毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的 在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法.方法 采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-II过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的 蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析.终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定.结果 在培养至工程菌菌体湿重约200~250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的 蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L.发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的 (体积浓缩约2/3).再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,终目的 产物的纯度达98%以上,得率达32.5%.且纯化的目的 蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性.结论 酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的 蛋白、酵母色素及脱盐的目的 ,为规模化制备hPAB-β创造了前提.

人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨

目的利用含重组质粒pBAD/HBs Fab的Top10大肠杆菌 ,优化表达人源抗-HBs Fab.方法选取含pBAD/HBs Fab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养,将制备的二级种子液接种于摇瓶和 KLF2000发酵罐中,摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间.发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度.诱导表达完毕后,纯化蛋白,比较表达量,并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性.结果用摇瓶优化表达后,Fab蛋白占菌体总蛋白的6%,为0.8 mg/g菌体,利用发酵培养可进一步增加菌量,使蛋白表达量达80 mg/ L.所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性.结论用重组质粒pBAD/HBs Fab,Top10表达系统,可得到80 mg/L的具有较好生物学活性的人源抗-HBs Fab蛋白,为批量生产作了准备.

真菌发酵制备生物材料壳聚糖

利用犁头霉属真菌发酵生产壳聚糖.发现培养温度、时间以及pH值等因素对壳聚糖产量及性质产生明显影响.pH值影响壳聚糖的脱乙酰程度,pH值控制在4.5可获得90%以上的脱乙酰度;28～29 ℃和pH值5.0条件下,壳聚糖的收率达到780 mg/L;随培养时间延长,产品分子量迅速下降.扫描电镜分析显示,发酵法生产的壳聚糖成膜后,与酸碱处理甲壳素得到的产品在微观结构上存在显著差别.

乳杆菌LGG发酵牛奶或超高温处理牛奶中抗变形链球菌和远缘链球菌特异性抗体的稳定性和活性

提高克拉维酸发酵产量的研究

从三个方面着手研究提高克拉维酸(CA)的发酵产量:诱变选育CA高产菌株,生产培养基的选择以及pH控制.在CA分批发酵中采用pH变换策略, 当CA产量达大值时,将pH7.0变化至6.0,以减少分解,提高产量.与不控制pH时比较,CA产量可增加约36%.

采用接种体混合物培养顶头孢霉M25提高头孢C的产量

采用不同菌龄的接种混合物培养顶头孢霉M25,可提高头孢C的产量.早期与后期的接种体的比例为3:7时,得到CPC浓度的大值(2.17g/L).

22-57 作用于1,3-β-葡聚糖合成酶的新型抗真菌抗生素FR901469的分类、发酵、分离、理化特性和生物学活性

土霉素高产菌株N56育种及工业发酵条件优化

目的 以五氟尿嘧啶与紫外线复合氯化锂诱变土霉素产生菌,得到高产突变株.方法 以龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)M-2 4#为出发菌,采用不同工作浓度的五氟尿嘧啶与不同处理时间的紫外线复合氯化锂处理该菌株,经过琼脂块抑菌圈初筛、摇瓶筛选和罐上试验,得到生产性状优良的菌株.结果 经过诱变及各步筛选后,获得3株高产菌株,并根据培养特性对它们进行发酵条件的优化,选出经济高效菌株199#,经过自然分离得到高产稳定的菌株N56,在生产车间进行四批30吨罐发酵的研究,发酵水平提高8.75％,同时节约了无菌空气量11.1％.结论 五氟尿嘧啶与紫外线复合氯化锂诱变土霉素产生菌效果显著,所获得的高产菌株效价高、需氧量低,节约了大量无菌空气,降低了生产成本.

烯二炔类抗生素及其靶向药物研究新进展

烯二炔类抗生素因强的抗肿瘤活性而受到重视.近年报道与单抗偶联的烯二炔类抗生素有力达霉素(Lidamycin,LDM)、新制痛菌素(Neocarzinostatin,NCS)和卡利奇霉素(Calicheamicins,CLM).本文突出阐明了其靶向药物的研究进展,同时也介绍了其辅基蛋白、新型筛选模型、产生菌发酵方面的新动态.

钴60与紫外线复合诱变选育L-鸟氨酸高产菌株

目的 诱变选育L-鸟氨酸高产菌株.方法 以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株,经60Co γ射线和紫外线复合诱变处理,选育出L-鸟氨酸的高产菌株,研究其佳发酵条件.结果 选育出一株L-鸟氨酸的高产菌株HG106-25,遗传标记为精氨酸营养缺陷型+磺胺胍抗性(Arg-+SGr).结论 突变株HG106-25在优化发酵条件后,摇瓶发酵4-5 d,L-鸟氨酸平均产量为14.7 g·L-1,达较高水平,可进行放大试验.

溪黄草及其发酵物中黄酮对自由基的清除作用

目的 研究溪黄草及其发酵物中黄酮对自由基的清除作用.方法 用枯草芽孢杆菌对溪黄草进行发酵,从溪黄草及其发酵物中提取总黄酮,用分光光度法测定含量,采用UV-Vis法测定两类黄酮提取物对O_和OH的抑制作用.结果 溪黄草及其发酵物中的黄酮含量丰富,两者对O2·-和OH·均有良好的清除作用,而发酵物中黄酮提取物的作用相对较弱.结论 溪黄草及其发酵物中的黄酮是良好的自由基清除剂,具有开发类似黄酮药物的前景.

植物内生真菌次生代谢稳定性的探讨

内生真菌是一种新型可再生资源,已经成为寻找新型先导化合物的源泉,也是中药资源开发利用的热点.内生真菌次生代谢的生物不稳定性以致迄今没有一株内生真菌能够进行工业化生产,已成为开发内生真菌资源的瓶颈.本文探讨内生真菌次生代谢的生物不稳定性产生的原因.

搅拌桨叶型式对庆大霉素产生菌菌丝形态及其生物合成的影响

六平叶圆盘涡轮桨搅拌产生的剪切力强烈,能达到有效混合,增强氧的传递,而六箭叶圆盘涡轮桨搅拌产生的剪切力较温和,基于庆大霉素产生菌对剪切力敏感的发酵过程特性,在相同的发酵工艺条件下,将六平叶圆盘涡轮桨变换为六箭叶圆盘涡轮桨,实验结果表明剪切力对庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌的菌丝形态及其生物合成有显著的影响.在庆大霉素发酵过程中,剪切力相对温和的条件下,菌丝形态、菌体浓度及粘度均有明显的改善,增强了菌丝代谢活力,改变了发酵液的流变学特性,提高了粘度,使产素水平提高48.6%,达到1282μg/ml.

前体对纳他霉素生物合成的影响

研究如何通过加入前体来提高生物合成纳他霉素的产量,进行了前体种类选择、前体加入量及加入时间的优化实验.结果表明,丙酸钠是比乙酸钠、丁酸钠、正丙醇更佳的纳他霉素合成前体,乙醇及正丁醇对纳他霉素生物合成无明显促进作用;在发酵24h时向发酵培养基中添加0.6%的丙酸钠,纳他霉素产量达3014.43mg/L,与不添加前体相比提高了185.8%,具有较好的工业应用价值.

红霉素生产及其有效组分转化的优化

以红霉素生产菌红色链霉菌HB为研究对象,根据红霉素生物合成机理,以促进甲基化转化和强化基础代谢为主要手段,在利用摇瓶和50L罐发酵生产红霉素的过程中,在大约127h的时候,向发酵液中流加ATP、L-Met、MgSO4和柠檬酸,采用高效液相色谱仪(HPLC)对终发酵液进行检测,红霉素的有效组分A的相对百分含量由原来的73%提高到88%以上,对终发酵液进行生物测定,其生物效价亦得到明显提高,实现了红霉素发酵生产的优化.

高产纳他霉素的褐黄孢链霉菌选育

目的以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)S-71为出发菌株,筛选纳他霉素的高产菌株.方法紫外线对孢子悬浮液照射40s后,分别用链霉素抗性和琼脂块法进行筛选纳他霉素高产菌株,之后对高产菌株进行生产稳定性实验.结果通过链霉素抗性法筛选获得了约10%的正选率突变株,其中突变株SG-56摇瓶效价单位为2410μg/ml,为出发菌株的146%;通过琼脂块筛选法获得了约1%的正选率突变株,其中突变株SG-2002摇瓶效价单位为2650μg/ml,为出发菌株的161%,该菌株无链霉素抗性标记.结论链霉素抗性筛选和琼脂块筛选均可以获得纳他霉素的高产菌株,其中链霉素抗性筛选法效率高,琼脂块法筛选全面.

万古霉素的研究开发

通过不同诱变剂对万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌 SIPI- 43491的处理,结合卡那霉素、万古霉素和甘油选择平板,经过约 10000样次的筛选,得到一株生产能力比出发菌株提高 10倍以上的高产万古霉素突变株.通过对万古霉素发酵工艺和分离纯化工艺的研究,得到一条适合工业化生产万古霉素的制备工艺.由此得到的万古霉素产品,其各项质量指标均符合第 25版美国药典.目前已经开始生产上市.

12C离子束辐射选育庆大霉素高产菌株及其罐发酵水平

采用12C离子束对庆大霉素产生菌23-18#进行诱变,通过大量摇瓶筛选,选出5株进行2T罐中试,通过中试,选出2株高产变株在50T罐放大试验中发酵水平较出发菌株有重大突破,发酵水平及批总亿均提高10%以上.

利福霉素B发酵工艺研究

研究温度、溶氧、巴比妥、磷酸盐及补料方式对利福霉素B发酵的影响.结果表明在控制培养温度27℃、溶氧25%以上的条件下,采用流加补料工艺,利福霉素B的发酵效价较原工艺有明显提高,此工艺已在60m3发酵罐中进行工业化生产,发酵效价比原生产工艺提高了一倍以上.

豆油对螺旋霉素发酵的影响

以螺旋霉素链霉菌SPMl-108为出发菌株,经波长为254nm、功率30W的紫外诱变处理50s,筛选豆油耐性突变株,得到一株螺旋霉素高产菌株SPM2-89,其发酵效价较出发菌株提高了22.5%.以此为试验菌株,采用含豆油培养基进行发酵试验,结果表明,豆油的佳加入量为2.0%,加入时间以0～12h为宜.采用上述含豆油培养基并补加前体正丙醇,发酵效价比不添加前体提高21%.此工艺应用于50m3发酵罐工业生产,月平均发酵水平较原工艺提高30%～50%,产品质量稍有提高.