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shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默
目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpin RNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF1)基因的沉默效果.方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1.以人HIF1 cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1.新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变.结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降.结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义.
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人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达
目的构建HPV 18 L1-E6、L1-E7嵌合基因的表达载体, 并在CHO细胞中表达.方法克隆HPV 18 L1-E6和L1-E7基因, 插入中介载体pGEMT-Easy中并测序鉴定.采用PCR定点突变法, 突变L1-E6、L1-E7基因序列中与转化作用相关的位点, 分别与L1基因连接后插入真核表达载体pVAX1, 构建真核表达质粒pVAX1-L1E6Mxx、 -L1E7Mxx.用磷酸钙沉淀法, 转染CHO细胞, 以抗HPV-18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体(mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测.结果 ELISA检测显示, 转染各种pVAX1-L1E6Mxx、 -L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P-N值均>2.1; 免疫细胞化学检测, 在胞浆、 胞核可见棕黄色颗粒.结论所构建的pVAX1-L1E6Mxx-E7Mxx融合蛋白表达质粒, 可在转染细胞内表达相应的L1-E6Mxx和L1-E7Mxx蛋白, 为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础.
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人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建
目的克隆人LIGHT基因,构建其重组腺病毒载体,以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响.方法用RT-PCR法从人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆人的LIGHT全长基因.将LIGHTcDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中,经酶切线性化后,将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1,以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒.后,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒,用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达. 结果用RT-PCR法从人的PBMC中,扩增出723bp的cDNA,测序证实为人LIGHT基因.荧光显微镜、PCR及Westernblot证实,LIGHT重组腺病毒可感染293细胞,并在293细胞内进行有效的复制.结论成功地克隆了人LIGHT基因,并构建了其重组腺病毒载体,为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件.
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高效原核融合表达载体(pBVIL1)的构建及在HCV抗原表达中的应用
在对作为试剂抗原的研究中,为尽量减少抗原中无关片段可能引起的非特异性反应,常需采用以特异性抗原表位为主的小分子肽.但有时为了增加抗原的覆盖面以提高检测的灵敏度,又需用含有多个抗原表位的融合抗原[1,2].用人工合成肽成本较高,且肽与肽间的化学连接难以达到定向和得到稳定的产物.若能进行小分子肽基因的重组表达,并进而将其相互连接融合表达为理想.为实现上述目的,我们构建了表达载体pBVIL1.此载体是我们在以前克隆的表达质粒[3]pBV220/HL-1β的基础上而构建的.即在相当原质粒中的IL-1β基因中,插入两个酶切位点,使插入的基因片段与IL-1β基因融合获得高效表达.同时,通过对引入的酶切位点选择和设计通用引物,也可实现基因间的连接和融合表达.
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肝细胞生长因子基因表达载体的构建与鉴定
肝细胞生长因子〔 1〕 (hepatocyte growth factor, HGF)是近期发现的一种生长因子，由相对分子质量 (Mr)为 75 000的α链和 Mr为 30 000的β链借二硫键连接而成的异二聚体，广泛分布于肝、肾、脾、肺、脑、胸腺、胰腺、甲状腺和唾液腺等处。研究证明，用从人血浆提取并纯化的 hHGF，刺激原代培养的大鼠肝细胞合成 DNA的半大剂量为 1～ 2 μ g/L(或 10～ 20 pmol/L)。而已知表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子 (TGF)和酸性成纤维细胞生长因子 (aFGF)，刺激原代培养的大鼠肝细胞合成 DNA的半大剂量为 0.1～ 5 nmol/L，较 HGF大几十甚至上百倍，表明 HGF在各种生长因子中是强的促肝细胞分裂剂〔 2〕。而且 HGF是一种多效性因子，具有多种生物学活性，如：促细胞分裂剂 (mitogen)、促细胞运动剂 (motogen)和促形态形成剂 (morphogen)等作用，还能抑制几种肿瘤细胞 (如黑色素瘤、鳞状细胞癌和肝细胞癌等 )生长。 HGF受体是原癌基因 c-met的产物，为跨膜蛋白 (Mr为 190 000)。由于 HGF在体内分布的广泛性及其生物学活性的多样性，故其已成为热门研究课题。
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hTERT基因核心启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞凋亡的影响
目的: 构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerase reserse transcription, hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apop tosis inducing ligand, TRAIL)基因真核表达载体并观察其对卵巢癌细胞凋亡的诱导作用.方法: 从人胎盘中提取总RNA, 利用RT-PCR技术扩增了TRAIL基因片段.测序正确后, 利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT 基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中.获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL.用脂质体转染法, 将其转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞中, 应用RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达情况, 以流式细胞术检测TRAIL对卵巢癌细胞的细胞周期的影响及诱导凋亡的作用.结果: 经酶切鉴定及测序结果证实, 所构建的重组载体正确.转染hTERT promoter-pIRES2-EGFP-TRAIL载体后, SKOV3细胞的增殖受到抑制, 出现明显凋亡.结论: hTERT基因核心启动子在卵巢癌细胞中可特异性地调控其下游TRAIL基因的表达, 并发挥其促凋亡作用.构建由hTERT基因核心启动子调控的表达载体, 可能是一种新型和有希望的肿瘤治疗的途径.
关键词： hTERT基因核心启动子 TRAIL基因 表达载体 卵巢癌细胞 凋亡 -
人端粒酶逆转录酶基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异性表达载体的构建
目的:构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerase reserse transcription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体.方法:提取人SKOV3细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因核心启动子.并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中.用脂质体转染法,将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞,检测肿瘤细胞和正常细胞中GFP差异表达.结果:HTERT基因核心启动子调控的表达载体,在所检测的3种肿瘤细胞中均具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性.结论:hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子的载体可能是一种新型和有希望肿瘤治疗的途径.
关键词： 端粒酶逆转录酶和新基因启动子 基因治疗 表达载体 -
人前蛋白转化酶枯草溶菌素9的cDNA克隆和表达及多克隆抗体的制备
目的 构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体并诱导其表达,制备其蛋白的多克隆抗体.方法 聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列；扩增产物经TA克隆、双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体；将重组质粒转化人大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,诱导表达；用纯化检测过的目的蛋白免疫新西兰兔,后采集全血收集血清,获得多克隆抗体,并对该抗体进行免疫印迹及效价测定.结果 PET-28b-pcsk9原核表达载体构建成功,用诱导表达的目的蛋白免疫动物,收集血清获得多克隆抗体.对多克隆抗体进行纯化,免疫印迹检测结果证明自制多克隆抗体特异性良好,效价测定为1∶13 200.结论 成功构建了pcsk9原核表达载体pET-28b-pcsk9,且获得了其蛋白的多克隆抗体.
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人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达
目的: 构建表达人-鼠嵌合抗体的通用真核表达载体, 用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因, 以便将人-鼠嵌合抗体应用于临床治疗.方法: 用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因, 构建人-鼠嵌合抗体的表达载体, 并转染真核细胞293T进行表达.用RT-PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定.结果: 利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因, 构建了用于表达人-鼠嵌合抗体的通用真核表达载体.用本研究设计的引物, 扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段, 酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点, 转染293T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人-鼠嵌合抗体.用RT-PCR、FACS和ELISA证实, 本系统可表达嵌合抗体.结论: 构建了人-鼠嵌合抗体的真核表达载体, 并证实了其可在293T细胞中表达.
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ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定
目的:构建活化转录因子2( ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响.方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆人质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2.脂质体介导质粒转染HepG2细胞.Western blot法检测ATF-2蛋白表达；MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率.结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误；Western blot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低；ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生.结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.
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GAP- 43干扰RNA表达载体的构建与鉴定
目的: 构建GAP-43小干扰RNA(SiRNA)的表达载体并在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12中验证其抑制效果.方法: 利用设计软件根据GAP-43 mRNA序列设计特异性SiRNA插入序列, 体外合成该序列后将其定向克隆入真核表达载体pRNAT H1.1/Neo.以LipofectamineTM 2000试剂转染GAP-43-SiRNA表达载体至PC12细胞中, 以NGF诱导PC12细胞GAP- 43的表达, 以免疫组化方法鉴定GAP-43-SiRNA对GAP-43表达的抑制效果.结果: DNA测序证实合成的并被克隆入真核表达载体pRNAT H1.1/Neo的SiRNA插入序列完全正确,GAP-43-SiRNA表达载体转染PC12细胞后可特异性抑制NGF诱导的PC12细胞的GAP- 43的表达.结论: GAP-43-SiRNA表达载体构建成功, 为后期研究GAP-43在少突胶质细胞前体上表达的意义奠定了基础.
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人白细胞介素18 cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达
血管生长素angiogenin, ANG)是一种能有效促进新生血管形成的刺激因子[1],在新生血管的形成过程中发挥着重要的作用.而新生血管的形成又是体内实体瘤生长和转移必不可少的重要环节.已有大量研究表明,ANG与肿瘤的快速生长和转移具有密切的关系[2].因此,通过检测体内ANG 的水平变化,有望对相关肿瘤的发生和发展提供有效的实验依据.
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人源性丙肝病毒抗体轻链基因的克隆及重组表达载体的构建
目的 构建人源性丙肝病毒抗体轻链基因表达载体.方法通 过RT-PCR从丙肝病毒抗体强阳性的志愿者的外周血淋巴细胞中提取RNA,PCR扩增出人IgG轻链基因,将其克隆入噬菌粒pComb3中,构建人源性丙肝病毒抗体轻链表达载体,并利用相应的方法对噬菌体抗体库进行初步鉴定.结果 成功地构建了人源性丙肝病毒抗体轻链表达载体,酶切鉴定结果重组率达到88.8%.结论 人源性丙肝病毒抗体轻链基因表达载体是高效的,为下一步构建丙肝病毒抗体Fab段基因重组载体奠定了基础.
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miRNA载体构建方法的研究进展
microRNA(以下简称miRNA)是一类长约22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA分子,通过与靶mRNA的3' UTR端(非翻译区)互补匹配,在转录水平对基因表达进行负向调控,导致mRNA翻译抑制或降解.在基因调控的研究中,大量使用miRNA,其主要的工具是miRNA的表达载体.miRNA真核表达载体广泛运用于各种生物体内基因的功能研究,该文就近年来miRNA载体构建方法给予综述,为各种基因功能的进一步研究奠定基石.
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miR-93真核表达载体的构建及其表达验证
目的 构建人miR-93真核表达载体,并验证其表达效果,为进一步研究miR-93的生物学功能提供有利工具.方法 用PCR方法从293T细胞基因组DNA中扩增miR-93前体序列,引物引入酶切位点和保护碱基,产物用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BglⅡ双酶切后插入pEZX-MR04表达载体中,构建miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93.构建好的载体用双酶切、PCR和测序鉴定,同时转染293T细胞,用Real time PCR检测重组pEZX-MR04-miR-93质粒的miR-93表达效率.结果 成功构建miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93,重组pEZX-MR04-miR-93质粒转染293T细胞后miR-93表达上升约21倍.结论 构建的miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93可显著上调细胞中miR-93水平,为进一步研究miR-93在泌尿系肿瘤中的生物学功能提供可靠工具,奠定了坚实的实验基础.
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PRL-3表达载体构建及其对结直肠癌细胞生长的影响
目的:构建PRL-3过表达载体,研究其对结直肠癌细胞系SW620生长的影响.方法:提取Hela细胞总RNA并反转为cDNA,以cDNA为模板通过PCR反应扩增PRL-3基因,将扩增产物克隆至表达载体pcDNA3.1,通过转染让SW620细胞过表达PRL-3,空载体组和空白组作为阴性对照.qPCR、Western blot实验用来检测PRL-3在SW620细胞的表达水平,CCK-8实验、平板克隆形成实验用来检测SW620细胞的增殖状况,流式细胞术用来检测SW620细胞的周期分布.结果:成功构建了PRL-3过表达载体.与空载体组和空白组相比,PRL-3过表达载体转染结直肠癌细胞系SW620后,qPCR检测PRL-3表达水平上调数倍.CCK-8实验表明过表达PRL-3能够促进SW620细胞增殖.平板克隆形成实验表明上调PRL-3能够增强SW620细胞增殖能力.流式细胞术结果表明过表达PRL-3能够加快SW620细胞周期进程.结论:PRL-3能够促进结直肠癌细胞系SW620生长,为结直肠癌早期诊断和靶向治疗提供实验依据.
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PRKACB基因真核表达载体的构建及稳转细胞株的筛选
目的:克隆人cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位β基因(PRKACB),构建重组真核表达载体pEGFP-C1-PRKACB,并筛选其稳定转染肺癌细胞株.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从真核细胞中扩增得到人PRKACB的全长序列,克隆至表达增强型绿色荧光蛋白载体中,经酶切、PCR鉴定后测序证实克隆成功.将重组载体转至真核细胞,采用RT-PCR、Western blot技术检测外源基因PRKACB的表达.应用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的非小细胞肺癌细胞株.结果:测序结果证实成功将PRKACB基因克隆至真核表达载体中,酶切片段与预期大小一致(1 200bp).RT-PCR及Western blot结果显示:转染后的细胞中PRKACB在转录和翻译水平的表达均有明显提高.稳定转染pEGFP-C1-PRKACB的细胞株经Western blot证实其PRKACB蛋白上调显著.结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-PRKACB,并筛选其稳定转染后上调显著的细胞株,为进一步研究PRKACB的生物学功能奠定了基础.
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靶向mrp1基因shRNA表达载体构建
目的:构建靶向mrp1基因的shRNA表达载体.方法:根据mrp1基因序列设计并合成编码shRNA的DNA模板,将其定向克隆到psilencer2.1U6-neo质粒上,构建重组载体.经菌落PCR和DNA测序分析检测重组载体构建结果.结果:成功构建靶向mrp1基因shRNA表达载体.结论:为进一步研究mrp1基因在肺癌多药耐药中的作用以及探索肺癌的基因治疗奠定了基础.
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MYCT1-TV真核表达载体的构建及鉴定
目的：构建 MYCT1-TV（ Myc target 1 transcript variant 1）真核表达载体，鉴定其在肝癌细胞系Bel7402中的表达。方法：以正常人外周血cDNA为模板，RT-PCR方法扩增该基因的开放阅读框，定向克隆至pEGFP-C1载体后送测序鉴定。将构建好的MYCT1-TV-GFP表达载体瞬时转染Bel7402细胞，RT-PCR结合荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况并鉴定载体构建是否成功。结果：测序结果证实成功将MYCT1-TV的开放阅读框克隆至pEGFP-C1表达载体，且转染细胞后，MYCT1-TV mRNA的表达水平显著上调，荧光显微镜下可见细胞内重组绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建MYCT1-TV-GFP表达载体，为进一步研究MYCT1-TV在肝癌中的作用机制奠定了基础。
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bcl-2重组腺病毒载体的构建
本研究目的在于构建bcl-2的正义和反义重组腺病毒载体,以研究bel-2过度表达对周围神经损伤后脊髓前角运动神经元抗凋亡能力和对轴突再生的影响.为此,将正义和反义bcl-2 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV,利用体内同源重组原理,用该重组质粒与pJM17质粒共转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒AdCMV/sense-bcl-2和AdCMV/antisense-bcl-2,其中bcl-2 cDNA插入腺病毒基因组的E1区,并由CMV启动子控制.利用原位杂交、免疫组化反应鉴定重组腺病毒.结果显示:从感染AdCMV/sense-bcl-2重组腺病毒的293细胞中检测到bcl-2的表达;重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效复制.从而表明本研究成功地构建了bcl-2重组腺病毒,为进一步研究bcl-2重组腺病毒的功能提供了条件.
