周与感染前的(2.350±0.180) mm Hg比较,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞术检测结果显示,ETAR的MFI分别为3245±186、6 108±213和8 784±257,高于感染前的2 104±232(P＜ 0.01);ETBR的MFI分别为3 812±158、4524±197和5554±156,高于感染前的2091±237 (P＜ 0.01).相关性分析结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平与门静脉压力、ETAR和ETBR的MFI均呈正相关(r=0.750、0.750、0.508,P＜ 0.05).免疫组织化学结果显示,感染后第14周,ETB、TGF-β和PDGF的受体在肝纤维聚集部位呈强阳性表达.HSP47-shRNA转染NIH/3T3细胞48 h后,RT-PCR结果显示,转染组HSP47 mRNA相对表达水平为0.254±2.358,低于阴性对照组的0.911±1.391 (P＜ 0.01);Western blotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平分别为0.656±0.061、1.330±0.155,较阴性对照组的1.521±0.314、2.243±0.142均下调(P＜0.01);流式细胞术检测结果显示,ETBR的MFI为53.433±5.243,高于转染前的30.825±5.460(P＜0.05),TGF-β及PDGF受体转染前后差异无统计学意义(P＞ 0.05).转染组小鼠体内干预至第14周后,RT-PCR结果显示,HSP47 mRNA相对表达水平为2.686±0.711,低于阴性对照组的6.001±0.458 (P＜0.01);Westernblotting结果显示,HSP47蛋白表达情况与mRNA变化一致;Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA相对表达水平分别为10.956±2.079和14.071±1.915,均较空白对照组的22.687±1.478和29.065±2.537下降(P＜0.01);流式细胞术检测结果显示,转染组ETAR表达阳性率为(51.48±4.27)％,低于空白对照组的(81.60±6.07)％(P＜0.05);转染组小鼠HSC膜受体ETAR、ETBR的MFI分别为4249±344和3706±194,均低于空白对照组的8538±494和5052±213 (P＜0.05),TGF-β和PDGF受体转染前后差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 HSP47-shRNA可干预活化的HSC和血吸虫肝纤维化鼠,ETR变化为影响肝纤维化尤其门静脉高压的因素.
