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三羟异黄酮对氧化损伤内皮细胞保护作用的实验研究
目的 研究植物雌激素的有效成分三羟异黄酮对胆固醇致人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用,探讨植物雌激素的抗氧化功能.方法 体外培养HUVEC,将细胞分为5组:正常对照组、胆固醇损伤组(胆固醇50mg/L+终浓度为10μmol/L的CuSO4溶液)、胆固醇损伤的同时加入三羟异黄酮不同剂量,GST低剂量组(22.5μmol/L)、中剂量组(45μmol/L)和高剂量组(90μmol/L).培养结束后,测定上清培养液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量以及一氧化氮(NO)生成量.结果 胆固醇损伤组的GSH-Px活力和NO生成量明显下降,MDA含量升高,与正常对照组和GST不同剂量组比较差异有显著性(P<0.05),而正常对照组和GST不同剂量组比较差异无显著性(P>0.05).结论 胆固醇可以诱导内皮细胞损伤,三羟异黄酮可能有阻止胆固醇对HUVEC的损伤作用.
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芎芍胶囊对人脐静脉内皮细胞NO、iNOS和eNOS表达的影响
背景与目的:观察芎芍胶囊含药血清对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)表达的影响,探讨芎芍胶囊促血管新生的作用机制.材料与方法:不同芎芍胶囊药物浓度的含药血清(分为4.17、8.33和16.66 mg/ml共3组)培养HUVEC细胞24 h后,比色法检测培养液中NO、iNOS的含量,RT-PCR检测HUVEC细胞中iNOS、eNOS的表达.结果:4.17 mg/ml含药血清组培养上清液中NO含量较对照组增加(P<0.01);4.17和8.33 mg/ml含药血清组iNOS含量较对照组增加(P<0.01).RT-PCR结果显示,4.17 mg/ml含药血清组HUVEC细胞的eNOS mRNA和iNOS mRNA的表达均增加(P均<0.01),8.33和16.66 mg/ml组HUVEC细胞的eNOS mRNA和iNOS mRNA表达均减少(P均<0.01).结论:4.17 mg/ml芎芍胶囊含药血清组促进血管新生可能与增加iNOS、eNOS mRNA表达,促进NO合成与分泌有关.
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金雀异黄酮对同型半胱氨酸诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用
背景与目的:探讨同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)诱导的人脐静脉内皮细胞株ECV-304的氧化应激损伤及金雀异黄酮(genistein,GEN)对这种损伤的保护作用.材料与方法:以5.0 mmol/L的HCY作用于ECV-304细胞;同时设不同浓度的GEN(10、50、100 μmol/L)保护组,各保护组预先加入GEN孵育12 h后,再加入5.0 mmol/L的HCY.通过四噻氮唑盐(MTT)比色法观察细胞活性,使用流式细胞术检测胞浆活性氧(ROS)水平. 结果:HCY可降低ECV-304细胞的细胞活力,HCY处理后的细胞ROS水平与对照组相比明显升高(P<0.01);经不同浓度的GEN预处理后,细胞活性较单独HCY处理组显著增高(P<0.05),而50和100 μmol/L GEN处理组ROS水平较单独HCY处理组显著降低(P<0.05),且呈现剂量依赖性.结论:HCY可使ECV-304细胞氧化应激损伤,活力下降,而GEN具有抗氧化作用,能降低内皮细胞氧化损伤的程度.
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胆固醇诱导内皮细胞凋亡及抑制细胞增殖的实验研究
背景与目的:探讨胆固醇(cholesterin)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)凋亡及细胞增殖的影响,同时观察CuSO4溶液在其中所起的作用.材料与方法:实验分为8组:对照组(等体积溶剂)、胆固醇低剂量组(25 mg/L)、中剂量组(50 mg/L)和高剂量组(100 mg/L);另外4组分别为以上各组加入终浓度为10 μmol/L的CuSO4溶液.应用流式细胞仪检测不同浓度胆固醇对细胞凋亡率的影响;应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT试验)检测细胞的生存率.结果:不同浓度的胆固醇可不同程度地诱导HUVEC细胞发生凋亡,可明显抑制HUVEC细胞增殖,且随浓度增高,其作用均明显增强.同时发现各组加入CuSO4溶液后可使其细胞凋亡率明显增加,生存率下降.结论:胆固醇可以诱导内皮细胞凋亡及抑制细胞增殖,CuSO4溶液可促进胆固醇对HUVEC的损伤作用.
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彗星电泳法和K-SDS法检测甲醛和H2O2对人脐静脉内皮细胞DNA的损伤
背景与目的: 研究甲醛、H2O2以及两者共同作用对人脐静脉内皮细胞DNA的损伤.材料与方法: ①应用彗星电泳法于荧光显微镜下观察人脐静脉内皮细胞经甲醛、H2O2、甲醛和H2O2不同浓度(0、5、10、25、50、100 μmol/L)作用20 min或25 μmol/L浓度作用不同时间(0、10、20、30 min)后的DNA损伤情况;②用K-SDS法检测甲醛、甲醛和H2O2不同浓度(0、10、50、100、500、1 000、 2 000 μmol/L)或50 μmol/L、100 μmol/L浓度不同时间(0、0.5、1、1.5、2、4 h)引起的DNA-蛋白质的交联效应. 结果: ①彗星电泳结果:内皮细胞与不同浓度甲醛孵育20 min,5、10、25 μmol/L甲醛所致DNA损伤以断裂为主且与阴性对照有统计学意义(P<0.05);与等摩尔H2O2共同孵育时,5、10、25 μmol/L浓度组均可使单独H2O2作用时的彗星尾距增加,50、100 μmol/L使单独H2O2作用时的彗星尾距减小;25 μmol/L甲醛作用不同时间,尾距随时间增加而增大(P<0.05).②交联结果:内皮细胞与不同浓度甲醛孵育1.5 h后,引起DNA-蛋白质交联(DPC)形成明显增高(P<0.05);与等摩尔H2O2共同孵育时除1 h组(P<0.05),其余各组与阴性对照无统计学差异;50 μmol/l的甲醛作用不同时间,2 h组与阴性对照有统计意义(P<0.05);100 μmol/L的甲醛、甲醛与H2O2作用不同时间,各实验组与阴性对照无统计学意义. 结论: ①在体外条件下,低浓度甲醛(<25 μmol/L)对DNA的损伤以断裂为主,高浓度(>500 μmol/L)以交联为主,均呈剂量及时间依赖性;②H2O2引起内皮细胞DNA断裂损伤,呈剂量及时间依赖性.
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胆固醇致人脐静脉内皮细胞DNA损伤
目的:探讨胆固醇是否通过氧化应激导人致脐静脉内皮细胞DNA损伤.方法:培养人脐静脉内皮细胞株(中南大学湘雅医院赠送).分别用不同浓度的胆固醇(12.5mg/L,25mg/L,50mg/L)作用于脐静脉内皮细胞12h,免疫荧光法观察细胞中γH2AX形成的焦点;流式细胞术检测细胞内γH2AX的量;彗星电泳实验检测不同浓度胆固醇作用细胞后,细胞内DNA损伤情况.结果:免疫荧光结果显示三种不同浓度的胆固醇作用hUVECs 12h后均可诱导细胞内γH2AX形成焦点,随着胆固醇浓度的增加,γH2AX焦点的荧光强度也逐渐增强;彗星电泳实验结果表明随着胆固醇浓度增加,细胞内拖尾DNA量逐渐增加DNA损伤加剧,细胞内ROS的水平下降.结论:胆固醇可以通过升高人脐静脉内皮细胞中ROS水平终导致DNA损伤.
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切应力对培养的人脐静脉内皮细胞内钙的影响
目的探讨切应力对血管内皮细胞内钙的影响.方法设计离体血流循环切应力测试装置,选择15@dyne/ cm2 、50@dyne/ cm2 、300@dyne/cm2三种切应力,分别模拟大中动脉处、大中动脉分叉处及病理状态下的切应力,以体外培养的人脐静脉内皮细胞作为实验对象,测定切应力分别作用0,0.5,1,2,4,6,10@h的内皮细胞内总钙的含量.结果细胞内钙于切应力作用0.5h时达高峰值,然后迅速恢复.15@dyne/cm2 组峰值低,50@dyne/cm2组峰值高,300@dyne/cm2组峰值居中,差异有显著性意义(P＜0.05).切应力分别作用0.5,1,2,4,6,10@h的内皮细胞内钙含量与静态对照(0@h)间差异有显著性意义(P＜0.05).结论切应力可影响内皮细胞内钙的含量,进而改变内皮细胞功能,参与动脉粥样硬化的发生过程.
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C肽对人脐静脉内皮细胞体外表达eNOS的影响
目的探讨C肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影响.方法将培养成功的HUVEC在不同浓度的C肽(0.1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)下孵育48h,提取细胞总RNA,应用半定量逆转录聚合酶链反应(SQ-RT-PCR)法,检测eNOS表达的情况.结果低浓度的C肽(1ng/ml)使eNOS的表达减弱(P＜0.01);生理浓度的C肽(10ng/ml)和高浓度的C肽(100ng/ml)均可使eNOS的表达明显增强(P＜0.01).结论 HUVEC可以对C肽的刺激产生反应,说明它是C肽作用的靶细胞,这为体外研究C肽在糖尿病大血管病变中的作用创造了条件.
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人内皮细胞特异性因子-1与动脉粥样硬化
ESM-1即内皮细胞特异性分子-1，其在人类的肾内皮细胞中表达量少，更多的表达在人类的肺内皮细胞。一开始由人类从HUVEC（人脐静脉内皮细胞）cDNA文库中克隆处理[1]。ESM-1是一种硫酸皮肤素蛋白聚糖（DSPG），可溶于血液并在机体的多种调节功能中发挥作用。据之前的研究表明，ESM-1与冠心病动脉粥样硬化（AS）形成过程存在相关性。因此，加强对ESM-1的研究有助于进一步了解的AS形成。ESM-1的cDNA序列全长2006个碱基对，包含一个长度为552个核苷酸的开放阅读框，和1398个核苷酸的3’端非编码区，它的结构是由单一基因编码，由一条含有165个氨基酸的核心蛋白以及一条硫酸皮肤素（DS）单链位于137位的丝氨酸残基共价结合而成，能以可溶的形式释放入血液循环[2]。
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镍钛合金裸支架对内皮细胞低密度脂蛋白穿胞影响的初步研究
目的：探讨镍钛合金裸支架是否影响低密度脂蛋白（LDL）在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的穿胞并初步探讨可能的机制。方法①培养HUVEC，利用细胞培养小池模拟血管内皮单层细胞，建立穿胞模型；②将镍钛合金裸支架作用于HUVEC上，加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的LDL，分别培养3 h及24 h；③通过测定培养小池内外FITC-LDL的量，研究镍钛合金裸支架对LDL在HUVEC中穿胞过程的影响。结果3 h及24 h时镍钛合金裸支架作用下LDL在HUVEC中的穿胞量均增加。结论在LDL和HUVEC构建的穿胞模型实验中,镍钛合金裸支架可以促进LDL的穿胞。
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二苯乙烯苷上调HO-1表达负向调控H2O2诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的研究
目的 探讨二苯乙烯苷(TSG)上调HO-1表达负向调控H2O2诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用.方法 对人脐静脉内皮细胞进行体外培养,将实验分成对照组(空白组,无过氧化氢)、过氧化氢组(过氧化氢浓度300μmol/L)和二苯乙烯苷组(二苯乙烯苷浓度10μmol/L+过氧化氢浓度300μmol/),采用显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Westernblot检测HO-1蛋白的表达及Nrf2核转位.结果 与对照组比较,过氧化氢组内皮细胞增殖率明显降低(P<0.05);与过氧化氢组比较,二苯乙烯苷组内皮细胞增殖率明显增加(P<0.05).与对照组比较,过氧化氢组内皮细胞凋亡率上升(P<0.05);二苯乙烯苷组细胞凋亡率明显低于过氧化氢组(P<0.05).与对照组比较,过氧化氢组内皮细胞12 h后HO-1蛋白的表达减少;与过氧化氢组比较,二苯乙烯苷组可明显升高HO-1蛋白的表达(P<0.05).二苯乙烯苷组处理内皮细胞后,胞浆中的核转录因子Nrf2(NF-E2-related factor 2)水平降低,胞核中Nrf2水平逐渐增加;转染了Nrf2小干扰RNA片段(siRNA,Small interfering RNA)的内皮细胞中HO-1蛋白表达明显减少.结论 二苯乙烯苷(TSG)可能通过核转录因子Nrf2诱导人脐静脉内皮细胞表达HO-1,从而发挥对内皮细胞凋亡的抑制作用.
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内毒素诱导的血管内皮细胞凋亡
目的从内毒素(LPS)所致血管内皮细胞(VEC)凋亡的角度进行了实验研究,为进一步探讨血瘀证实质及药物保护VEC作用机理,建立可靠的细胞凋亡模型.方法以不同剂量内毒素作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)24h,通过荧光显微镜与流式细胞仪观察细胞凋亡程度,并测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量.结果不同浓度LPS作用HUVEC 24h后,与对照组相比,HUVEC有较典型的细胞凋亡,且LDH显著升高.结论1μg/mLLPS可用于建立HUVEC凋亡模型,对研究方药治疗血瘀证的作用机理奠定了基础.
