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MicroRNA-21、PTEN基因真核及shRNA表达载体构建
为了构建microRNA-21、第十号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)真核表达载体pEGFP-N1-pre-miR21、pEGFP-N1-PTEN及短发夹状RNA(shRNA)表达载体Psilencer4.1-CMV-mir21-shRNA、Psilencer4.1-CMV-PTEN-shRNA,我们根据microRNA-21、PTEN基因序列设计合成shRNA及PCR引物；将microRNA-21、PTEN shRNA片段退火后的DNA模板定向克隆到Psilencer4.1-CMV质粒；另采用RT-PCR技术从人结肠癌细胞HCT-116中扩增pre-miR-21及PTEN,并将PCR产物双酶切后定向克隆到pEGFP-N1质粒上,构建重组载体.经菌落筛选、双酶切及DNA测序分析检测重组载体构建是否成功.结果显示筛选出的阳性克隆经双酶切鉴定得到与载体及目的片段大小一致的两条片段.测序证实目的基因pre-miR-21、PTEN及其shRNA序列分别正确连接到pEGFP-N1及Psilencer4.1-CMV的多克隆位点.结论:成功构建microRNA-21、PTEN基因真核表达及shRNA表达载体,为进一步研究microRNA-21及PTEN基因在结直肠癌中的作用奠定了基础.
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phyA基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达
利用自行筛选、鉴定的黑曲霉F246,根据植酸酶(phyA)基因成熟肽编码序列设计引物,直接PCR扩增phyA,经酶切分析、DNA测序分析证实phyA基因克隆成功.从pMD18T-phyA克隆中获得phyA编码序列,将其与pET30a+质粒连接,构建pET30a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得了高效表达.重组质粒经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为50 kDa,此重组蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白的36.62%,酶活性较天然植酸酶高8倍以上.本研究为大量获得高活性植酸酶以及开发新型微生态制剂奠定了基础.
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STAT3基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胃癌细胞生长和侵袭的抑制作用
目的 构建信号传导及转录活化因子3(STAT 3)基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,探讨STAT 3抑制后对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法 根据STAT 3 Mrna 编码序列,设计RNA干扰靶点,构建STAT 3基因的特异性小RNA干扰质粒(psiRNA-H1/STAT 3),使用脂质体转染MKN-45细胞,实验分为对照组、psiRNA-H1转染组和psiRNA-H1/STAT 3转染组.通过RT-PCR和Western blot检测STAT 3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达的影响; MTT比色法检测细胞的生长抑制率; 采用流式细胞术检测转染后对MKN-45细胞凋亡的影响; 采用Boyden小室侵袭实验检测转染后MKN-45细胞侵袭力的变化.结果 成功转染重组体的MKN-45细胞中STAT 3 Mrna和蛋白表达明显下降(P＜0.05).psiRNA-H1/STAT 3转染组各时相均明显抑制MKN-45细胞生长,且MKN-45细胞凋亡率为34.26%,相比对照组(3.75%)和psiRNA-H1转染组(4.43%)明显升高(P＜0.01).另外,psiRNA-H1/STAT 3转染组MKN-45细胞侵袭力较另外2组明显减弱(P＜0.01).结论 成功构建了针对STAT 3基因的shRNA表达载体,通过转染MKN-45细胞,在体外能有效抑制人胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达,细胞增殖、侵袭能力减弱并且促进细胞凋亡,为STAT 3基因靶向治疗提供一定的实验依据.
关键词： 信号传导及转录活化因子3 短发夹RNA 胃癌 表达载体 -
木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建
目的 克隆木薯醇腈酶(HNL) cDNA构建表达载体,以实现木薯醇腈酶基因的高效表达.方法 运用 RT-PCR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长cDNA序列,将其克隆至质粒pBluescript SK中进行序列分析,再利用PCR将其再克隆到酵母表达质粒pPIC3.5K上.结果 经测序分析表明,克隆的cDNA片段和文献报道的4个木薯HNL cDNA 相比,核苷酸同源性高为99.1%,氨基酸同源性高为98.8%.结论 经双酶切鉴定的结果表明重组表达载体的表达载体构建成功.
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hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定
目的 构建人雌激素受体α亚型配体结合区(hERα-LBD)的原核表达载体,并进行表达蛋白的沽性鉴定.方法 以hERα-LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα-LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体(pGEM-T-easy)连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a(+)质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD,转化到大肠杆菌JMI09和BL21感受态细胞中.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白(BSA)偶联抗原(E2-BSA)与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性.结果 PCR扩增的hERα-LBD基因片段约为1.9 kb,与预期目的片段大小一致.与T载体连接,形成pGM-T-hERα-LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a(+)质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERαLBD蛋白.经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L.电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性.结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a(+)-hERα-LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性.
关键词： 雌激素受体a亚型配体结合区 表达载体 活性 -
大鼠β-catenin miRNA表达载体的构建及在脂肪干细胞中沉默效果的检测
目的 构建具有沉默大鼠脂肪干细胞β-catenin表达的miRNA(miR)表达载体.方法 通过酶切法将合成的miR表达载体寡聚核苷酸引物与质粒pSWH相连,形成pSW H-miR; PCR扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)开放阅读框,插入经双酶切处理的pSWH-miR形成pSWH-EGFP-miR.β-catenin miR表达质粒瞬时转染SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells derived from rats,rADSCs),72 h后提取细胞全蛋白,Western blot检测β-catenin的表达情况.结果 针对大鼠β-catenin的不同位点,一共构建了5个miRNA表达载体(miR-780、miR-796、miR-1467、miR-1948、miR-1960),其中miR-780、miR-796对β-catenin沉默效果好(P＜0.05),miR-1960的沉默效果次之(P＜0.05),miR-1467、miR-1948不具有沉默效果(P＜0.05).结论 miR-780、miR-796能够有效沉默SD大鼠脂肪干细胞中β-catenin的表达.
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自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用
目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.
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RNAi表达载体对宫颈癌HPV16 E6基因表达的抑制作用
目的研究RNA干扰(RNA interference, RNAi)表达载体对宫颈癌HPV16E6基因的抑制作用.方法构建针对HPV16E6基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染宫颈癌caski细胞株,应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对HPV16 E6mRNA及蛋白表达的影响.结果构建的三种表达载体均抑制了HPV16 E6的Mrna及蛋白的表达,其中转染B号载体的caskiB细胞HPV16E6mRNA表达仅相当于空白组的21.7%,蛋白抑制率达98.1%.结论 RNAi表达载体可以有效的抑制HPV16 E6基因的表达.
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流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达
目的;获得JEV E蛋白基因,构建重组表达载体并在E.coli中高效表达.方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEV E蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-32a/JEV E,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%.结论:在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白,为ELISA早期诊断试剂盒的研制和E蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础.
关键词： 流行性乙型脑炎病毒 E蛋白基因 反转录-聚合酶链反应 基因克隆 表达载体 -
小鼠甲状腺转录因子-2转基因动物表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达
目的 构建小鼠甲状腺转录因子-2(TTF-2)转基因动物表达载体(pBROAD3-TTF-2),观察其在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达.方法 从C57BL/6J小鼠肝脏组织中提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应方法扩增出TTF-2基因1113bp开放阅读框,通过DNA重组技术将TTF-2基因片段插入克隆载体pMD 18-T中,经测序正确后,再重组于pBROAD3-mcs中,构建转基因动物表达载体pBROAD3-TTF-2,用酶切电泳分析对其进行鉴定.运用脂质体转染试剂将其转染BMSC后,蛋白质印迹法检测TTF-2基因的表达.结果 ①DNA测序证实目的基因序列正确无突变,酶切电泳分析得到相应的目的片段,大小与理论计算值一致,成功构建转基因动物表达载体pBROAD3-TTF-2.②蛋白质印迹法显示转染的BMSC高表达TTF-2蛋白.结论 成功构建了pBROAD3-TTF-2转基因动物表达载体,显示其转染BMSC后TTF-2基因的表达,为下一步建立TTF-2转基因小鼠模型奠定了基础.
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结核分支杆菌耐利福平相关基因rpoB真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建结核分支杆菌耐利福平相关基因rpoB真核表达栽体.方法 PCR技术扩增获得rpoB基因,连接入pBluescript Ⅱ SK克隆载体上,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,酶切与DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法 将rpoB基因定向连接到真核表达载体pQE-Trisystem中,构成pQE-Tri-rpoB,将pQE-Tri-rpoB转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,脂质体转染P815细胞后,以RT-PCR方法 检测mRNA表达.结果 构建了重组质粒pQE-Tri-rpoB,RT-PCR结果 证明rpoB可在P815细胞中转录.结论 成功构建了结核分支杆菌耐利福平相关基因rpoB真核表达栽体,rpoB基因可以在P815细胞中表达.
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TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立
目的构建含有鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组逆转录病毒表达载体pN2ATH,建立PA317产病毒细胞系.方法将质粒pGEM-2上酶切下的THcDNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体N2A连接,克隆出重组逆转录病毒表达载体pN2ATH.把pN2ATH质粒转入PA317包装细胞,通过G418抗性筛选,NIH3T3细胞测定病毒滴度,得到高滴度产毒PA317/pN2ATH细胞株,免疫组化测定细胞TH表达.结果重组质粒pN2ATH经酶切鉴定证明THcDNA正向插入N2A表达载体中,PA317/pN2ATH产毒细胞高效表达TH.结论成功地构建了重组逆转录病毒表达载体pN2ATH,建立了PA317/pN 2A产毒细胞株.
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应用同源重组技术快速构建乙型流感M蛋白通用疫苗的表达载体
目的 应用同源重组技术快速构建pUC57和乙型流感M基因的表达载体.方法 分析2006～2016年世界卫生组织在北半球推荐使用乙型流感病毒疫苗株的变化趋势和云南省内的优势流行病毒株,筛选4株典型毒株做实验毒株.提取病毒RNA基因组,进行RT-PCR后,胶回收后与线性化的载体pUC57后,在37℃同源重组30min,即完成一步法重组.通过转化大肠杆菌筛选阳性克隆,并对阳性质粒进行PCR、酶切和测序鉴定.将表达产物进行初步纯化后免疫小鼠,经过三次加强免疫后,通过中和实验评价表达产物的免疫效果.结果 平板菌落数计数法获得的同源重组阳性率83.3％,PCR阳性质粒能获得大小正确的目的片段,使用EcoR Ⅰ单酶切后,其大小正确,测序后发现质粒碱基没有发生突变或缺失,序列正确,同源重组技术共计耗时34h.中和实验结果显示,相同谱系内的抗原保护效价在1024,并在不同谱系间的交叉保护在256～512.结论 同源重组技术能在流感通用疫苗的上游开发环节中快速、高效的构建重组质粒,表达产物能够诱导小鼠产生良好的免疫保护效果.
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大鼠PAX6基因真核表达载体构建及鉴定
目的：构建携带绿色荧光蛋白（ GFP）报告基因及PAX6基因的重组真核表达载体，观察其在人胚肾细胞（293FT）细胞中的表达。方法：采用聚合酶链式反应（ PCR）从大鼠脑组织中获取PAX6基因，经连接T载体测序验证正确后，与真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP经SalI/BamHI双酶切后；经T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP，用菌液PCR、SalI/BamHI双酶切及测序鉴定正确后，用脂质体法转染293FT细胞，采用倒置荧光显微镜观察GFP的表达、蛋白印迹（ Westerh blot）法检测PAX6蛋白表达。结果：重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP经RT-PCR和双酶切均得到大小为1269 bp的目的条带，测序鉴定该序列与GehBahk中大鼠PAX6基因序列的同源性达100%，插入基因的大小和方向正确；重组质粒转染293FT细胞后可见GFP绿色荧光，Westerh blot显示PAX6蛋白表达。结论：成功构建了PAX6真核表达重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcG-FP，能在293FT细胞中表达PAX6蛋白。
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马铃薯块茎特异性启动子克隆及其驱动的hIL12表达载体构建
目的 克隆马铃薯块茎特异性的高效启动子Ppatatin并构建其驱动的人白细胞介素-12(hIL12)植物表达载体.方法 提取马铃薯基因组DNA作为模板,根据Genebank数据库信息设计Ppatatin序列特异性引物,通过PCR扩增获得Ppatatin片段,并进行测序鉴定;利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析;通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Ppatatin驱动的hIL12表达载体.结果 成功从马铃薯基因组中扩增得到了1019 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Ppatatin驱动的hIL12植物表达载体.结论 获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础.
关键词： Ppatatin启动子 人白细胞介素-12 表达载体 植物生物反应器 -
全人源抗IL-33scFv-IgG1Fc融合蛋白在CHO k1细胞中稳定高表达
目的 利用两种不同真核表达载体构建全人源抗白细胞介素33单链抗体c片段(IL-33 scFv-Fc)重组载体,转染中国仓鼠卵巢(CHO) k1细胞,筛选稳定高表达单细胞株以提高融合蛋白产量.方法 双酶切前期构建的重组质粒pcDNA3.1/SP-scFv-Fc,回收SP-scFv-Fc片段,插入载体PMH3EN中,构建PMH3EN/SP-scFv-Fc重组载体并与重组质粒pcDNA3.1/SP-scFv-Fc分别转染CHO k1细胞;反转录PCR、Western blot法检测目的基因scFv-Fc的转录及表达;Dot blot法筛选稳定高表达细胞株;ELISA检测scFv-Fc的水平及生物学活性.结果 重组质粒测序结果表明成功构建了真核表达载体PMH3 EN/SP-scFv-Fc,插入目的基因SP-scFv-Fc大小为1560 bp左右.反转录PCR检测重组质粒表达情况显示两组重组质粒的目的基因在CHO k1细胞中均成功转录.scFv-Fc不仅可分泌到细胞培养基中,还可与人IL-33以及抗人IgG1 Fc特异性结合.重组载体PMH3EN/SP-scFv-Fc组融合蛋白表达水平相对较高.经过4轮筛选,选出了稳定高表达细胞株,初步测其scFv-Fc表达产量为10 mg/L;竞争ELISA检测结果显示scFv-Fc可显著抑制IL-33与其受体ST2的结合.结论 在CHO k1细胞成功高表达IL-33 scFv-Fc.
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巨噬细胞特异的人工miRNA表达载体的构建与鉴定
根据小RNA(microRNA,miRNA)前体分子结构特点而设计并合成的人工miRNA(artificial miRNA,amiRNA)也可以在体内通过与内源miRNA相同或相似的途径发挥RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用,目前amiRNA技术在调控基因表达、抗病毒领域得到了广泛应用[1-4].amiRNA由表达载体生成,弥补了人工合成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)容易出现合成错误、体内降解快等缺点,而且能采用具有组织和时序表达特异性的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,polⅡ)启动子,具有毒性较低、靶基因沉默效果较好等优点[5].
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人IFN-β基因启动子荧光表达载体的构建及鉴定
目的 构建人IFN-β基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pGE3-IFNB1),并在A549细胞中进行表达验证.方法 采用PCR方法扩增出IFN-β启动子区片段,克隆入荧光表达载体pGL3 basic和pGE3 basic,并用脂质体瞬时转染A549细胞,6h后用汉滩病毒(HTNV)感染转染后的细胞,24h后检测重组载体在细胞内的表达情况.结果 重组载体pGL3-IFNB1和pGE3-IFNB1分别经双酶切鉴定及序列测定证实载体构建正确;且在A549细胞内成功表达.经HTNV刺激后表达明显增加.结论 成功构建了人IFN-β启动子荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白表达载体(pGE3-IFNB1),为进一步研究病毒诱导产生IFN-β机制提供了有用的工具.
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Syndecan-1高表达载体及不脱落突变体的构建及表达鉴定
目的:建立小鼠syndecan-1的pcDNA3.0高表达和不脱落的真核表达载体并进行表达鉴定.方法:(1)PCR扩增syndecan-1编码序列,构建载体pcDNA3.0-widetype-syndecan-1( WT-sdc1),经定点突变技术构建载体pcDNA3.0-unshedding-syndecan-1( uS-sdc1)；(2)设立阴性对照组、转染组(分别为pcDNA3.0转染组、WT-sdc1转染组及uS-sdc1转染组,转染48 h),予1μmol/L的佛波酯(PMA)刺激15 min后经RT-PCR、Western blot及Dot blot鉴定刺激前后syndecan-1表达的情况.结果:(1)真核表达载体WT-sdc1测序完全正确；载体uS-sdc1目的突变点已成功突变,除了一处无义突变外,其余序列与GenBank中的序列完全一致；(2)转染48 h后,WT-sdc1和uS-sdc1转染组细胞均强表达syndecan-1mRMA和蛋白,细胞上清中仅检测出少量脱落的syndecan-1.PMA刺激后,各组mRMA表达无显著改变；WT-sdc1转染组syndecan-1蛋白表达量较uS-sdc1转染组显著减弱,上清中脱落的syndecan-1含量显著增加.结论:成功构建了WT-sdc1载体和uS-sdc1载体,为深入研究syndecan-1及其脱落在胃肠道疾病中的具体作用及基因治疗奠定了基础.
关键词： Syndecan-1 表达载体 不脱落 突变 胃肠道疾病 -
巨噬细胞特异性真核表达载体的构建与鉴定
目的:克隆人清道夫受体A(SR-A)启动子,构建巨噬细胞特异性的真核表达载体.方法:从人外周血中提取基因组DNA,采用PCR技术分别扩增人SR-A的启动子及第一内含子和增强子序列,并插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pcDNA-GFP中,构建巨噬细胞特异性表达载体pSRA-GFP.将pSRA-GFP转染巨噬细胞和非巨噬细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞术比较GFP在不同细胞中的表达水平.结果:成功克隆SR-A启动子,其在巨噬细胞RAW264.7中的表达活性显著高于NRK、LLC、Hepa1-6等非巨噬细胞株(P＜0.05).结论:构建的表达载体pSRA-GFP具有良好的组织细胞特异性,可用于巨噬细胞特异性miRNA表达载体的构建.
