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康乐霉素C产生菌的诱变育种及其发酵的研究
康乐霉素C(简称K-C)是一个新的免疫抑制剂,但它在发酵液中的含量很低,仅为0.1mg/L.为了满足药效学、毒理学试验和药代动力学所需的样品,就必须提高K-C的产量.K-C的产生菌为Nocardia mediterranei var.Kanglensis 1747-64,用本所的自然突变株ST-91为出发菌株(下称出发菌株),采用紫外线诱变和自然分离纯化的方法,筛选出1株K-C的产量明显地高于出发菌株的突变株U10-S-4.对U10-S-4的生产稳定性进行了考察,其稳定性很好,可传到第四代.并对它的发酵条件,如:pH值、接种量、发酵周期等进行了研究,进而进行了500L罐上放大试验,绘制出突变菌株U10-S-4的生长代谢曲线,通过对代谢曲线分析,优化了发酵条件,进行了罐上的补料试验,确立了5吨罐上的操作条件,成功地进行了3批生产,K-C效价可以达到46.0mg/L,比出发菌株提高了460多倍.
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雷帕霉素发酵生物活性的测定方法
由吸水链霉菌(Str.hygroscopicus)WY93-Z27中分离出具有抗真菌和免疫抑制活性的雷帕霉素,主要存在于菌丝内,少量分泌到细胞外.为适应大量菌种选育工作的需要,我们研究了:(1)几种处理菌丝的方法,结果以SDS裂解菌丝操作简便,省时,成本低;(2)固体发酵与液体发酵法生物活性结果没有正相关关系;(3)一定条件下,液体发酵上清液效价可替代菌体效价用于初筛工作.
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低氮源消耗和高产雷帕霉素菌株的选育
目的 采用亚硝基胍(NTG)、常压室温等离子体(ARTP)、核糖体工程育种方法处理产雷帕霉素游动放线菌SIIA-1602,结合OSMAC策略以期筛选得到发酵水平有较大提高,氮源利用更加高效的新菌株.方法 首轮采用NTG诱变筛选;第二轮采用链霉素抗性育种,第三轮采用ARTP诱变育种;采用3种不同的发酵培养基考察突变菌株的发酵水平.结果 出发株游动放线菌SIIA-1602经过NTG诱变、链霉素抗性和ARTP诱变筛选得到的突变株ASN-256,其发酵水平提高了55.7％,通过发酵培养基删减有机复合氮源并且添加了赖氨酸和哌可酸后,发酵水平提高分别107.6％和148.9％.在10t发酵罐通过流加,使菌种ASN-256发酵单位进一步提高到1250mg/L,是出发菌株SIIA-1602发酵水平的2.85倍.菌种ASN-256发酵过程中总氮源使用量减少50％,放罐时氨基氮排放仅为菌株SIIA-1602的一半,菌渣量也显著降低.结论 本方法简单经济,突变效率高,能够快速获得传代稳定,氮源利用更加高效的雷帕霉素高产突变株.另外,该菌通过发酵培养基的调整实现了氨基氮排放和菌渣量的大幅降低,在环保方面取得了显著的效益.
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达托霉素产生菌前体物耐受选育及其流加补料发酵
目的 通过对达托霉素产生菌进行诱变选育,以及前体物补料发酵方式提高达托霉素的产量.方法 采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术对玫瑰孢链霉菌进行诱变,以癸酸铵和甘氨酸耐受作为选择压力进行菌株筛选,在摇瓶和100L发酵罐上进行癸酸铵流加补料试验确定佳的发酵工艺.结果 经诱变选育获得1株突变株FIM-D1568摇瓶效价达到380mg/L,发酵单位较出发菌株提高了35.7％;通过优化100L发酵罐流加补料癸酸铵溶液工艺,使达托霉素发酵效价达到2276mg/L.结论 以ARTP为诱变源,甘氨酸及癸酸铵耐受性为选择性压力,可以快速筛选获得达托霉素高产菌;高产突变菌株在流加补料发酵工艺上优良性状得以发挥,发酵效价大幅提高.
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原生质体ARTP诱变选育阿维拉霉素高产菌株
目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平.方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S.viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究.结果 S.viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的佳条件为:以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min.以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3％,其中,阿维拉霉素A占组分含量81％,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4％,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定.另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4％.结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力.
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海洋小单孢菌FIM02523产rakicidin B发酵工艺研究
目的 提高海洋小单孢菌FIM02523发酵液中的生物活性成分rakicidin B含量.方法 采用单因素实验、正交设计实验等方法优化发酵培养基组成比例及培养条件.结果 确定了优rakicidin B发酵培养基:可溶性淀粉4.0％,蔗糖1.0％,大豆蛋白胨1.0％,酵母粉2.0％,甘氨酸0.1％,NaCl 0.5％,MgSO4 0.05％,CaCO3 0.5％;优摇瓶发酵条件:发酵周期为120h,接种量5.0％,500mL摇瓶装量100mL,摇床转速220r/min,发酵温度30℃,培养基初始pH值为7.5.结论 优化后发酵工艺rakicidin B的发酵效价较初始工艺提高了约7.3倍.
关键词： 发酵 培养基优化 正交设计 Rakicidin B -
常压常温等离子体(ARTP)诱变选育顶头孢霉高产菌
目的 获得高产的工业微生物产生菌.方法 采用ARTP诱变的方式来获得头孢菌素C的高产突变株.通过对突变菌株采用混合培养筛选与高通量生物检测相结合的高效筛选方法.结果 终选育获得高产菌株G6.与出发菌株W-6相比,G6在摇瓶中产头孢菌素C的能力提高了19.75％.结论 ARTP诱变方法是一种高效的头孢菌素C高产菌株选育方法.其正突变几率高,可有效提高菌株的头孢菌素C产量.
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响应面法对多黏菌素E发酵工艺的优化
为了优化多黏菌素E的发酵工艺,以多黏菌素含量为考核指标,在单因素实验确定因素和水平的基础上,利用响应面法对多黏类芽孢杆菌产多黏菌素E的发酵培养基和工艺进行了初步优化.对7个因素进行Plackett-Burman(P-B)实验,得到3个显著因子.Plackett-Burman实验结果表明,蛋白胨、温度和硫酸铵是影响多黏菌素E发酵产量的显著因子.然后进行陡爬坡实验逼近佳响应面区域,后通过Central Composite Design,利用Design-Expert V8.06软件进行回归分析,得到佳条件,并进行响应面的预测值和实测值的验证.多黏菌素E的优化发酵条件结果为:葡萄糖20g/L、蛋白胨21.05g/L、硫酸铵16.25g/L、种龄21h、接种量10％(V/V)、温度33.3℃、装液量1L/1.8L.在该优化的发酵条件下,多黏类芽孢杆菌产多黏菌素E的大效价达到28577.2U/mL,较优化前的多黏菌素E效价(25103.4U/mL)提高了13.8％.优化的发酵工艺合理、稳定、可行,为进一步工业化生产优化奠定了基础.
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响应面法优化疏螺旋体素发酵培养基
目的 提高链霉菌BOR-0331发酵液中的生物活性成分疏螺旋体素(borrelidin)含量.方法 采用单因素实验、Plackett-Burman实验、陡爬坡试验、中心组合设计实验等方法优化发酵培养基组成及比例.结果 当黄豆饼粉2.4％,甘露醇3.2％,可溶性淀粉1.8％,甘油0.7％,氯化钠0.1％时,效价高.结论 经过发酵培养基优化,效价从2.2mg/L提升至35.3mg/L,提高了1504％.
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表面活性剂对活跃链霉菌产那西肽发酵的影响
目的 研究Triton X-1 00、CaCl2、DMSO、山梨醇、SDS、Tween-80、CTAB等表面活性剂对活跃链霉菌发酵产那西肽的影响.方法 采用单因素实验研究活跃链霉菌的基础代谢以及表面活性剂加入时间对那西肽效价的影响:采用响应面法对表面活性剂添加浓度进行优化.结果 基础代谢研究表明,活跃链霉菌产那西肽合成相对滞后于菌体生长.多种表面活性剂均显著影响那西肽的生物合成,整体表现为低浓度促进、高浓度抑制.表面活性剂依其类型及加入时机的不同,对那茜肽产量的影响表现出组间类型差异性及组内时间依赖性.结论 DMSO、CaCl2、Triton X-100在低浓度范围内对那西肽产量的促进效果为显著;分别在24、24和48h以DMSO 0.808mg/mL、CaCl20.799mg/mL和Triton X-100 0.574mg/mL的浓度为佳添加浓度,该条件下那西肽效价达到931.493μg/mL,比优化前提高了7.73％.
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A40926高产菌株的选育及发酵工艺优化
目的 通过菌种选育与发酵工艺优化,提高A40926发酵产量.方法 本文采用紫外线和亚硝基胍两种方法诱变,结合抗生素抗性筛选方法,对A40926的产生菌Nonomuraea sp.SIPI-H3020进行诱变选育,并通过工艺优化提高发酵产量.结果 筛选得到一株高产突变株Nonomuraea sp.SIPI-H5972,其发酵效价比出发菌株提高了257％.在优化的摇瓶发酵工艺下,突变株SIPI-H5972的发酵效价达到990μg/mL,又提高了153％.通过补料工艺优化,在50L发酵罐中发酵效价为1223 μg/mL,比摇瓶发酵提高了23.5％.结论 紫外线和亚硝基胍诱变并结合抗生素抗性筛选对提高A40926发酵单位效果明显,补料工艺可以显著提高其产量.
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玫瑰孢链霉菌补料分批发酵生产达托霉素的动力学模型
目的 研究了玫瑰孢链霉菌补料分批发酵生产达托霉素的动力学特性.方法 将发酵过程分为菌体生长阶段和达托霉素合成阶段,基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,对达托霉素发酵过程建立了菌体生长、产物生成和总糖消耗的动力学模型,并利用Statistica 6.0软件对模型参数进行非线性拟合.结果 表明模型预测值和实验数据拟合较好,模型能够较好地反映达托霉素补料分批发酵过程.结论 建立的模型能够为高效生产达托霉素提供行之有效的调控策略与手段.
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格尔德霉素高产菌株的抗性筛选及其发酵的研究
目的 用实验室保藏的格尔德霉素产生菌Streptomyces melanosporofaciens101,通过抗性选育,获得高产突变株.并研究该菌株的工业化发酵工艺.方法 经硫酸二乙酯诱变和添加代谢终产物(格尔德霉素)抗性筛选,格尔德霉素抗性浓度从5g/L提高到10g/L,筛选高产突变菌株.再进行发酵罐上工艺优化,分别进行了单批发酵和分批补料发酵研究.结果 获得的高产突变株其生产能力比出发菌株提高了1000倍.在96、120、144和168h分别补加总体积3％的葡萄糖,该分批补料发酵工艺适合格尔德霉素工业化生产.结论 格尔德霉素高产突变株的筛选和发酵工艺的确定为该项目产业化奠定了基础.
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环孢菌素A分批发酵连续补糖的研究
目的 利用50L全自动发酵罐对环孢菌素A分批发酵连续补糖进行了研究.方法 HPLC法检测环孢菌素A效价以及离心测定菌体生物量.结果 初始培养基中果糖比例由12％降至6％,发酵中后期连续流加果糖,维持发酵液中残糖浓度20g/L的水平,环孢菌素A效价236h从4.08g/L提高至6.0g/L,明显好于部分葡萄糖代替果糖及全葡萄糖代替果糖发酵的水平,同时菌体生物量增加了15％.结论 降低初始培养基中果糖比例和连续流加补糖,有效提高了环孢菌素A的发酵单位,对于指导生产具有重要的参考意义.
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肺囊康定B0发酵培养基的优化研究
目的 通过优化发酵培养基,提高肺囊康定的B0组分(PB0)产量.方法 采用响应面分析法,根据中心组合设计原理及Design Expert 7.0软件分析,基于正交试验结果,对PB0发酵培养基中影响产量的四个主要因子进行配方优化,利用Numerical Optimization功能预测大响应值并进行验证试验及发酵罐放大试验.结果 获得优发酵配方,摇瓶PB0产量较对照提高了35％,20M3发酵罐PB0产量较对照提高了38％.结论 通过响应面分析法优化出发酵培养基,可使PB0的产量大幅提高,并成功地用于工业化生产.
关键词： 肺囊康定 YT-B1074-UN-237 响应面分析法 发酵 -
50L罐头孢菌素C发酵过程豆油流加控制策略的优化
目的 优化头孢菌素C(CPC)发酵过程的豆油补料控制策略,提高发酵整体性能.方法 提出了一种匀速+DO-Stat结合型补油策略.在50L罐上对使用该策略和使用匀速补油以及传统DO-Stat自动补油策略的发酵性能进行比较,确定优补油控制策略.结果 采用匀速+DO-Stat结合型补油策略时,CPC终浓度高,CPC得率也从使用匀速补油策略时的19.61％提高到25.74％,代谢主副产物去乙酰氧头孢菌素C(DAOC)的积累量少,DAOC/CPC(W/W)只有0.46％,达到生产要求.结论 使用匀速+DO-Stat结合型补油策略,可控制CPC发酵过程中的碳源浓度和溶解氧浓度(DO)于合适水平,在维持较高的CPC生产强度的前提下,CPC得率大幅提高,代谢副产物的积累得到抑制、产品质量得到控制.
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活跃链霉菌合成那西肽的固体斜面培养条件优化
目的 探索活跃链霉菌36#摇瓶发酵合成那西肽的固体斜面培养条件的佳工艺.方法 利用单因素与正交试验对固体斜面培养条件进行优化.结果 得到合成那西肽的活跃链霉菌36#的固体斜面优培养条件为:初始pH为7.8,培养温度为37℃,培养时间为3d,冷藏时间为0～3周,那西肽产量可达936mg/L.与原工艺相比较,那西肽的产量增加了13.8％.结论 通过活跃链霉菌固体斜面培养条件的优化,可以提高活跃链霉菌摇瓶发酵合成那西肽的产量.
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响应面法优化S-腺苷蛋氨酸发酵培养基的研究
目的 采用响应面法对酿酒酵母菌发酵生产S-腺苷蛋氨酸(SAM)的培养基进行优化,提高S-腺苷蛋氨酸发酵单位.方法 采用Plackett-Burman设计和响应面法进行培养基优化,对8个因素进行了筛选,结果表明:酵母粉,葡萄糖,丝氨酸的浓度对S-腺苷蛋氨酸产量的影响大.通过陡爬坡试验及Box-Behnken设计对3个显著因素进行寻优,并利用Design-Expert软件对实验数据进行二次回归分析.结果 结果显示酵母粉、葡萄糖和丝氨酸的佳浓度分别为39.5、73.4和6g/L.经过3次试验所测得的数据8402.6、8600.0和8357.9mg/L.与预测结果基本一致.结论 模型预测值与实际值吻合度比较高,模型具有显著性,比优化前提高了53％.
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旁路代谢酶抑制剂对林可霉素发酵的影响
目的 研究林可链霉菌的发酵工艺,提高林可霉素的产量.方法 在林可链霉菌发酵产林可霉素的过程中,在一定时间添加一定量的旁路代谢酶抑制剂丙氨酸和三甲胺,用生物效价法测定发酵液中林可霉素的产量.结果 在发酵开始时添加0.01％的丙氨酸,同时在24h时添加0.02％的三甲胺,使林可霉素的产量提高26％.实验发现该种添加方法抑制了糖酵解途径中的丙酮酸激酶和莽草酸途径中的邻氨基苯甲酸合成酶的酶活,使菌体内积累高浓度的林可霉素的前体酪氨酸及L-多巴,进而提高了林可霉素的产量.结论 该种发酵工艺使林可霉素产量得到显著提高.
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响应曲面法优化柔红霉素发酵培养基
目的 优化培养基,提高柔红霉素发酵效价.方法 采用Plackett-Burman法、陡爬坡试验和Box-Behnken设计,用摇瓶发酵进行实验,利用SAS软件进行二次回归分析.结果 Plackett-Burman设计证明麸质粉(A)、FeSO4·7H2O(B)和NaCl(C)对产量影响较大,通过陡爬坡试验和响应曲面法得到柔红霉素发酵培养基预测模型为:Y=-16.09+13.55A+231.49B+5.20C-3.59A2+130.00AB-30774B2-0.37AC+102.50BC-1.84C2,从中获得柔红霉素发酵的优配方为:麸质粉2.0％,FeSO4·7H2O 0.01％,NaC1 1.51％.1500L发酵罐中试放大结果表明:柔红霉素效价提高24％.结论 使用响应曲面法可以较大幅度地提高柔红霉素发酵效价.
