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重组pEGFP-C1-Smad4表达载体的构建及在SGC7901细胞中的表达
目的:构建pEGFP-C1-Smad4表达栽体.并观察其在人胃癌SGC7901细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白与Smad4的融合表达栽体,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析,用基因转染技术将其转入人胃癌SGC7901细胞.荧光显微镜、Western blot检测其表达.结果:酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确.在转染的人胃癌SGC7901细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到Smad4在蛋白水平的表达.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-C1-Smad4,并在胃癌SGC7901细胞瞬时表达成功,为进一步研究Smad4在胃癌发生中的作用奠定基础.
关键词： 胃肿瘤 SGC7901细胞株 Smad4 表达载体 -
乙肝DNA疫苗的研究进展
免疫接种是预防 HBV感染的一项重要措施。第 1代 HBV疫苗以无症状携带者血浆中纯化的 22nm球形亚单位病毒颗粒作为疫苗。第 2代 HBV疫苗由在真核细胞中表达的相同的亚单位病毒颗粒组成 [1]。但是血源疫苗需要大量 HBsAg携带者血浆，又需要较高的灭活技术、成本也较高；基因工程疫苗、全程疫苗需接种 3剂疫苗，这可降低免疫覆盖率， 15％～ 20％的人群对其呈现无应答或应答低下，另外，对有可能逃避现有疫苗保护作用的 HBsAg突变株存在争论 [2]，所以乙肝 DNA疫苗在此基础上应运而生。 1 乙肝 DNA疫苗的组成 1.1 目的基因的选择 HBV 基因组含有多种抗原： preS1基因、 preS2基因、 S基因、 c基因、 e基因、和 X基因。因为 preS1蛋白、 preS2蛋白和 S蛋白均可诱导机体产生相应特异抗体，其中抗 -HBs具有保护力， preS2抗体可能与病毒清除密切相关。 c基因产物 -HBcAg是机体特异性 CTL的主要靶抗原。所以目前目的基因的研究主要集中在 S， S1， S2基因 [3]和 c基因 [4]。1.2 质粒载体的选择因涉及到 DNA 疫苗的安全性，美国 FDA已规定应用于人体的质粒 DNA疫苗不应含有氨基甙类抗生素（如氨苄青霉素）抗性基因，他们推荐使用含卡那霉素和新霉素等抗性基因的表达载体。国内学者袁正宏等分别构建插入 HBV表面抗原编码基因的表达载体 pcDNA1.1/SA（无抗性基因）和 pcDNAI/AMP/SA（含氨苄青霉素抗性基因），发现 pcDNAI/AMP/SA的免疫效果优于 pcDNA1.1/SA， pcDNA1.1/SA的免疫效果可被 CpG免疫刺激元件（ ISS）增强，而 pcDNAI/AMP/SA诱生特异性免疫应答的能力则被 ISS抑制 [5]。另外， Waltrand提出：（ 1） HCMV启动子的调节能力较佳。（ 2）在 HCMV启动子控制的 HBV DNA疫苗中，内含子、 neo基因、 HBV X 基因等存在与否意义不大。（ 3） DNA疫苗分子大小对免疫效果可能有影响，因大分子不易被摄取。
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Pr1基因和绿色荧光蛋白基因融合表达载体的构建
目的:以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因为报告基因,类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease,Pr1)基因为目的基因,分别构建含有EGFP-Pr1和Pr1-EGFP融合基因的原核表达载体.方法:将Pr1基因分别连接到EGFP基因的上游和下游,插入质粒pTWIN1,构建表达载体pEGFP-Pr1和pPr1-EGFP.结果:经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,重组菌株在长波紫外线的照射下,均能发出明亮的绿色荧光,并且诱导菌株破碎后均可检测到Pr1蛋白酶的活性.结论:应用基因工程技术成功构建pPr1-EGFP和pEGFP-Pr1融合基因表达载体,EGFP作为Pr1生物标记分子,有利于进一步开展Pr1基因的特异性功能研究.
关键词： 增强型绿色荧光蛋白 融合基因 表达载体 类枯草菌素蛋白酶基因 -
成年大鼠侧脑室注射与脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的比较研究
目的 比较观察脑室注射和脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的范围及表达产物的程度.方法 分别将Ad5CMV LacZ表达载体(20 μl,病毒滴度为1.01×105 pfu/ml)注入成年SD大鼠右侧脑室、尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,在注射后3～28 d将大鼠脑制作成为切片,进行X-gal组织化学反应,观察被转染和表达的细胞形态和数目.结果 在侧脑室内注射后3 d,右侧侧脑室室管膜细胞及其下层开始有病毒载体转染和表达,继之向对侧侧脑室、第三脑室和第四脑室转染和表达产物,脊髓中央管壁偶尔有被转染和表达的细胞;而将等体积和等滴度的Ad5CMV LacZ载体注入尾壳核、内侧隔核一斜角带复合体和背侧海马,则均出现直径约2～5 mm的转染范围,表达产物的细胞离注射原位远处约为5～6 mm,细胞表达产物很局限并相对集中;而侧脑室注射病毒载体可以随脑脊液流动而使转染范围广,但被转染细胞主要集中在室管膜及其下层,离脑室壁远处也只在0.5～2 mm范围内.结论 侧脑室注射病毒表达载体便于基因治疗弥漫性脑疾病;而脑实质注射病毒表达载体则利于基因治疗局部性脑疾病.
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增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达
目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.
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肾癌中氨基肽酶N(CD13)的表达量检测及转染CD13表达载体对癌细胞生物学行为的影响
目的:研究肾癌中氨基肽酶N(CD13)的表达量及转染CD13表达载体对癌细胞生物学行为的影响.方法:取肾癌组织和正常肾脏组织,检测组织中APN(CD13)的含量;培养肾癌细胞株kevt-3,转染0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的CD13表达载后,检测细胞的迁移能力、ATP生成量、迁移和血管新生基因的mRNA含量.结果:肾癌组织中APN的mRNA含量高于正常肾脏组织;临床分期和病理分级越高,肾癌组织中APN的mRNA含量越高;有淋巴结转移的肾癌组织中APN的mRNA含量高于无淋巴结转移;转染CD13表达载体能够剂量依赖性地增加kevt-3细胞的迁移率、ATP生成量以及VEGF、HIF-1α、MMP9、MMP10的mRNA含量.结论:肾癌中氨基肽酶N(CD13)的表达量异常升高;过表达CD13能够促进肾癌细胞的迁移,增加ATP生成以及VEGF、HIF-1α、MMP9、MMP10的表达.
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视网膜发育基因Six3表达载体的构建
目的:Six3在视网膜发育中起着关键性的调节作用,然而商品化的Six3 表达载体尚鲜见,本研究拟以 pBaBb-puro为骨架,构建Six3真核表达载体.方法:以新生乳鼠眼 cDNA 为模板,通过 PCR扩增出Six3 编码序列,经酶切后,用T4 DNA连接酶将其与pBaBb-puro进行连接,经过转化、筛选后,进行酶切和测序鉴定.结果:经RT-PCR 扩增获得了含1002bp的Six3基因编码序列,经过酶切、连接、转化后,挑选 12 个菌落进行PCR检测,筛查到9个菌落含有重组质粒,对其中2个菌落进一步行酶切和测序鉴定,结果与理论预期完全相符.结论:成功构建了pBaBb-puro-Six3 真核表达载体,为进一步研究 Six3 的功能奠定了基础.
关键词： Six3 视网膜 pBaBb-puro 表达载体 鼠 -
shRNA沉默Kir6.2基因表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖和侵袭的影响
目的 构建shRNA体内表达载体pGenesil-3-shRNA,研究抑制Kir6.2基因表达对HepG2细胞增殖和侵袭的影响. 方法 以Kir6.2基因为目的 基因,以产生shRNA质粒载体pGenesil-3为表达模板,细胞内转录合成2条shRNA.重组质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定和测序后,使用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞.实验分为SK组(未转染)、SK-HK组(阴性对照),SK-K1(转染干扰序列1)组和SK-K2(转染干扰序列2)组.G418筛选出荧光单克隆进行培养.Westernblot检测Kir6.2蛋白在各组细胞中的表达.MTT法和Transwell系统分别检测各组细胞的增殖和侵袭能力. 结果 经酶切、测序鉴定,重组质粒符合设计要求.Western blot检测结果显示SK组,SK-HK组、SK-K1组和SK-K2组Kir6.2蛋白质相对表达量分别为0.9349±0.0443,0.9098±0.0195,0.2869±0.0295,0.3256±0.0341;和对照组相比,实验组Kir6.2蛋白减少.MTT法检测SK组、SK-HK组、SK-K1组、SK-K2组细胞的增殖分数分别为0.7523±0.0681,0.7351±0.0589,0.2494±0.0485,0.2261±0.0298,F=0.2401,P=0.000.Transwell实验结果显示,SK组、SK-HK组,SK-K1组、SK-K2组细胞的穿膜数分别为47.0±7.1,40.7±8.0,14.3±5.1,15.0±3.7,F=-30.74,P=0.000.和对照组相比,实验组HepG2细胞增殖和侵袭能力均明显降低.结论 抑制HepG2细胞Kir6.2基因的表达可降低HepG2细胞的增殖和侵袭能力.
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卡氏肺孢子表面糖蛋白siRNA表达载体的构建和鉴定
目的:构建和鉴定卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,Pc)主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,MSG)基因短干扰性RNA(Short interfering RNA,siRNA)表达载体.方法:设计并人工合成针对PC MSG基因的短发夹状(Short hairpin RNA.shRNA)序列并定向克隆到siRNA表达载体pTZU6+1上,采用双酶切后凝胶电泳与DNA测序法进行鉴定.结果:酶切和测序鉴定得到的产物与预期目的基因一致.结论:成功构建卡氏肺孢子主要表面糖蛋白基因siRNA表达载体.
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卡氏肺孢子主要表面糖蛋白UCS基因siRNA表达载体的构建和鉴定
目的:构建并鉴定艾滋病主要机会性感染病原体-卡氏肺孢子(Pneumocystis earinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,MSG)表达调控基因上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的短干扰性RNA(Short interfering RNA,siRNA)表达载体.方法:设计并人工合成针对PC MSG-UCS基因的短发夹状(Short hairpin RNA,shRNA)序列并定向克隆到siRNA表达载体pTZU6+1上,采用双酶切与测序法进行鉴定.结果:酶切和测序鉴定得到的产物与预期目的基因一致.结论:成功构建和鉴定PC MSG-UCS基因的siRNA表达载体.
关键词： PC MSG-UCS siRNA 表达载体 -
卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白上游保守序列基因microRNA表达载体的构建和鉴定
目的:构建和鉴定卡氏肺孢子菌(Pneumoeystis carinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surface glyeoprotein,MSG)表达调控基因上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的microRNA表达载体,并在体外转染到PC中观察其对Pc的抑制作用.方法:设计并人工合成针对PC MSG-UCS基因的1对microRNA序列并定向克隆到表达载体pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR上,序列正确的载体用脂质体转染PC细胞,RT-PCR检测其对PC MSG-UCS基因的抑制作用,扫描电镜观察Pc的超微结构变化.结果:凝胶电泳和测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致.其在mRNA水平能明显抑制Pc的表达并能破坏PC的超微结构.结论:Pc MSG-UCS基因的microRNA表达载体pPC-UCSm构建成功,并能在体外抑制PC的表达.
关键词： 卡氏肺孢子菌 主要表面糖蛋白上游保守序列 microRNA 表达载体 -
转录因子ZNF191腺病毒表达载体的构建及鉴定
目的:构建转录因子ZNF191腺病毒表达载体,为进一步研究ZNF191的生物学功能与肿瘤的基因治疗奠定基础.方法:从HEK293细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增ZNF191基因,并将ZNF191亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV中,酶切及DNA测序鉴定后,将含ZNF191基因的重组穿梭质粒pAdTrack-ZNF 191经PmeⅠ线性化后转化pAdEasy-1感受态细菌.pAdEasy-ZNF191质粒经Pme Ⅰ线性化后转染293T细胞,包装重组腺病毒Ad-ZNF191,并进行PCR鉴定、Western blot检测受感染MCF-7细胞内ZNF191蛋白的表达.结果:证实pAdTrack-CMV-ZNF191及pAdEasy-ZNF191质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-ZNF191包装成功,腺病毒感染MCF-7细胞内ZNF191蛋白表达明显提高.结论:成功构建了ZNF191基因重组腺病毒表达载体Ad-ZNF191,为进一步研究ZNF191的生物学功能与肿瘤的基因治疗奠定基础.
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人BNIP3基因真核表达载体的构建及其对HT-29细胞化疗敏感性的影响
目的 构建人BNIP3真核表达载体,观察BNIP3高表达对人结肠癌细胞HT-29化疗敏感性的影响.方法 PCR法扩增BNIP3基因,酶切后插入质粒pEGFP-C3,构建重组真核表达载体pEGFP-C3/BNIP3.脂质体转染人结肠癌细胞HT-29,Western blot检测BNIP3蛋白表达.MTT法检测5-氟尿嘧啶(5-Fu)的化疗敏感性和细胞增殖,AnnexinV-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡.结果 酶切电泳分析和DNA序列测定证实,重组质粒pEGFP-C3/BNIP3构建成功；转染重组质粒的HT-29细胞BNIP3蛋白明显高表达.与未转染组和转染空质粒pEGFP-C3组比较,转染pEGFP-C3/BNIP3组5-Fu的IC50值显著降低[(120.11 ±5.45)、(113.40 ±4.72) μg/mL vs (19.08 ±2.62) μg/mL,P＜0.05],细胞凋亡率显著增加[(5.51±0.32)％、(7.19±0.47)％vs (41.72±1.48)％,P＜0.05],细胞克隆形成显著减少[(52±6)、(49±5)vs(11±3),P＜0.05],细胞增殖速度减慢.结论 成功构建了人BNIP3真核表达载体,BNIP3高表达可增加HT-29细胞对5-Fu的化疗敏感性.
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人类乳头瘤病毒16 E7真核表达载体构建及对A431皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭的影响
目的 构建HPV16 E7(E7)真核表达载体,观察E7过表达对A431细胞增殖和侵袭的影响.方法 从Casld细胞中抽提总RNA,针对E7序列设计特异引物,进行逆转录和聚合酶链式反应扩增得到E7 cDNA.应用基因工程方法将得到的PCR片段克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点.重组质粒经双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamaineTM2000转染A431细胞.Western blot检测E7在细胞中的表达.WST-1和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力.流式细胞术检测转染前后细胞周期的变化.ELISA检测TGF-β分泌情况.结果 经酶切、测序鉴定,E7基因正确插入到pEGFP-N1多克隆位点,获得pEGFP-E7;Western blot检测结果显示:与未转染组相比,转染组E7蛋白高表达.过表达E7的A431细胞增殖和侵袭能力均显著增强,细胞周期中S期细胞数量增多,G1期细胞数量相对减少.TGF-β分泌增多.结论 E7过表达可改变细胞周期,提高皮肤鳞癌细胞的增殖和侵袭能力,而分泌增多的TGF-β并不能抑制肿瘤的增殖和侵袭.
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TCF4/pcDNA3.0表达载体的构建及其在毛乳头细胞中的表达
目的 构建TCF4/pcDNA3.0表达载体,为深入研究T细胞因子4(T cell factor4,TCF4)基因在毛乳头细胞生物学功能调控中的作用和机制奠定基础.方法 从凝集性生长毛乳头细胞中提取总RNA,RT-PCR获得带有酶切位点的TCF4基因,亚克隆入pCDNA3.0载体中,并通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.稳定转染到毛乳头细胞中进行表达,检测稳定转染前后TCF4表达的变化.结果 从人毛囊毛乳头细胞中获得TCF4基因克隆;成功构建了真核表达载体.经过稳定转染在毛乳头细胞中上调了TCF4基因mRNA和蛋白水平表达,促进了毛乳头细胞的增殖和外分泌功能.结论 TCF4/pcDNA3.0表达载体能在真核细胞中表达.TCF4基因可以促进毛乳头细胞增殖.
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MDR相关新基因CA916798真核表达载体的构建及其对H446细胞增殖的影响
目的 构建新基因CA916798真核表达载体,并观察其对H446增殖的影响.方法 以人A549细胞总RNA为模板,用RT-PCR技术扩增获得CA916798开放阅读框序列,连接入pBluescriptⅡSK克隆载体上,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,酶切与DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将CA916798开放阅读框序列定向连接到真核表达载体pQE-Trisystem中,构成pQE-Tri-CA916798,将pQE-Tri-CA916798转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,脂质体转染人小细胞肺癌细胞系H446细胞,选取稳定转染不同质粒的H446细胞,采用MTT绘制细胞增殖曲线,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率.结果 扩增出CA916798开放阅读框序列,大小约为350 bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致,测序结果完全正确.转染了pQE-Tri-CA916798的H446细胞顺铂作用后增殖速度加快,凋亡率下降.结论 成功构建了pQE-Tri-CA916798真核表达质粒,并初步证实了其与顺铂诱导的肺癌多药耐药相关.
关键词： 肺癌多药耐药相关基因 CA916798基因 H446细胞 表达载体 -
大鼠神经球蛋白基因的克隆及其真核表达载体构建
目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(neuroglobulin,NGB)基因并构建其真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确后,亚克隆入pCDNA3.1(+)载体中,并通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.结果 克隆了Wistar大鼠的神经球蛋白基因,有4个碱基发生了突变;成功构建了真核表达载体.结论 Wistar大鼠脑组织中有NGB表达,成功克隆了该基因并构建了其真核表达载体.
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人HNF1α真核表达载体的构建及表达
目的 构建人肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)真核表达载体,在体外表达并检测.方法 提取HepG2总RNA,用RT-PCR方法制备HNF1α cDNA,进行T-A 克隆.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切测序正确的重组质粒,回收HNF1α cDNA片段,将其亚克隆于pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点内.将构建好的真核表达质粒用脂质体法转染HepG2细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测HNF1α的表达. 结果正确构建了pcDNA3.1(+)-HNF1α重组载体,并且在转染该质粒的HepG2细胞中检测出了HNF1α的高表达. 结论成功地构建了人HNF1α真核表达载体,其可以在体外表达.
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巨噬细胞炎性蛋白4的非融合表达载体的构建和表达
目的探索如何抑制嗜酸性粒细胞的趋化作用,选择β-趋化因子巨噬细胞炎性蛋白4(MIP4)的突变体(Met-MIP4)作为趋化因子受体3的拮抗剂,将Met-MIP4基因在原核细胞中进行非融合表达. 方法设计MIP4基因的PCR引物并进行氨基酸突变,将MIP4 N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸.以正常人肺cDNA文库为模板,PCR方法获取Met-MIP4基因.克隆入载体pUC19,测序验证序列已得到突变.将正确的基因插入到非融合表达载体pBV220中进行表达.结果 PCR产物为220 bp左右的片段,连接入pUC19质粒后测序验证获得正确突变.构建的pBV220非融合表达载体在大肠杆菌DH5-α中表达,经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳显示有大小约8×103的非融合蛋白表达.结论成功突变并克隆了β-趋化因子MIP4基因.Tricine-SDS-PAGE表明,非融合的Met-MIP4突变体已得到表达,为进一步研究其对哮喘的生物治疗奠定了基础.
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P-糖蛋白的融合表达研究
目的对P-糖蛋白胞外段基因进行表达研究.方法根据P-糖蛋白抗原性分布曲线及mdr1基因结构,设计了一对引物,PCR扩增产物插入到pGEM-T中,经测序正确后,再克隆入表达载体pGEX-2T, 构建高效表达载体pGEX-Pgp,转化大肠杆菌DH5α,进行表达、鉴定及纯化.结果经IPTG诱导4 h,蛋白表达即达高峰,SDS-PAGE分析,表达出约30 kD大小的蛋白.结论该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体或筛选其特异性结合肽,进行靶向治疗等工作奠定了基础.
