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沪通高频电刀故障检修一例
高频电刀是作为医院现代外科手术中常用的设备之一,它的工作原理是将将市电转化成高频的高压,由于高频电流不会引起神经的刺激,可以在人体组织上进行切割和凝血.
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奇异变形杆菌中质粒携带的碳青霉烯酶基因型别的研究
目的 研究本地区近4年临床分离的非重复碳青霉烯类耐药的奇异变形杆菌可能存在的碳青霉烯类酶基因型别.方法 回顾分析2009到2012年临床分离奇异变形杆菌的资料筛选出非重复的碳青霉烯类抗生素耐药的菌株15株；用浓度梯度法(E-试条法)检测其对亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、厄他培南(ETP)、环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AK)和米诺环素(MIN)的MIC值；Hodge试验进行产碳青霉烯酶的确认,同时对试验菌株进行耐药基因的PCR扩增检测及测序,对阳性扩增菌株的质粒提取物与叠氮钠耐受的敏感态大肠埃希菌J53(E.coli J53)进行电转化,并对电转化后的菌株进行目标基因的PCR扩增及碳青霉烯类抗生素MIC值的检测.结果 2009到2012年,筛选到15株耐碳青霉烯类抗生素耐药的菌株；IPM、MEM、ETP的耐药率均为100％,CIP的耐药率为86.7％(13/15),AK的耐药率为33.3％ (5/15),MIN的耐药率为80％(12/15)；15株细菌中Hodge试验阳性7株,blaKPC基因阳性11株,经测序检测确认为blaKPC-2型；11株blaKPC基因阳性菌株的质粒提取物经电转化大肠埃希菌J53,使转化子大肠埃希菌J53对亚胺培南、美洛培南和厄他培南的MIC值增高2～64倍,PCR扩增转化子大肠埃希菌J53 blaKPC基因均阳性.结论 本地区对碳青霉烯类抗生素耐药的奇异变形杆菌,对阿米卡星的耐药率相对较低.其碳青霉烯酶的基因型主要为位于质粒上的blaKPC-2基因型,易于在菌株间流行,临床应引起高度重视.
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人GDNF-TAT真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达
目的:在毕赤酵母中表达带有TAT多肽的人胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF),为探讨GDNF-TAT用于帕金森病的治疗奠定基础.方法:用密码子优化法合成人GDNF基因序列连在pPICZαA,用PCR方法分别在上游引入TAT位点与XbaⅠ酶切位点,下游设计扩增pPICZαA上的α-因子序列.然后插入pPICZαA载体中,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切并测序鉴定,构建GDNF-TAT在毕赤酵母表达质粒pPICZαA-GDNF-TAT.电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白.结果:双酶切pPICZαA-GDNF-TAT后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1 kb和432 bp片段,表明目的片段已插入载体中,经序列测定其含有完整的GDNF-TAT基因片段,Western 印迹结果显示含有pPICZαA-GDNF-TAT的毕赤酵母GS115能分泌表达GDNF-TAT.结论:成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-GDNF-TAT,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达GDNF-TAT.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 GDNF-TAT基因 电转化 毕赤酵母 血脑屏障 聚合酶链反应 -
乳杆菌电转化的研究进展
乳杆菌在食品、工业、微生物学等领域发挥着重要作用,作为益生菌,既可向体外生物反应器方向开发,又可作为潜在疫苗的抗原递送载体.由于乳杆菌属革兰阳性菌,细胞壁厚,重组质粒电转化效率低,甚至不能实现转化,影响了它作为基因工程受体菌的应用.笔者研究了近年来有关乳杆菌的电转化方案,总结了影响电转化效率的因素,如细胞壁预处理、电转缓冲液、电击参数、培养基、孵育时间以及菌体密度、质粒用量、热击条件等,并根据自己的试验结果提出优化方案,为乳杆菌在疫苗及生物反应器等领域的遗传开发研究提供较全面的借鉴.
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球面对称设计在大肠杆菌JM109电穿孔转化优化试验中的应用
目的:探讨优化大肠杆菌JM109菌株的电穿孔转化条件.方法:应用球面对称设计组合电穿孔转化条件,拟合出各条件与转化率之间的关系,对转化条件进行优化.结果:用电穿孔转化大肠杆菌JM109菌株,可以得到高于化学方法的转化率.转化时间一定,外加电场强度,细菌生长状态、细菌密度是影响转化率的关键因素,而DNA的投入量对转化率无显著影响.结论:利用球面对称设计,可以获得细胞外源DNA分子电穿孔法导入的优化条件.
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电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用
目的:探讨电转化技术在构建噬菌体抗体库中的应用价值.方法:用国产电转化仪将重组噬菌粒p3-V2转化入E.COLI XL1-Blue中.结果:应用电转化技术构建噬菌体抗体库库容为:3.9×107单个scFv重组子,其转化效率为:107～108转化子/μg,本实验佳条件为场强(7.5 kv/cm),电容(21.0μF),细菌浓度(XL1-Blue:4.0×1010/ml),外源DNA量(p3-V2:0.6μg).结论:经优化电转化条件,所得库容符合建库要求.
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细胞因子midkine基因的克隆及其转化甲醇酵母Pichia pastoris
目的克隆细胞因子midkine (MK)基因,并转化甲醇酵母Pichia pastoris.方法利用RT-PCR方法从人胃癌MGC803细胞总RNA中扩增MK cDNA,构建分泌表达载体pPic9k-MK,然后转入宿主菌GS115中,提取GS115的基因组DNA,用PCR法扩增鉴定阳性克隆.结果成功构建了分泌表达载体pPic9k-MK,并转入GS115中,筛选到抗4.0 mg/ml G418的重组菌株,鉴定出5个阳性克隆.结论 MK基因可以转入甲醇酵母Pichia pastoris中,为今后在Pichia pastoris中表达有活性的MK蛋白,并进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了实验基础.
关键词： Midkine Pichia pastoris pPic9k 电转化 -
基因重组卡介苗高效电转化条件的实验研究
目的 探讨卡介苗(BCG)电转化中影响转化效率的因素.方法 利用电转化仪将穿梭质粒pYL-hB7-2 转入BCG中,考察其影响因素并优化转化条件.转化子利用卡那霉素抗性筛选和聚合酶链反应(PCR)及酶链免疫吸附试验(ELISA)鉴定.结果 重组BCG获得较高的转化效率,高可达8/9.外加电场强度和质粒浓度是决定电转化效率的关键因素,感受态细胞的状态,如生长期和冰浴时间均可影响转化效率.结论 成功解决了基因重组BCG构建过程中电转化的问题.
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双歧杆菌感受态细胞的制备和电转化条件的研究
介绍目前常用的双歧杆菌感受态细胞制备方法,并系统研究影响双歧杆菌电转化效率的关键因素.通过研究,菌体在A600为0.3～0.5时收集以制备感受态细胞,制备好的感受态细胞应尽早用于电转化;佳电场强度为12.5 kV/cm;转化后的细胞复苏培养2h为佳.感受态细胞的转化效率可达103 CFU/μg DNA.
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密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21在毕赤酵母中的表达
目的 在毕赤酵母中表达密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21),为探讨hFGF-21在糖尿病治疗方面的作用奠定基础.方法 经密码子优化合成hFGF-21基因,构建表达载体pPICZαA-hFGF-21,电转化毕赤酵母GS115,斑点免疫印迹法筛选工程菌株,甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并对诱导条件进行优化.结果 重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确.筛选出5株阳性菌株,诱导上清经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为25 000的目的 蛋白条带,目的 蛋白的表达量约为6 μg/L.Western blot显示该蛋白具有良好的反应原性.诱导96 h和培养液pH值为4.0时,目的 蛋白的表达量高,甲醇浓度对表达量无影响.结论 已成功构建了密码子优化的hFGF-21真核表达载体,并在毕赤酵母GS115中分泌表达了hFGF-21.
关键词： 人成纤维细胞生长因子-21 毕赤酵母 电转化 表达 -
鳗弧菌Vibro anguillarum MVM425sh高效电转化条件的优化
目的 建立高效的鳗弧菌电转化系统.方法 分别从感受态细胞制备的洗涤缓冲液与浓度、复苏培养基、二级细胞收获时间、电转化的电压与脉冲时间等方面,对鳗弧菌的电转化条件进行优化.结果 获得的鳗弧菌佳转化条件为二级培养3 h左右收获细胞,用272 mmol/L蔗糖洗涤缓冲液制备电转化细胞,在2.0 kV 3 ms的脉冲条件下,pUC18的转化率达106个转化子/μg DNA.结论 采用优化的电转化方法,可获得较高的转化率,为鳗弧菌中的常规遗传操作奠定了良好的基础.
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弓形虫转基因学研究进展
转基因技术在弓形虫的运用加速了对弓形虫功能基因组学的研究.本文对转基因弓形虫载体的构建、转基因方法和转基因弓形虫技术在弓形虫研究中的应用进展加以综述.
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达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统的建立与优化
玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL11379是一种具有环脂肽结构抗生素-达托霉素(Dapto-mycin)的产生菌.建立高效稳定的遗传操作系统是研究该链霉菌各功能基因作用以及构建基因工程菌的基础.实验探索了通过电穿孔、接合转移向玫瑰孢链霉菌中转入外源DNA的可能性.以链霉菌(Streptomyces)噬菌体ΦC31所构建的整合型载体pSET152-dptP为出发质粒,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体作为受体菌,在不同的电场强度下进行电穿孔实验,结果表明:以玫瑰孢链霉菌NRRL1 1379新鲜菌丝体为受体菌,未获得转化子.以ET12567(PUZ8002,pSET152-dptP)为供体,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体为受体,选取MS培养基为接合转移培养基,利用属间接合转移将质粒pSET152-dptP转入菌株NRRL11379中.结果表明:当供体大肠杆菌ET12567细胞量和玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌丝体量比例为1∶1,MS培养基中MgCl2的浓度为0.01 mol/L,培养20 h后覆盖阿泊拉霉素50 μg/mL以及萘啶酮酸50 μg/mL时,接合转移频率高,可达1.75×10-4.通过PCR验证,质粒pSET152-dptP已整合至玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株的染色体上.确定了玫瑰孢链霉菌属间接合转移的佳条件.
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戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达
为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2 1.3kb基因.对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-SI/HEV和pPIC9/HEV重组体,酶切线性化后转化入GSll5酵母菌,经表型鉴定,PCR扩增筛选阳性克隆,对不同表型,不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达,ELISA及SDS-PAGE筛选表达活性菌株,Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应.得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件.
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铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组电转化宿主菌的条件初探
目的:研究将铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组DNA电转入其宿主菌并获得噬斑的基本条件.方法:以铜绿假单胞菌PA3作受体菌,将噬菌体PaP3基因组DNA通过电转化导入受体菌中,研究细胞生长状态、感受态细胞的制备方式、电场强度、DNA浓度和细胞密度等条件对转化效率的影响.结果:在含50 μg/ml红霉素的LB培养液中培养宿主菌14～16 h,以100 mmol/L蔗糖溶液为介质,在25℃条件下制备感受态并使其浓度达到10 11/ml,电转参数为12 kV/cm,300 Ω,25 μF,在此组条件下能获得较高的转化效率,高可达2.1×103 pfu/μg的DNA.结论:确定了一组电转条件,成功地将铜绿假单胞菌噬菌体完整基因组导入PA3中,并形成噬斑,为铜绿假单胞菌噬菌体的深入研究奠定了基础.
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影响电转化效率的几个因素探讨
目的:探讨大规模DNA测序技术平台中影响电转化效率的几个因素.方法:电转化法测定经稀释或乙醇沉淀处理后连接反应混合物的转化效率.结果:电转化电压在2.1～2.5 kV之间可获得高转化效率;乙醇沉淀法虽能降低盐浓度,但同时使微量质粒DNA丢失,不能提高电转化效率;稀释法能提高转化效率5倍左右;连接反应物转化时,感受态细胞悬浮于无菌去离子水中的转化效率比悬浮于10%甘油无菌去离子水中的高.结论:降低连接反应混合物的盐浓度能有效提高电转化效率,在大规模DNA测序技术平台中,急需研究开发一种纯化回收微量质粒DNA的简单而有效的方法.
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携带BARF1基因的重组巨细胞病毒的构建
目的 依据细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)能够克隆大段DNA病毒的特点,通过galk为基础的同源重组,将EB病毒编码BARF1基因插入巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV),构建重组病毒.方法 PCR扩增带有巨细胞病毒UL57基因左右同源臂的galk及BARF1基因片段,经过电转化,进行同源重组,经含有galk培养基及脱galk培养基筛选,获得带有BARF1的巨细胞病毒细菌人工染色体克隆,提取质粒,转染到ARPE-19细胞,观察带有BARF1基因的巨细胞病毒对ARPE-19细胞的影响.结果 感染带有BARF1基因的巨细胞病毒的ARPE-19细胞形态由原来的长梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多,并且细胞生长失去接触抑制,出现重叠生长现象.结论 建立了携带BARF1基因的重组巨细胞病毒;同时表明利用细菌人工染色体,可方便地对病毒基因组进行准确操作.
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环境条件对猪链球菌2型电转化效率的影响
目的 探讨环境条件对猪链球菌2型强毒株05ZYH33电转化效率的影响.方法 采用电穿孔的方法对05ZYH33强毒株进行外源DNA的转化,通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索.结果 电穿孔法可以成功地转化猪链球菌2型强毒株05ZYH33,转化效率高可达107/μg质粒DNA.结论 猪链球菌2型强毒株05ZYH33高效电转化方法的建立,为深入研究该病原菌的功能基因组学奠定了基础.
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乳酸乳球菌NZ3900电转化条件的优化
目的 优化乳酸乳球菌的电转化条件,为该菌作为基因表达宿主菌的应用研究奠定基础.方法 采用电穿孔方法,用质粒pNZ8110转化乳酸乳球菌NZ3900菌株,改变电转时的电压、电阻、恢复培养时间和筛选用抗生素浓度,测定每微克质粒所得转化子数量.结果 采用0.2 cm的电转化杯时,2.5 kV、200 Ω、25 μF、氯霉素终浓度4 μg/ml,恢复培养2 h为优条件,电转化效率可达1.2×104 个/μg pNZ8110.结论 通过优化电转时的电压、电阻、恢复培养时间和筛选用抗生素浓度,可有效提高乳酸乳球菌NZ3900电转化效率.
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抗体库构建中影响库容量的因素探讨
目的:探讨在噬菌体抗体库的构建过程中,提高转化效率的优条件.方法:通过改变感受态细菌的浓度、电击时间的长短以及连接产物的纯化方法,从而找出佳条件.结果:实验证明:在仪器的电压、电阻、电容等条件设定不变的情况下,感受态细菌的OD600在0.4左右,电击时间为2s,转化效率高.结论:连接产物进行酚-氯仿抽提后转化效率也会大大提高.
