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缝隙连接:一个潜在的肿瘤治疗新靶点
连接蛋白(connexin,Cxs)及其形成的缝隙连接细胞间通讯(gap junction cell-cell communication,GJIC)在肿瘤的生长、增殖、转移中起着重要的作用.研究[1]证实,在培养的正常细胞和肿瘤细胞,缝隙连接(gap junction,GJ)能够增强多种化学毒物引起细胞凋亡的作用.大量研究[2]表明,靶向Cxs和GJIC的治疗可作为一个崭新的技术直接抑制肿瘤生长或使其他的治疗方法更敏感.本文就GJ和Cxs杀灭肿瘤细胞的各种方法,包括旁观者效应(bystander effect,BE)基因治疗,转录与转录后水平,恢复Cxs表达的常用方法,以及该治疗方法的可行性和局限性作一综述.
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胸苷激酶基因对乳腺癌细胞的杀伤性研究
目的探讨逆转录病毒(RV)载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因转染小鼠乳腺癌细胞,联合抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)对小鼠乳腺癌细胞系MA782/5S-8102体外杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317、G418筛选抗性克隆,采用PCR方法检测HSV-TK基因整合情况.取滴度高的病毒上清液感染小鼠乳腺癌细胞MA782/5S-8102,经G418筛选后,得到带有HSV-TK基因的MA782/5S-8102/TK细胞;将MA782/5S-8102和MA782/5S-8102/TK细胞按不同比例混合培养后,给予10 tg/ml GCV,4天后采用MTT法计算细胞成活率(SR),观察旁观者效应.结果 GINaTK载体成功转入包装细胞PA317,病毒滴度为4.0×104 cfu/ml.用病毒上清液感染MA782/5S-8102,成功得到了表达HSV-TK基因的MA782/5S-8102/TK细胞.混合培养结果显示,当MA782/5S-8102/TK细胞数占混合细胞数10%时,低浓度(10 μg/ml)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入小鼠乳腺癌细胞MA782/5S-8102并获稳定表达,RV-HSV-TK/GCV系统杀伤癌细胞存在旁观者效应.
关键词： 单纯疱疹病毒胸苷激酶 旁观者效应 逆转录病毒载体 小鼠乳腺癌 -
单纯疱疹病毒胸苷激酶基因联合更昔洛韦治疗肿瘤的机制
单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)与抗病毒药物更昔洛韦(GCV)组成的药物敏感基因疗法在肿瘤基因治疗领域中引人注目,它产生的旁观者效应在一定程度上弥补了基因载体转染率不高的问题,在肿瘤自杀基因疗法中发挥着重要的作用,现对HSV-TK/GCV治疗肿瘤机制及其应用趋势作一综述.
关键词： 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 更昔洛韦 旁观者效应 -
新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙系统的研究应用
亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙(lis/lin)系统作为一种新型自杀基因系统,为肿瘤的基因治疗提供了又一手段.研究表明,它通过水解前体药物产生氰根离子(CN-)对靶细胞产生杀伤效应.相比较其他自杀基因系统,lis/lin自杀基因系统具有高效、无不良反应等特点,同时其旁观者效应机制也不同于其他自杀基因系统,表现出更为强大杀伤周围靶细胞的作用.因此,作为一种新型的自杀基因系统,将有希望用于肿瘤临床治疗.
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放射诱导旁观者效应的研究进展
20年来的研究表明,暴露于离子照射的细胞群会出现明显的生物效应,这种效应在放射细胞群和未放射细胞群都会发生.这一现象人们称之为旁观者效应.在体内和体外实验中已表明确实存在这一效应.现对旁观者效应的测量、发生机制以及它对低剂量离子照射的放射防护和放射治疗的影响作一综述.
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肿瘤细胞的间隙连接
间隙连接是细胞信号传导的重要途径,在细胞的协调生长步伐等方面的作用不容忽视.肿瘤细胞的形成和癌症的治疗都与其有关,特别是癌症基因治疗中的旁观者效应(bystander effect)与间隙连接胞间通讯(GJIC)密切相关.现综述近年来有关间隙连接在肿瘤细胞的形成和治疗等方面的研究进展.
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腺相关病毒载体及其介导的自杀基因疗法
自杀基因疗法是肿瘤治疗的方法之一.腺相关病毒(AAV)载体介导的自杀基因疗法尤其备受关注.通过对AAV栽体的选择改建,调控外源基因的有效表达,提高基因转染的效率,充分发挥自杀基因的杀伤作用及旁观者效应来达到治疗肿瘤的目的.本文就AAV栽体及其介导的自杀基因疗法方面的进展作一综述.
关键词： 腺相关病毒(AAV)载体 自杀基因 旁观者效应 -
辣根过氧化物酶/吲哚三醋酸酶前药对鼻咽癌细胞的杀伤作用
目的 研究adv5.oriP.HRP对鼻咽癌细胞靶向性转染和HRP/IAA对鼻咽癌细胞的杀伤作用.方法 将adv5.oriP.HRP感染C666-1,KSI和CNE-2Z细胞,加入IAA,用MTT法评估细胞杀伤效果.建立乏氧有氧条件,检测HRP/IAA在乏氧状态下鼻咽癌细胞的杀伤能力及旁观者效应.结果 adv5.oriP.HRP能靶向性在EBV阳性的鼻咽癌细胞内高效转染和表达.HRP/IAA对鼻咽癌细胞有强大的杀伤作用,在一定范围内杀伤能力随孵育时间和病毒载体及前药的浓度增高而增加.在乏氧状态下,HRP/IAA有同样的杀伤能力.当感染细胞占总细胞的10%左右时,65%的肿瘤细胞死亡,当比例达到20%时,90%以上的细胞死亡,显示HRP/IAA有很强的旁观者效应.结论 adv5.oriP.HRP能在EBV病毒阳性的细胞内靶向性表达;HRP/IAA在乏氧和有氧状态下均有强大的杀伤能力和旁观者效应.adv5.oriP.HRP/IAA是理想的病毒介导的酶前药基因组合.
关键词： 辣根过氧化物酶/吲哚三醋酸酶 酶前药 乏氧/有氧状态 旁观者效应 -
腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用
目的 探讨腺病毒介导HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎(PvNS)滑膜细胞的体外杀伤作用.方法 将含LacZ基因的重组腺病毒载体Ad-LacZ转染PVNS滑膜细胞,X-gal染色法确定腺病毒对该细胞的转染效率,PCR检测转染细胞中HSV-TK基因的表达,MTT法检测TK阳性细胞时GCV的体外敏感性及旁观者效应,流式细胞仪检测HSV-TK/GCV系统作用后细胞的凋亡及坏死.结果 感染复数为120时,近100%的细胞可被转染.HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用十分明显,且存在明显的旁观者效应.HSV-TK/GCV系统作用后细胞出现明显的凋亡及坏死.结论 HSV-TK/GCV系统可明显杀伤PVNS中过度增殖滑膜细胞,可望用于PVNS的治疗.
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HSV-TK/GCV系统杀伤高、低转移卵巢癌细胞株旁观者效应的观察
目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统杀伤高、低转移卵巢癌细胞时的旁观者效应及其与间隙连接蛋白(Cx)43表达的关系.方法 比较经HSV-TK/GCV作用的高、低转移性卵巢癌细胞株Ho-8910pm和Ho-8910旁观者效应;检测两种细胞Cx43的表达.结果 HSV-TK/GCV系统对Ho-8910细胞产生明显的旁观者效应,而对Ho-8910pm细胞旁观者效应较弱;Ho-8910细胞的Cx43表达为7.12(平均荧光强度),而Ho-8910pm细胞的Cx43表达为1.34,两者相比,P＜0.05.结论 HSV-TK/GCV系统杀伤低转移卵巢癌细胞时旁观者效应强,与Cx43的表达水平有关.
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腺相关病毒介导HSV-tk/GCV系统对晶状体上皮细胞的旁观者效应及机制
目的 研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷( HSV-tk/GCV)系统对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N 1003A)的旁观者效应,并初步探讨其机制.方法 rAAV2载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent,EGFP)转染体外培养N/N1003A细胞,倒置荧光显微镜观察细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测病毒的转染效率.重组病毒rAAV2/HSV-tk转染体外培养的N/N1003A细胞(N/N1003A-tk),以不同比例与没有转染的细胞混合,MTT法观察旁观者效应；MTT法检测N/N 1003 A-tk/GCV处理的条件培养液(CM)对N/N1003A细胞的作用.应用相差显微镜、透射电镜观察条件培养液对N/N1003A细胞形态学和超微结构的影响.结果 rAAV2载体能介导EGFP基因稳定转染N/N1003A细胞,转染效率高达81.12％.当N/N1003A-tk细胞以不同比例(l0％、20％、40％、80％、100％)与N/N1003A混合时,细胞抑制率分别为49.00％±0.49％、54.71％±1.41％、59.26％±1.13％、68.20％士0.76％、73.44％±1.26％,与对照组(1.68％±0.45％)比较,差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01).N/N1003A-tk/GCV处理的条件培养液可明显杀伤N/N1003A细胞,但将其用0.22 μm滤膜过滤后,对细胞的杀伤作用消失.条件培养液处理的N/N1003A细胞出现凋亡征象.结论 rAAV2介导的HSV-tk/GCV系统对兔晶状体上皮细胞有较强的旁观者效应,通过非细胞接触方式诱导旁观者细胞凋亡可能是其机制之一.
关键词： 旁观者效应 单纯疱疹病毒胸苷激酶 晶状体上皮细胞 腺相关病毒 -
HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应研究
目的研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase-gancyclovir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制.方法应用阳离子脂质体将pCMV/hytk-IRES-hrGFP质粒导入人视网膜母细胞瘤株HXO-Rb44细胞,荧光显微镜下观察转染效果,并用潮霉素筛选出转染阳性细胞HXO-Rb44/tk.RT-PCR鉴定hvtk 基因在HXO-Rb44/tk细胞中的整合转录结果.比较转染前后Rb细胞的形态和生长特性.通过MTT法检测GCV对HXORb44/tk细胞的杀伤作用以及对不同比例HXO-Rb44/tk和HXO-Rb444混合细胞的杀伤作用("旁观者效应").并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制.结果转染效率约为20%.HXO-Rb44/tk细胞mRNA经RT-PCR可检测出530bp 的hytk基因片段.转染前后Rb细胞的形态和生长特性无明显改变.HXO-Rb44/tk细胞对GCV7高度敏感,并表现出时间和剂量的依赖性.HSV-tk/GCV系统对Rb细胞的杀伤过程中存在明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rb44/tk细胞上清对HXO-Rb44细胞生长无影响.结论HSV-tk基因转移联合GCV治疗可作为视网膜母细胞瘤基因治疗的一种有效方法,GCV代谢产物通过细胞间缝隙连接进行转运可能是此系统旁观者效应的主要机制.
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HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究
目的观察HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的旁观者效应并研究其作用机制.方法将转HSV-tk基因HTFs(HTFs-tk)与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合,加入5μg/ml更昔洛韦作用5 d,MTT法检测对HTFs的杀伤作用;染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)的能力;免疫细胞化学检测Cx43分布;RT-PCR及Western blot检测Cx43表达.结果旁观者效应随HTFs-tk/HTFs比例增加而增强,高细胞接种密度组明显强于低密度组;染料通过GJIC传输6级以上;Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达.结论旁观者效应需要细胞间密切接触,Cx43介导GJIC可能是HSV-TK/GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制,HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用.
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HSV-TK/GCV系统对前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应
目的:研究胸苷激酶(TK)自杀基因疗法对人前列腺癌细胞的杀伤作用和旁观者效应,探讨其治疗前列腺癌的可行性.方法:采用形态学观察、活细胞拒染法及MTT法检测单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/羟基无环鸟苷(GCV)系统对前列腺癌细胞的杀伤作用及旁观者效应.结果:GCV对转染TK基因前列腺癌细胞的杀伤作用呈剂量及时间依赖关系(P＜0.05～0.01);但其旁观者效应较弱,TK基因阳性细胞比例约为10%的混合细胞,经10 μmol/L和100 μmol/L的GCV处理72 h后,仅有16.15%±1.64%和23.46%±3.21%的细胞被杀灭.结论:HSV-TK/GCV系统对前列腺癌有杀伤作用,但由于其旁观者效应不够强大,不能期望通过单纯的TK基因治疗达到前列腺癌良好的治疗效果.
关键词： 前列腺肿瘤 基因治疗 单纯疱疹病毒胸苷激酶/羟基无环鸟苷 旁观者效应 -
缝隙连接蛋白43对双自杀基因系统旁观者效应的影响
目的观察双自杀基因胞嘧啶脱氨酶基因(CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)对胆管癌细胞的抑制作用以及转染缝隙连接蛋白43(Cx43)基因对旁观者效应的影响.方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定双自杀基因系统作用下和/或Cx43基因转染后胆管癌QBC939细胞的细胞抑制率及旁观者效应.RT-PCR检测双自杀基因和Cx43基因的表达.Western blot检测Cx43蛋白的表达.结果 CD和tk基因在QBC939/CD+tk细胞和QBC939/CD+tk+Cx43细胞中获得稳定表达.mRNA和蛋白水平均显示转染Cx43基因的QBC939/CD+tk+Cx43细胞的Cx43的表达量明显增加.双自杀基因系统对QBC939/CD+tk+Cx43细胞组的抑制作用较QBC939/CD+tk细胞组高.结论双自杀基因系统对胆管癌细胞有明显的抑制作用,Cx43基因的导入可明显增强旁观者效应,提高对肿瘤细胞的抑制作用.
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三参数流式细胞术分析紫外线诱导的MOLT-4细胞旁观者效应
目的 应用三参数流式细胞术探讨紫外线(UV)诱导的MOLT-4细胞的旁观者效应(BSE).方法 以人类T细胞白血病细胞株MOLT-4为对象,以紫外线为诱导剂.将经UV照射的MOLT-4细胞与DiD荧光阳性的MOLT-4细胞联合培养作为试验组,未经任何打击的DiD阳性细胞为对照组.用FITC-Annexiu V/PI法检测细胞凋亡率,用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察其荧光及形态学改变,以检测其旁观者效应.结果 实验组中旁观者细胞凋亡及坏死比例在0、2、4、8、12、18、24 h分别为6.84%、8.09%、9.88%、13.50%、22.50%、30.99%、37.93%.而对照组为4.28%、4.93%、5.22%、5.39%、6.54%、6.77%、7.14%.试验组旁观者细胞的凋亡及坏死比例随着时间的延长而逐步增高.LSCM观察可见部分旁观者细胞出现磷脂酰丝氨酸(PS)翻转、核边集、核浓集、核碎裂等形态学改变.结论 在MOLT-4细胞株,用非离子射线--UV诱导的凋亡细胞对联合培养的旁观者细胞具有旁观者效应.
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单纯疱疹病毒胸苷激酶基因体外杀伤T淋巴细胞及克隆的效应实验
目的 探讨tk基因系统在体外培养条件下对T细胞克隆的转导情况以及转导后的tk杀伤效应.方法 将tk基因在体外培养条件下导入结肠抗原特异性T细胞克隆,观察基因转染、克隆凋亡情况,比较tk+和tk-T细胞克隆之白细胞介素(IL)-2分泌水平、细胞存活率、"旁观者效应"间差异.结果 荧光显微镜下观察可见转染成功,tk基因导入淋巴细胞发生凋亡;当复合感染度(MOI)为0、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0时,细胞存活率分别为(94.43±5.02)%、(85.33±4.12)%、(81.07±2.46)%、(73.51±3.89)%、(68.68±5.26)%、(54.16±3.72)%、(45.51±2.29)%、(22.16±1.77)%.随着MOI和丙氧鸟苷(GCV)浓度增加,细胞存活率呈现明显下降趋势;tk+T细胞克隆实验组IL-2分泌水平明显下降,与对照组差异有统计学意义(P＜0.01);各种tk+T细胞比例条件下的存活率变化曲线与ADV/Empty组接近,未能产生类似肿瘤细胞的旁观者效应.结论 tk基因对T细胞克隆具备杀伤效应,但tk+T细胞克隆杀伤实验中未能见到与肿瘤细胞类似的"旁观者效应".
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单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷自杀基因系统对胆囊癌细胞的体外作用
目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统对体外胆囊癌细胞的杀伤效果.方法将含有tk自杀基因的重组逆转录病毒载体PLtkSN经脂质体介导转染胆囊癌细胞,并测定不同浓度的GCV对转基因细胞GBC-SD/tk的生长抑制率;将GBC-SD/tk与未转基因细胞GBC-SD按不同的比例混合,噻唑蓝(MTT)法测定GCV对不同混合比例细胞的杀伤率,观察旁观者效应.结果GCV对体外GBC-SD/tk细胞有明显的杀伤作用,与对照组比较差异有非常显著性(P＜0.01),并呈现剂量依赖性的特点.当GCV浓度为1、10、50、100、500mg/L时,杀伤率依次为6.8%、25.2%、54.5%、66.3%、89.3%;在混合细胞中,当GBC-SD/tk细胞所占比例分别是0、10%、20%、50%、70%、100%时,GCV对混合细胞的杀伤率依次为0、19.7%、40.3%、77.7%、88.0%、93.5%,提示存在旁观者效应.结论HSV-tk/GCV自杀基因系统有望成为治疗胆囊癌的有效手段之一.
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全反式维甲酸诱导脑胶质瘤化疗的旁观者效应
自杀基因抗肿瘤研究中已公认存在旁观者效应.但有关肿瘤化疗是否存在旁观者效应,目前国内外鲜见报道.本研究旨在探讨VM-26在治疗胶质瘤细胞过程中是否存在旁观者效应,及其与肿瘤细胞缝隙连接细胞间通讯功能(GJIC)的关系.
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胸苷嘧啶激酶/丙氧鸟苷治疗脑胶质瘤时fas mRNA的检测
利用胸苷嘧啶激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)治疗胶质瘤是目前研究的热点之一,其中有一个较为重要的旁观者效应,但机制未明.有报道认为可能是TK阳性的胶质瘤细胞在死亡过程中有凋亡信号传给TK阴性的肿瘤细胞[1].
