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靶向Rab9 GTPase siRNA表达载体的构建和鉴定
目的 构建靶向Rab9 GTPase siRNA表达载体.方法 设计有小发夹RNA结构靶向Rab9 GTPase的68个碱基的寡核苷酸,克隆入表达载体pSUPER.neo+EGFP,得到重组质粒pSUPER.neo+EGFP-R1和pSUPER.neo+EGFP-R2,通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定.结果 经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pSUPER.neo+EGFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同.结论 成功构建了靶向Rab9 GTPase siRNA表达栽体,为进一步研究Rab9 GTPase与麻疹病毒复制之间的关系奠定基础.
关键词： Rab9 GTPase siRNA 表达载体 -
E2F3基因真核表达载体的构建和表达
目的 克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因及构建E2F3基因真核表达载体并研究其表达.方法 取新鲜膀胱肿瘤组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增E2F3基因,构建其真核表达载体,测序分析及转染膀胱肿瘤细胞,Western Blot法检测其表达情况.结果 成功克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因、构建E2F3基因真核表达载体,转染后成功表达.结论 人膀胱肿瘤组织E2F3基因克隆及其真核表达载体构建成功,可用于肿瘤生物学的研究.
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人CMV/ARL-1真核表达载体的构建
目的构建人GMV/ARL-1真核表达载体,为进一步建立转ARL-1基因Hep-G2单克隆细胞系奠定基础.方法采用限制性内切酶技术,酶切真核骨架质粒pBK/CMV及另一质粒pBK/ARL-1(内含ARL-lcDNA全长),用TONA连结酶将目的基因连至骨架质粒上,酶切及序列分析的方法鉴定重组质粒.结果经Eco R I、Nco I、Uind Ⅲ酶切鉴定和序列分析,证明ARL-1基因已插入到pBK/CMV真核表达载体上.结论成功地构建了CHV/ARL-1真核表达载体.
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完整人抗-D抗体分子表达载体的构建
目的构建含完整人抗-D抗体重、轻链基因的表达载体,为体外表达完整的抗-D抗体分子打下基础.方法从1株分泌IgM抗-D的细胞株提取总RNA,以随机引物逆转录成cDNA,用所设计的抗体前导区引物进行扩增,克隆、测序后将抗-D抗体重、轻链可变区基因分别和带有人IgG1恒定区和K轻链恒定区的表达载体连接,转化大肠杆菌后提取质粒DNA,用PCR和酶切进行鉴定.结果序列分析发现所扩增的基因符合人Ig的特征,除引导序列外,其余序列和我们以前所发表的Fab段序列一致,PCR和酶切鉴定抗体重、轻可变区基因克隆成功.结论成功地扩增了带引导序列的抗-D抗体可变区基因,并构建了完整人抗-D抗体分子表达载体.
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抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建
目的构建抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因重组表达载体.方法从腮腺炎患者和腮腺炎抗体IgG阳性正常人群的淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA.用相应的引物进行PCR,扩增出轻链和重链Fd段基因,经酶切后分别和噬粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-blue菌株,将轻链和重链Fd基因先后克隆入pComb3中.结果从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约110μg,经逆转录、PCR,分别扩增出约700bD大小的κ、λ和Fd基因.PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5kv,200Ω,25μF的条件下电转化,终转化率为:2.48×107.随机挑取电转化后的10个菌落,经PCR鉴定,共有5个克隆同时含有轻链和重链Fd基因,抗体Fab的重组率为50%.结论获得的抗体Fab重组表达载体是高效、实用的,为下一步构建抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库打下基础.
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烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对红景天发状根的转化
目的:构建烟草根特异性启动子植物表达载体并转入红景天发状根中.方法:以双元表达载体pCAM -BIA1301为基础,用烟草根特异性启动子TobRB7和葡萄糖基转移酶基因UGTR分别取代双元表达载体中的CaMV35S启动子和GUS基因,从而获得了烟草根特异性启动子驱动葡萄糖基转移酶基因的表达载体,命名为pCA-Tob7:UGTR.通过根癌农杆菌介导法转化红景天发状根.结果:成功地获得了转基因阳性发状根,即表明所构建的表达载体已成功整合到了红景天发状根基因组中.结论:首次获得了根特异性启动子植物表达载体并整合到了红景天发状根基因组中,为进一步研究特异性启动子对红景天苷合成的调控作用奠定了基础.
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HBV adr 亚型体外感染肝细胞模型的建立
目的: 构建1.1倍乙型肝炎病毒(HBV) 全基因的真核表达载体,稳定转染L-02细胞,建立HBV adr 亚型体外感染的细胞模型.方法: 以pVUⅡ酶切质粒p3.6Ⅱ获得1.1倍HBV DNA 片段,用牛小肠碱性磷酸酶将经EcoR V线性化的pcDNA3去磷酸化,以T4 DNA 连接酶连接1.1倍HBV DNA 片段和线性化的pcDNA3,将构建的pcDNA3-1.1 HBV以脂质体转染L-02肝癌细胞,经G418稳定筛选.ELISA检测转染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达.RT-PCR检测转染细胞中HBpreS2、HBX的表达.结果: 成功构建了1.1倍HBV全基因真核表达载体,稳定转染L-02后,建立了新的肝细胞系L-02.1Z,其培养上清中可检测到HBsAg、HBeAg的稳定表达,并可检测到HBpreS2、HBX RNA在转染细胞中表达.结论: 该表达载体可介导病毒复制,其稳定转染的细胞可作为一种新型的HBV体外感染模型.
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一种可用于治疗苯丙酮尿症的工程菌株的建立
目的:通过基因重组建立高效表达有活性的PAL菌株,为开创苯丙酮尿症的新疗法奠定基础.方法:对已克隆于pUC19质粒中的水稻苯丙氨酸氨解酶的cDNA进行反向测序,根据测序结果,与pET28系列质粒中的阅读框架结构进行比较,选择相匹配的pET28c质粒作为表达载体,用EcoRⅠ分别切开质粒pUC19-rPAL-1-cDNA和pET28c,切下的2.5 kb rPAL-1-cDNA通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,透析袋回收,酚、氯仿抽提,乙醇沉淀,纯化后溶于双蒸水备用.
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因与质粒DNA表达载体中CpG特定核苷酸序列及其在DNA疫苗中的作用
目的:对赖型钩体DNA疫苗包括内鞭毛蛋白基因和质粒DNA表达载体的CpG特定结构进行分析,为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础.方法:以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原,对内鞭毛蛋白基因(flaB2)及质粒DNA表达载体(VR1012)全核苷酸序列进行计算机分析.以flaB2与VR1012构建重组DNA进行NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验.结果:flaB2共846 bp, G+C%为47.9%;赖型钩体全基因组G+C%为36.8%,内鞭毛的G+C%比基因组高;CG特定核苷酸序列共51个,平均16.59%个bp有1个;flaB2中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共3个,分别为GACGCT 1个,GACGTC 1个,GACGCC1个;质粒DNA表达载体VR1012共4914bp,G+C%为49.4%,CG特定核苷酸序列共250个,平均19.66个bp有1个,VR1012中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共16个,分别为GACGTC 5个,GACGCT 2个,GACGCC 1个,GACGTT 1个,GGCGTT 2个,GGCGCT 2个,GGCGCC 1个,AACGCT 1个,AACGCC 1个和特别重要的TGACGTCA 4个和TAACGCCA有1个,位于5′端456-463;509-516;592-599;778-785,486-493;4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5′端且相对集中.TCG分散共53个,TCGTCG共1个,位于1 873-1 878,NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验的结果表明,加强注射接种后3周"VR1012+flaB2”组动物抗体效价增高(16倍),试验组存活率为90%.结论:研究结果表明赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因及其质粒DNA表达载体构成的DNA疫苗具有明显的免疫原性和免疫保护作用,经DNA分析表明DNA疫苗中特别是质粒表达载体含有TGACGTCA等特定结构,是提高DNA疫苗免疫效能,减少疫苗免疫接种剂量一种行之有效的措施.
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p62参与柳氮磺吡啶抑制NF－κB信号途径和诱导人神经胶质瘤U251细胞凋亡机制的研究
目的：以人神经胶质瘤U251细胞为研究对象，从p62参与核转录因子κB（ NF－κB）信号途径活化角度，探讨柳氮磺吡啶（ SAS）抑制NF－κB信号途径和诱导U251细胞发生凋亡的机制。方法：构建p62 siRNA表达载体，MTT法检测细胞生存率，萤光素酶报告基因分析检测NF－κB转录活性，Western blotting法和间接免疫荧光法检测细胞自噬、凋亡。结果：SAS抑制U251细胞NF－κB转录活性，诱导细胞凋亡和自噬；抑制p62的表达可以增加SAS引起的NF－κB信号途径的抑制和凋亡；SAS通过自噬引起p62蛋白表达下降，抑制自噬可以拮抗SAS引起的NF－κB信号途径的抑制和凋亡。结论：p62蛋白水平在SAS诱导的NF－κB信号通路的抑制和凋亡中起重要作用，靶向抑制p62可能成为提高SAS抗肿瘤效果的新策略。
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抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体的构建及评价
目的 构建抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体,并验证其表达效率及功能.方法 通过PCR方法将鱼精蛋白截短片段序列与抗黑色素瘤细胞表面抗原单链抗体基因相连接;采用TaKaRa pMD 19-T载体试剂盒将PCR后获得的融合蛋白扩增产物进行T载体构建;构建GST融合蛋白表达载体以实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,经两步亲和纯化后获得scFv-tP蛋白;采用凝胶阻滞电泳迁移率变动分析EMSA技术检测Anti-MM scFv-tP与siRNA的结合活性;荧光分子标记scFv-tP蛋白后分别采用流式细胞术检测和共聚焦显微镜观察其与LiBr细胞株进行细胞表面抗原结合活性验证;采用不同浓度FITC标记的siRNA与scFv-tP进行混合,分别与LiBr细胞(A)及DU145细胞(B)进行混合孵育,观察肿瘤细胞对携载siRNA的单链抗体的内化活性.结果 成功构建抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白(Anti-MM scFv-tP)表达载体;实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,可获得较纯的scFv-tP蛋白;Anti-MM scFv-tP蛋白与siRNA有明显的结合与携载能力,可以有效与LiBr细胞表面特异性抗原进行结合,且有较强的内化活性.结论 本研究构建的抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体可稳定表达,Anti-MM scFv-tP蛋白具有siRNA结合携载能力,可靶向识别结合进入LiBr细胞,为后续进一步研究该单链抗体融合蛋白靶向载体携载siRNA在体内外抑制恶性黑色素瘤恶性进展奠定坚实的基础.
关键词： 恶性黑色素瘤 单链抗体 表达载体 Anti-MM-scFv-tp -
构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体
目的 构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体.为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础.方法 将前期构建的PTEN shRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeⅠ线性化后转化人pAdEasy-1感受态细菌.pAd-U6-shRNA质粒经PacⅠ线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Western blotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达.结果 证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低.结论 成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础.
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乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响
目的为研究乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)20/2l bp部分缺失(nt 1 748/1 747至nt 1 767)及同时存在的A1 896点变异对病毒抗原表达的影响.方法利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行EUSA检测及Western-blotting分析.结果变异株分泌到细胞外的HBsAg、HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少.结论 HBV CP 20/21 bp部分缺失株及同时存在的A1 896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降.
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Akt shRNA载体的构建及其对结肠癌细胞株Lovo Akt基因表达的抑制作用
目的 构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,通过RNAi下调Akt基因在结肠癌Lovo细胞系中的表达,观察对结肠癌细胞生长的影响.方法 将靶向人Akt基因的两条shRNA(Akt1-U6-1#;Aktl-U6-2#)表达序列克隆到入门载体pENTRTM/U6的黏性末端,测序鉴定后与目的表达载体Plentio/Block-iT DEST Vector进行LR位点特异性重组；分别将入门载体与目的表达载体转染入Lovo细胞,对细胞株行RT-PCR和Western blotting检测,观察siRNA对靶基因Akt的抑制效果.结果 DNA测序证实pENTRTM/U6-TF-shRNA入门载体和Plentio/Block-iT DEST目的表达载体为阳性克隆,转染Lovo细胞后,Akt基因在mRNA和蛋白水平的表达量受到明显抑制.结论 成功构建了靶向人Akt的shRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Lovo细胞Akt基因表达,为进一步研究Akt的功能和肿瘤的基因治疗奠定了实验基础.
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重组人TFF2乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建
目的 构建带c-myc分子标签的人三叶因子家族2(hTFF2)融合基因c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体,以便进一步构建能表达活性c-myc-hTFF2融合蛋白的乳酸链球菌工程菌.方法 根据hTFF2的氨基酸表达序列和乳酸链球菌的氨基酸密码子,以c-myc作为分子标签,设计c-myc-1 TFF2的cDNA序列,并在其5'端和3'端添加SalⅠ和BamHI酶切位点;将目的基因片段设计成14个相互互补的寡核苷酸,经聚合酶链式反应,得到目的基因c-myc-hTFF2;将c-myc-hTFF2连入pBluescriptⅡsk(+)载体,构建其克隆载体pBS-TFF2并进行酶切鉴定及DNA测序;分别用SalⅠ/BamHI和XhoⅠ/BamHI对pBS-TFF2和pNBC1000进行双酶切反应,再通过连接反应将c-myc-hTFF2融合基因插入pNBC1000,构建c-myc-hTFF2大肠杆菌表达载体(pNTFF2);用XbαⅠ对pNTFF2和穿梭载体pTRKH2单酶切反应,并通过连接反应将c-my-hTFF2的表达载体连入穿梭载体pTRKH2,完成乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建,并进行酶切鉴定.结果 成功构建了c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体pTRTFF2.结论 体外基因拼装是构建目的基因有效的方法;pTRTFF2的构建为构建乳酸链球菌工程菌奠定了基础.
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PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达
目的构建PcDNA4/His C-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL).方法应用PCR从含有中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/His C真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性.结果从pGEM-MBL中扩增得到约750 bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5 100和750 bp片段,测序鉴定与预期的完全一致.RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58 000和87 000条带,其中29 000蛋白带可与6-His抗体反应.纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1:819 200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1:25 600.结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件.
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EBV-LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定
目的:构建EB病毒LMP1反义基因的真核表达载体.方法:通过PCR方法,扩增EBV-LMP1基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒pcDNA3.1的多克隆位点中.经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体.结果:酶切产物和PCR产物的凝胶电泳显示400bp左右的目的基因片段,测序结果显示与已知LMP1基因序列一致.结论:成功构建了LMP1反义基因的真核表达载体.
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人pcsk9基因原核表达载体的构建及诱导表达
目的 构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体,优化pcsk9诱导表达条件.方法 聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列.扩增产物经双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体;将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,分别在不同条件下对其进行诱导,获得pET-28b-pcsk9的佳诱导表达条件.结果 成功构建了pET-28b-pcsk9重组表达载体,其佳表达条件为菌液光密度值取0.6,诱导温度取30℃,诱导剂终浓度取1.0 mmol/L,诱导时间取8 h.结论 该重组表达载体构建成功,在大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中可有效地表达,对诱导所用的温度和时间相对比较敏感.
关键词： 人前蛋白转化酶枯草溶菌素9 表达载体 诱导表达 优化条件 -
启动子甲基化致OPCML基因失活在胃癌发病中的作用
目的 探讨OPCML基因在胃癌细胞株中的失表达及其与基因启动子CpG岛甲基化的关系,并分析OPCML对胃癌细胞增殖的影响.方法 (1)实验组为胃癌细胞株(SGC7901、AGS、MKN28、MKN45、N87、KATOⅢ和SNU1),对照组为正常胃组织,分别采用RT-PCR检测两组细胞OPCML mRNA的表达.(2)用亚硫酸盐修饰正常胃组织的DNA和胃癌细胞MKN45的DNA,分别采用甲基化特异性PCR法检测OPCML基因启动子区甲基化情况.(3)实验组为药物处理组,即5-氮胞苷(5-AZA)去甲基化处理胃癌细胞MKN45,对照组为未经药物处理的MKN45,分别采用RT-PCR检测OPCML mRNA的表达变化.(4)RT-PCR检测转染OPCML表达载体及pcDNA3.1空载体后mRNA的表达情况.(5)实验组为OPCML表达载体转染胃癌细胞AGS,对照组为空载体转染胃癌细胞AGS,使用浓度为0.5 mg/mL的新霉素(G418)对转染细胞进行筛选,观察OPCML对胃癌细胞AGS集落形成的影响.结果 (1)在胃癌细胞株中OPCML mRNA 的表达率显著低于正常胃组织.(2)胃癌细胞AGS和MKN45的甲基化程度明显高于正常胃组织.(3)5-AZA处理MKN45细胞后,OPCML表达上调.(4)OPCML表达载体转染HEK293A、AGS、MKN45细胞后,RT-PCR检测显示OPCML高表达.(5)外源性表达OPCML可抑制胃癌细胞AGS的集落形成率.结论 OPCML基因作为肿瘤抑制基因,在胃癌细胞中的表达下调.OPCML表达下调与该基因启动子区甲基化密切相关.药物性去甲基化处理能够恢复OPCML的表达.在表达沉默的AGS细胞中外源性表达OPCML,抑制集落形成率.
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IL-37融合EGFP真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的：构建白介素－37（interleukin-37，IL-37）与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）融合基因真核表达载体，并检测其在293T细胞中的表达。方法：通过PCR分别扩增出IL-37和EGFP基因，经酶切和测序鉴定正确后，克隆入真核表达载体 pcDNA3．1，用 Linker（G4S）3连接2个目的基因片段，构建 IL-37-GFP 融合基因真核表达质粒 pcDNA3．1／IL-37-EGFP，将其转染到293T 细胞中，观察荧光产生情况，用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测IL-37的表达情况。结果：经酶切和测序鉴定，由linker连接的IL-37-GFP 融合基因正确克隆入表达载体pcDNA3．1，重组表达质粒 pcDNA3．1／IL-37-EGFP转染293T 细胞后，用荧光显微镜检测显示荧光蛋白在细胞中表达，RT-PCR 与 Western blot 均检测到高水平IL-37 mRNA 和IL-37蛋白的表达。结论：成功构建了IL-37-融合报告基因 EGFP 的真核表达载体，并在293T细胞中得到了有效表达，为进一步研究IL-37的功能和表达调控奠定了实验基础。
