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青海弧菌发光检测法可快速检测饮用水中的有害物质
细菌发光实际上是细菌的光呼吸过程,即菌体借助活体细胞内具有的ATP、萤光素和萤光素酶发光.
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醋酸铅对PC12细胞核转录因子-кB转录活性的影响
目的 探讨醋酸铅及NF-кB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对核转录因子-kappa B(NF-κB)转录活性的影响. 方法 将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)暴露于不同浓度的醋酸铅0、12.5、25、50、100、200、400、800和1600 μmol/L,采用四唑盐比色实验(MTT)检测IC50值.用脂质体将pNF-кB-Luc报告基因质粒转染入PC12细胞,转染后的PC12细胞分别暴露于不同浓度的醋酸铅(100、200和400 μmol/L)及不同浓度醋酸铅加PDTC 100 μmol/L,24小时后采用萤光素酶检测试剂盒检测萤光素酶活性. 结果 用不同浓度的醋酸铅处理细胞24小时,其生长增殖受到不同程度的抑制,且呈现出剂量-反应关系,其IC50值为(533.966±100.830) μmol/L.用不同浓度的醋酸铅处理转染后的PC12细胞24小时,结果显示:PDTC对照组萤光素酶活性较空白对照组降低(P＜0.01);铅处理组萤光素酶活性较空白对照组高(P＜0.01),且具有剂量依赖性;铅+PDTC联合作用组与PDTC对照组相比,PC12细胞内萤光素酶活性增高(P＜0.01). 结论 醋酸铅可诱导PC12细胞的NF-кB转录活性升高.
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活体生物萤光成像技术新进展
活体生物萤光成像技术(in vivo bioluminescence imaging)是近年来发展起来的一项崭新的分子、基因表达的分析检测系统.与传统的检测方法相比具有巨大的优越性,堪称是分子基因检测领域的革命性技术.随着萤光成像设备的进一步完善以及转基因动物的构建开发,在欧美等发达国家活体生物萤光成像技术已被广泛地应用于感染、肿瘤免疫及治疗、自身免疫性疾病、器官移植、基因治疗、药物开发等实验领域.本文就活体生物萤光成像技术的发展和应用作如下综述.
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利用NF-κB转录活性萤光素酶报告系统检测白细胞介素1及白细胞介素1受体拮抗剂的生物活性
目的:利用NF-κB转录活性萤光素酶报告系统,建立新的白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)和白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1ra)生物学活性的检测方法.方法:运用萤光素酶转录报告系统,选用小鼠胸腺瘤细胞系EL4细胞(EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1受体表达),以pNF-κB-luc质粒和内对照pRL-TK质粒共转染,并加入IL-1β激活,以双萤光素酶报告基因检测系统检测IL-1β及其抑制剂IL-1ra的生物学活性.结果:这种方法检测到IL-1β激活NF-κB报告基因表达萤光素酶,并且这种激活可被IL-1ra所抑制,实验重复性好.IL-1β在5 μg/L为激活NF-κB报告基因表达萤光素酶的佳浓度,并可被IL-1ra 50 μg/L大抑制.结论:这种检测方法的建立为今后对IL-1β和IL-1ra的生物学活性检测提供了新的途径.
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健心方对核因子-κB活性的影响
目的:观察脂多糖对CHO-K1细胞核因子-κB活性的影响及健心方含药血清对脂多糖刺激的调节作用.方法:①实验于2005-03/05在解放军广州军区武汉总医院实验中心和南方医科大学附属南方医院肿瘤中心实验室完成.选用清洁级SD大鼠12只.随机将鼠分为2组:动物治疗组和动物对照组,每组6只.②动物治疗组给予3.2 kg/L健心方口服液(水煎醇提法制备,主要成分:黄芪、太子参、川芎、当归、葶苈子、云苓、桂枝、香附等),动物对照组用等量生理盐水以获得空白对照血清.灌胃体积均为10mL/kg.1 d剂量分2次服,连续给药3 d,第4天1次服用全天剂量后采血制备含药血清和空白对照血清.③体外培养CHO-K1细胞,分为6组:对照组:转染质粒(pNF-κB-TA-Luc和pCMV-β-半乳糖苷酶共0.5 μg)后加用脂多糖刺激;感染1组:转染质粒并加含Toll样受体4全长的重组腺病毒感染;刺激1组:转染质粒并加含Toll样受体4全长的重组腺病毒感染后用脂多糖刺激;治疗组:转染质粒、加含Toll样受体4全长的重组腺病毒感染并用脂多糖刺激后加用含药血清干预;感染2组:转染质粒并加含Toll样受体4细胞外段的重组腺病毒感染;刺激2组:转染质粒并加含Toll样受体4细胞外段的重组腺病毒感染后用脂多糖刺激.④检测各组细胞核因子-κB相对活性,即相对发光值(荧光素酶强度值/β-半乳糖苷酶值).③数据作完全随机设计方差分析,组间比较用LSD检验和Dunnett(双侧)检验.结果:大鼠12只均进入结果分析.荧光素酶报告基因检测结果表明,相对发光值:对照组细胞明显高于感染1组(3 560±57,1 634±38,P<0.05);刺激1组细胞明显高于对照组、感染1组(8767±82,P<0.05,0.01);感染2组、刺激2组细胞明显低于对照组(530±74,536±71,P<0.05);治疗组明显低于刺激1组(1 820±24,P<0.05),但明显高于刺激2组(P<0.05),略低于转染后对照组,但差异不明显(P>0.05).结论:健心方含药血清可部分拮抗脂多糖导致的核因子-κB激活作用;Toll样受体4是脂多糖激活细胞的关键受体,健心方含药血清的拮抗作用可能是通过阻断了Toll样受体4对脂多糖的识别造成的.
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活体生物萤光成像技术及新进展
活体生物萤光成像技术(in vivo Bioluminescence Imaging)是近年来发展起来的一项崭新的分子、基因表达的分析检测系统.它由敏感的萤光照相机(charge coupled device camera,CCD camera)及其分析软件和作为报告子的萤光素酶(luciferase)和萤光素(luciferin)组成.
关键词： 活体生物萤光成像技术 萤光素 萤光素酶 -
动物活体光学成像的应用进展
随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入,人类对疾病和对生命本质的认识不断被追朔到蛋白质、基因水平.在上个世纪发展起来的CT、MRI、PFT、超声等宏观影像技术已经远不能满足对活体环境内细微生命过程的探询.组织切片和免疫染色能够部分解释一些生物现象,但是需要研究对象与活体组织的分离,所得结果与其在活体内机制难免有所偏离,甚至完全相反.荧光染料(fluorescent dye)能对多种细胞共价标记并进行活体显像,但多被限制于体外培养的细胞.
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活化转录因子 ATF1、ATF2对 USP22基因启动子活性的调节
目的：克隆人活化转录因子 ATF1基因和 ATF2基因蛋白编码序列，分别构建真核细胞表达载体，进而研究高表达 ATF1和 ATF2对泛素水解酶22（ubiquitin-specific processing enzyme 22，USP22）基因启动子转录活性的影响。方法RT-PCR 扩增 ATF1基因和 ATF2基因蛋白编码序列，分别与 pVAX1真核表达载体连接；测序、酶切鉴定重组载体；Western Blot 检测外源性 ATF1和 ATF2在靶细胞 Hela 细胞中的表达；pVAX1-ATF1、pVAX1-ATF2分别与含野生型 USP22启动子的萤光素酶报告质粒或其 CREB 位点突变体质粒共转染，双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性的表达。结果重组质粒 pVAX1-ATF1、pVAX1-ATF2构建成功，外源性 ATF1、ATF2在 Hela 细胞内有效表达；转染 pVAX-ATF1促进 USP22启动子活性升高（83％±11％），转染 pVAX-ATF2促进 USP22启动子活性升高约（52％±8％）；而突变 CREB 位点均可导致上升作用的消失。结论成功构建了ATF1、ATF2真核表达质粒，高表达外源性 ATF1和 ATF2均可通过 CREB 位点激活 USP22启动子的转录活性。
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人TIPE2基因启动子的鉴定及其表达调控区域的研究
目的 克隆人TIPE2基因启动子区及一系列5′截短片段,并鉴定其DNA表达调控区域.方法 采用PCR技术从人基因组DNA中克隆扩增TIPE2基因5′上游1252 bp启动子序列并对该片段5′端的截短,分别瞬时转染人卵巢癌来源细胞系SKOV3,通过双萤光素酶活性的检测鉴定其启动子活性及表达调控区域.结果 克隆扩增的8个TIPE2基因启动子截短片段经测序证明无误;TIPE2-pGL4-P1重组质粒双萤光素酶活性检测显示其具有明显的启动子活性,约为pGL4-Basic的7.9倍;5′系列截短片段重组质粒的启动子活性检测显示,与1252bp片段相比,TIPE2上游-965～-593bp、-501～-390bp缺失,启动子活性分别升高6.38、7.82倍;-593～-501bp的缺失,使-501～+79 bp片段相对于-593～+79 bp片段的启动子活性降低2.04倍.结论 人TIPE2基因上游1252 bp区域有明显的启动子活性,该片段内存在2个潜在的负性调控区和1个潜在的正性调控区.
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Sp1真核表达载体的构建及对USP22基因转录活性的影响
目的 克隆人sp1基因,构建真核表细胞达载体pVAX-Sp1,研究其对USP22基因转录活性的影响.方法 Trizol试剂快速提取人肝癌细胞株HepG2总RNA,经RT-PCR扩增Sp1基因序列,与pVAX1真核表达载体连接;测序、酶切鉴定重组载体;pVAX1-Sp1与含USP22启动子的萤光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性表达.结果 测序及酶切结果显示重组质粒pVAX1-Sp1构建成功;高表达sp1可使USP22启动子的转录活性降低(P＜0.01).结论 成功构建了sp1真核表达质粒,sp1对USP22启动子具有转录抑制作用.
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人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子区克隆与活性分析
目的 克隆人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶(cGCX)基因5'侧翼启动子区,并对其转录活性进行分析.方法 对GGCX基因5'侧翼区进行生物信息学分析,预测其转录调控区域;从人肾组织中提取基因组DNA,以其为模板扩增GGCX基因启动子区,通过酶切鉴定及测序分析无误后,将其构建至萤光报告基因载体pGL3-basic中,瞬时转染至Hela细胞,检测萤光素酶水平,从而分析扩增启动子区的转录活性.结果 成功克隆长度为804 bp(-891～-88)的GGCX基因启动子片段,并构建相应的萤光素酶重组子pGL3.GGCX Promoter,转染Hela细胞48 h后检测萤光素酶活性显示,pGL3-GGCX Promoter与空质粒对照pGL3-basic相对萤光素酶值分别为16.92±4.01与0.02±0.01,pGL3-GGCXPromoter萤光素酶活性显著增强(P<0.05).Matlnspector等分析显示该片段具有多个转录因子结合位点.结论 成功构建含有GGCX基因启动子序列的萤光素酶报告系统,为进一步研究GGCX基因功能及其转录调控奠定了基础.
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草酸钙尿石症患者肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子序列分析及其活性研究
目的 分析草酸钙尿石症患者肾组织γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)基因启动子序列多态性,并探讨该序列变化对启动子活性的影响.方法 分别以42例草酸钙尿石症患者肾组织(尿石组)与31例非结石肾组织(肾肿瘤癌旁正常组织,对照组)基因组DNA为模板,PCR扩增GGCX基因5'-侧翼启动子区1329 bp片段(-1270～+58 bp),电泳鉴定后,分别对两组PCR产物测序.筛选差异启动子序列克隆至萤光素酶报告基因载体pGL3-basic,转染293细胞,双萤光素酶检测启动子活性.结果 与Emembl正常序列比较,尿石组启动子片段测序共发现4处变异位点,-804 bp处TT缺失(refsnp ID:rs11433794),-704 bp处A→G、-511 bp处A→G、-115 bp处T→C.其中尿石组rs1143794SNP发生明显高于对照组(P＜0.05).构建含rs11433794SNP位点的萤光素酶重组子pGL3-GGCX Promoter(804TT),与正常序列的重组子pGL3-GGCX Promoter比较,pGL3-GCA2X Pro-motet(804TF)转录活性明显下降(P＜0.01).结论 GGCX启动子区rs11433794 SNP位点可能与草酸钙尿石症发生存在一定关系,该SNP位点可导致启动子转录活性下调,导致GGCX基因表达下降.
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人心肌肌球蛋白轻链基因启动子驱动的GFP和Luc报告基因在人心肌细胞系中的表达
目的:构建人肌球蛋白2v基因启动子(pMLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体并观察其在人心肌细胞系(HCM)和人肺癌细胞株A549中的整合表达特征.方法:应用去毒化的人类I型免疫缺陷病毒和pMLC2v-GFP或pMLC2v-Luc报告基因构建慢病毒示踪载体,转染HCM和A549细胞,激光共聚焦显微镜及生物发光检测仪观察2种报告基因在不同细胞生长进程中的表达特征.非特异性启动子驱动的GFP(GFPC)和红色荧光蛋白(RFPC)报告基因作为对照.结果:2种细胞转染GFPC和RFPC后第3 d,都表达GFP和RFP;而HCM只在转染pMLC2v-GFP和pMLC2v-Luc 21 d后表达GFP和Luc,A549细胞不表达.结论:pMLC2v主要在培养21 d后新增殖的人心肌细胞中驱动GFP和Luc报告基因表达,这为监测干细胞向心肌细胞的分化进程提供了可靠的病理及活体示踪工具.
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PDCD5对肥厚心肌的保护作用及作用机制
目的：探讨程序性细胞死亡分子5（PDCD5）在心肌肥厚发生发展过程中的作用及机制。方法：腹主动脉缩窄术（AAC）建立大鼠心肌肥厚病理模型；苯肾上腺素（ PE）刺激分离培养的乳鼠心肌细胞肥大；RT－PCR和蛋白印迹实验分别检测mRNA及蛋白表达；含PDCD5 cDNA腺病毒或PDCD5 shRNA腺病毒转染心肌细胞以过表达或敲低PDCD5；萤光素酶报告基因系统及染色质免疫沉淀技术检测活化T细胞核因子（ NFAT）与PDCD5启动子区的结合。结果：在AAC所致肥厚心肌组织及PE刺激的肥大心肌细胞中，PDCD5表达量均显著增加；PDCD5过表达可抑制PE诱导的心肌肥大，而敲低PDCD5则诱导心肌细胞肥大并加重PE刺激的心肌肥大。肥大心肌细胞中NFAT表达量增高，升高的NFAT可与PDCD5启动子结合，上调PDCD5表达量。结论：心肌肥大过程通过NFAT信号通路上调PDCD5表达量，增高的PDCD5反馈性抑制心肌肥大，从而对心肌起保护作用。
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同型半胱氨酸通过激活AT1受体加重小鼠血管炎症
高同型半胱氨酸血症（ HHcy）是心脑血管疾病的独立危险因素，已有报道Hcy可以升高AT1受体的mRNA和蛋白表达水平。本研究主要运用了Ca2＋成像、双萤光素酶报告基因、激光共聚焦显微镜等方法。我们首先发现Hcy体外刺激小鼠血管环可引起白细胞介素6（IL－6）及单核细胞趋化蛋白1（MCP－1）的释放增加，在AT1受体敲除小鼠的血管环中被明显抑制。 Hcy可激活AT1受体经典的Gq信号通路及β－arrestin－2信号通路，并引起AT1受体内化。本文找出了Hcy在心血管系统内的受体，并发现Hcy可通过AT1受体加重血管炎症损害。
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二甲双胍通过激活AMPK和抑制HNF4α而抑制血管紧张素II引起的TGF－β1产生
目的：近年来研究发现一线降糖药二甲双胍（ metformin）可通过激活AMPK发挥心血管保护作用。本研究旨在探讨met－formin能否通过激活AMPK抑制Ang II引起的心脏成纤维细胞TGF－β1产生及其相关机制。方法：10周龄野生型C57BL／6和AMPKα2－／－小鼠，皮下植入微渗泵给予Ang II （3 mg? kg－1? d－1）7 d，同时皮下注射metformin（200 mg? kg－1? d－1）。原代分离培养成年小鼠心脏成纤维细胞（ AMCF）。采用real－time PCR、Western blot、双萤光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀技术（ ChIP）等方法进行研究。结果：在野生型C57BL／6小鼠，metformin可抑制Ang II引起的心脏纤维化及TGF－β1的产生，而在AMPKα2－／－小鼠中，metformin则不能抑制Ang II引起的纤维化和TGF－β1产生。在野生型AMCF，metformin抑制Ang II引起的TGF－β1的产生，Compound C（ AMPK抑制剂）能够逆转metformin的抑制作用。进一步研究发现，Ang II上调肝细胞核因子4α（ HNF4α）蛋白表达，增加HNF4α与TGF－β1基因启动子区的结合，双萤光素酶报告基因实验证实HNF4α作用于TGF－β1基因启动子区，并介导其转录。 HNF4α腺病毒过表达可增加AMCF中TGF－β1的产生；相反，通过慢病毒转染HNF4αsiRNA后，Ang II引起的TGF－β1生成增加被抑制。这些结果提示HNF4α介导Ang II引起的TGF－β1转录表达。 Metformin可抑制Ang II引起的HNF4α蛋白上调，Compound C可以逆转此作用，同时ChIP结果也表明metformin能够抑制Ang II引起的HNF4α与TGF－β1的结合。结论：Metformin通过激活AMPK抑制HNF4α蛋白表达及其与TGF－β1转录区的结合，进而抑制Ang II引起的TGF－β1转录表达增加。
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硫化氢通过KDR／mTOR／miR－640／HIF1 A途径促进血管新生
硫化氢（ H2 S）是一种能够促进血管新生的气体信号分子。本实验中，我们证实了H2 S在整体实验和体外实验中均能够促进血管新生。 MicroRNAs是一类小的、保守的非编码RNA，能够在缺血性损伤和肿瘤形成过程中调节血管新生。经NaHS （ H2 S供体）处理的人脐静脉内皮细胞中，miR－640水平显著下降；过表达miR－640阻断H2 S的促血管新生效应。同时，双萤光素酶实验结果表明HIF1A是miR－640的一个直接靶基因，常氧条件下H2 S升高HIF1A的蛋白水平和转录活性，而敲低HIF1A阻断H2 S的促血管新生作用。进一步实验结果显示，H2 S通过KDR－mTOR途径调节miR－640和HIF1A。 miR－640可能是血管新生相关疾病的一个治疗靶点。
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小鼠Omi／HtrA2基因启动子萤光素酶报告载体的构建及转录活性分析
目的：通过构建小鼠Omi／HtrA2基因启动子萤光素酶报告载体并进行转录活性分析，深入研究小鼠Omi／HtrA2转录调控发生的机制。方法：本实验构建覆盖小鼠Omi／HtrA2基因5’侧翼区（－1205 bp～＋93 bp）区域的一系列启动子萤光素酶报告基因载体，将其转染至小鼠成纤维细胞NIH3T3、大鼠心肌细胞H9c2和人胚肾细胞HEK293，并进行萤光素酶活性检测。结果：小鼠Omi／HtrA2启动子在－1205 bp～－838 bp和－146 bp～＋93 bp区域活性高，生物信息学分析这些启动子区域可能存在HSF1、SP1、AP、p53等转录因子结合位点。结论：初步证实－1205 bp～－838 bp和－146 bp～＋93 bp区域为CFL2启动子的活性区域。
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ZBTB20是甲胎蛋白基因的一个序列特异性转录阻遏子
目的：探究ZBTB20结合甲胎蛋白（ AFP）基因启动子发挥转录抑制作用的关键序列。方法：依赖ELISA的DNA－蛋白实验、传统的凝胶阻滞实验（ EMSA）、双萤光素酶报告基因检测和定量PCR技术。结果：AFP基因启动子－104／－86区域是ZBTB20可以结合的小有效关键序列。我们利用定量PCR检测了ZBTB20肝脏特异性敲除小鼠和对照小鼠肝脏中HNF1α、C／EBPα、HNF3α、NF1、p53等转录因子的mRNA表达水平并没有明显改变。结论：ZBTB20通过结合AFP基因启动子－104／－86区域从而发挥了对AFP基因的转录抑制的作用。
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Endostatin对小鼠巨噬细胞极化的影响及机制研究
目的：观察endostatin对小鼠巨噬细胞极化的影响。方法：Endostatin转染RAW264．7细胞和小鼠骨髓巨噬细胞（ BM－DMs）；RT－PCR、ELISA、HE染色和MTT检测其对RAW264．7细胞的影响；流式细胞术、ELISA、real－time PCR、Western blot和萤光素酶报告基因检测巨噬细胞极化标记物和NF－κB转录活性。结果：表达质粒能使RAW264．7细胞和BMDMs高表达en－dostatin；HE染色和MTT发现endostatin使RAW264．7细胞的形态发生变化并抑制其增殖；流式细胞术、ELISA和real－time PCR发现，endostatin能使RAW264．7细胞和BMDMs高表达NOS2、IL－6和IL－12p40（M1型巨噬细胞标志物），同时使CD206、IL－10和Arg－1（M2型巨噬细胞标志物）表达下降或不变；萤光素酶报告基因发现endostatin使NF－κB的转录活性增加；Western blot发现p－IκBα、p－p65和p－Stat1表达增加，而p－Stat3表达下降。结论：Endostatin可能通过调节NF－κB通路使小鼠巨噬细胞向M1型发生极化。
