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微环境对牙周膜干细胞分化的抑制和诱导作用
牙周膜干细胞(PDLSC)在牙周组织缺损修复和维持牙周动态平衡中起关键性的作用,是牙周组织再生修复治疗的基础细胞.在不同微环境作用下,PDLSC的增殖分化特性呈现出较大的差别.牙周膜干细胞龛和炎症等微环境对PDLSC的分化有抑制作用,然而,牙本质微环境及发育期根尖微环境能促进PDLSC的分化.研究不同的微环境对PDLSC功能的影响,一方面有助于深入研究PDLSC的生物学功能,另一方面为PDLSC应用于牙周疾病的再生治疗提供理论依据.本文就不同的微环境对PDLSC分化的抑制和诱导作用研究进展作一综述,并展望PDLSC在牙周缺损再生治疗中的应用前景.
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牙周膜干细胞的研究进展
牙周组织工程是牙周病治疗研究的热点,牙周膜干细胞是其关键种子细胞之一.本文就牙周组织工程的相关研究和牙周膜干细胞的来源、分离与培养、细胞表型、生物学特性、功能影响因素和分子调控进行综述,并对其面临的挑战和前景作一讨论.
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牙周膜干细胞巢与牙周组织再生
牙周膜干细胞巢是牙周膜干细胞周围的微环境，由干细胞周围的支持细胞、黏附分子和基质组成，其在牙周组织的发育、牙周病的发生与发展以及牙周组织再生等方面具有重要的作用。本文将从影响巢结构稳定的因素及其在牙周组织再生中的作用等方面作一综述。
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牙周膜干细胞的研究进展
牙周膜干细胞可分化为成骨细胞或成牙骨质细胞、脂肪细胞和胶原形成细胞,是牙周组织工程中新的种子细胞.笔者就牙周膜干细胞的生物学特性、牙周膜干细胞的多向分化潜能、牙周膜干细胞的移植及其潜在的临床应用价值作一综述.
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根尖诱导形成术的组织学基础
根尖诱导形成术是用药物诱导牙根尚未发育完成的年轻恒牙的根尖继续发育或形成钙化屏障的技术.近年来对其诱导剂的研究较多,对其组织学基础和诱导机制的研究比较缺乏.现对其组织学基础的研究作一综述,以期为根尖诱导形成术的研究指明方向.
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牙周膜维持结构和功能稳定的分子机制
牙周膜中存在有多向分化潜能的成体干细胞,能够分化形成成骨细胞和成牙骨质细胞,参与牙周组织骨改建、损伤修复及牙周再生,同时,牙周膜还具有抑制矿化、维持其结构与功能稳定的调节机制.本文就牙周膜细胞的分化能力和参与维持牙周膜结构与功能稳定的分子机制作简要综述.
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体外培养环境影响牙周膜干细胞生物学特性的研究进展
牙周膜干细胞是具有自我更新能力与多向分化潜能的成体干细胞,作为口腔组织工程研究的候选种子细胞备受关注.进行体外培养过程中,原代细胞分离方法、基础培养基成分、氧气浓度、培养时间、细胞保存条件及其他物理和化学刺激的施加等培养因素可在一定程度上改变牙周膜干细胞的增殖、分化、迁移等特性,将影响其在组织工程中应用的效果.本文围绕体外培养环境对牙周膜干细胞生物学特性的影响进行综述,为优化牙周膜干细胞体外培养条件、充分发挥其全能性提供参考.
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赖氨酸乙酰基转移酶2A通过经典Wnt通路影响牙周膜干细胞成骨分化
目的 探讨赖氨酸乙酰基转移酶2A(KAT2A)调控牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的机制.方法 分离培养来自健康志愿者的PDLSCs(H-PDLSCs)和牙周炎患者的PDLSCs(P-PDLSCs),比较传代细胞中KAT2A基因的表达水平.采用KAT2A基因干扰H-PDLSCs,检测KAT2A基因干扰对H-PDLSCs成骨分化的影响;同时检测KAT2A干扰后对经典Wnt通路及其配体的影响,确定KAT2A基因与经典Wnt通路的上下游关系.结果 与H-PDLSCs相比,P-PDLSCs中KAT2A基因的表达下降,差异有统计学意义(P＜0.05).KAT2A基因被干扰后,PDLSCs成骨能力下降(P＜0.05),同时经典Wn通路被激活,拮抗剂Dickkopf-1(DKK-1)表达下调;加入DKK-1后,被干扰的PDLSCs成骨分化功能恢复,而KAT2A的表达不受影响,仍维持较低水平.结论 牙周炎可导致PDLSCs中KAT2A基因表达下降,激活经典Wnt通路,抑制细胞的成骨分化.
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尼古丁通过调控Toll样受体4抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力
目的 探讨尼古丁对牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖和成骨分化能力的调控作用,检测尼古丁能否通过调控Toll样受体4(TLR4)抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力.方法 培养PDLSCs,采用流式细胞仪检测PDLSCs表面抗原标志,WST-1试剂盒检测不同浓度尼古丁刺激后PDLSCs增殖能力的改变.采用茜素红染色观察PDLSCs经不同浓度尼古丁刺激和成骨诱导后的矿化结节生产情况.运用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测经尼古丁刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因和蛋白的改变,以及尼古丁联合TLR4抑制剂TAK-242刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因及蛋白的改变.结果 培养的细胞表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD105,证实为PDLSCs.与对照组相比,培养3 d后,尼古丁浓度为10-4 mol·L-1的PDLSCs的增殖能力受到明显抑制(P<0.05);成骨诱导21 d后,10-4 mol·L-1尼古丁刺激组茜素红染色矿化结节明显减少.RT-PCR反应及Western blot显示:与对照组相比,尼古丁刺激组PDLSCs的碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因及蛋白表达量均降低(P<0.05),加入TLR4抑制剂TAK-242后,尼古丁的抑制效应减弱.结论 尼古丁可能通过TLR4信号通路抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力.
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人牙周膜干细胞的分离鉴定及骨形态发生蛋白-2对其趋化效应的研究
目的 研究人牙周膜干细胞(PDLSCs)对骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)的趋化反应.方法 通过有限稀释法分离、培养人PDLSCs,利用免疫荧光染色检测人PDLSCs波形丝蛋白及干细胞表面标志物STRO-1的表达,检测人PDLSCs多向分化能力,通过克隆形成实验和5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)共培养的方法检测其干细胞特性.利用24孔的Transwell细胞培养室来检测人PDLSCs对BMP-2的趋化反应,光镜下计迁移至滤膜下侧面的不同视野的细胞数.结果 人PDLSCs抗波形丝蛋白染色阳性,表达干细胞表面标志物STRO-1,体外诱导培养的人PDLSCs能够向成骨细胞和成脂细胞分化,具有较高的自我更新能力,并在体外呈克隆状生长.在100、200 ng·mL-1 BMP-2实验组,Transwell细胞培养室中迁移的细胞数目显著多于空白对照组(P＜0.01).结论 BMP-2对人PDLSCs有趋化效应.
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增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体标记人牙周膜干细胞的实验研究
目的 研究增强型绿色荧光蛋白(eGFP)慢病毒载体标记人牙周膜干细胞(PDLSCs)的理想条件,以获得稳定高表达eGFP的人PDLSCs.方法 eGFP慢病毒载体以25、50、100、200和400的感染复数(MOI)转染人PDLSCs 48 h,荧光倒置显微镜及流式细胞术检测各组的转染效率和荧光强度,MTT法评价转染对细胞增殖的影响,检测细胞多向分化能力以及碱性磷酸酶(ALP)的表达状况,从而确定理想的转染条件.结果 eGFP慢病毒作用48 h,不同组的转染效率分别为44.7％、60.9％、71.7％、85.8％、86.9％；除MOI为400时以外,eGFP慢病毒转染对细胞增殖无明显影响；MOI为200时,转染细胞的多向分化能力未受影响,ALP活性与未转染组的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MOI为200作用48h对细胞的增殖分化无明显影响,是eGFP慢病毒载体标记PDLSCs的理想条件,保持了其基本的生物学特性.
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牙周膜干细胞向脂肪细胞方向定向诱导分化实验
目的 探讨人牙周膜干细胞(PDLSCs)向脂肪细胞定向分化潜能,分析其分化过程中形态与功能变化.方法 免疫磁珠法分离人PDLSCs,用成脂诱导液连续诱导21 d,通过倒置显微镜、透射电镜、流式细胞仪、RTPCR、Western blot及免疫荧光方法观察诱导细胞形态、结构变化,分析其表面脂肪细胞特异性标志--低密度脂蛋白(LPL)和过氧化物酶体增殖物受体γ(PPAR-γ)的基因及蛋白表达时相及表达量,油红O染色检测脂滴分泌情况.结果 诱导21 d,诱导细胞呈脂肪细胞样圆形细胞,超微结构观察可见胞浆中大量脂肪细胞特征性脂滴.流式分析结果显示,有96.54%的PDLSCs向脂肪细胞分化.诱导细胞表达脂肪细胞特异性表面标志LPL mRNA和PPAR-γ mRNA及PPAR-γ蛋白,且随诱导时间延长PPAR-γ蛋白表达量增加.诱导细胞产生油红O阳性染色的脂滴.结论 人PDLSCs在适当条件下可定向分化为脂肪细胞样细胞,并具有脂肪细胞形态、结构和功能特点,具有可塑性.
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人牙周膜干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究
目的 体外定向诱导人牙周膜干细胞分化为神经元样细胞,探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能.方法 体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞(PDLSC),用含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的预诱导培养液诱导培养24 h,然后换用含5 mmol/L β-巯基乙醇(B-ME)的诱导培养液诱导培养6 h,光镜下观察诱导细胞形态学的改变,免疫荧光、RT-PCR等方法 检测鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.同时以未诱导细胞为对照.结果 体外诱导培养6 h细胞即发生形态学改变,可看到典型的神经元样细胞;免疫荧光、RT-PCR检测诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE、NF,未诱导细胞无表达.结论 人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为神经元样细胞,具有多向分化的潜能.
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犬牙周膜干细胞体外分离培养和鉴定的实验研究
目的 体外分离培养犬牙周膜干细胞,并对其进行生物学鉴定.方法 采用有限稀释法进行犬牙周膜细胞克隆筛选,获得单细胞克隆来源细胞,检测其克隆形成率,并采用免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、苏木精一伊红染色以及生长因子分化诱导等方法 观察其生物学特性.结果 1)克隆化分离培养的犬牙周膜干细胞呈集落状生长,增殖快,克隆形成率为0.95%.2)苏木精一伊红染色见细胞呈成纤维样,体积小、核大,有较多的双核细胞.3)碱性磷酸酶染色阳性.4)细胞表型组化鉴定波形丝蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原阳性,间充质干细胞表面标志STRO-1染色阳性,角蛋白染色阴性.5)在含β-磷酸甘油钠、维生素C、地塞米松的矿化液中,细胞被诱导分化为成骨细胞,碱性磷酸酶活性增强,Ⅲ犁胶原染色阴性,能形成矿化结节,细胞表达成骨细胞特异的骨涎蛋白,在含β-羟基乙醇的培养液中,被诱导分化为神经细胞样细胞.结论 克隆化分离培养的犬牙周膜干细胞具有很强的克隆形成能力,具有间充质干细胞表型和多向分化潜能.
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肿瘤坏死因子-α对牙周膜干细胞骨向分化及Notch信号通路的影响
目的 研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对牙周膜干细胞(PDLSCs)骨向分化及Notch信号通路的影响,初步探讨在TNF-α影响下Notch信号通路对PDLSCs成骨分化的调控作用.方法 采用酶消化结合组织块法获得PDLSCs,通过流式细胞仪检测间充质干细胞(MSCs)表面标记物CD105、CD90、CD146、CD45、CD31的表达,将PDLSCs分为实验组(10 ng·mL-1TNF-α)和对照组(不含TNF-α),使用CCK-8法检测PDLSCs增殖能力;通过碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色、实时定量聚合酶链反应(PCR)检测TNF-α对PDLSCs成骨能力的影响;实时定量PCR检测Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3,配体JAG1、JGA2、DLL1,细胞内效应分子Hes-1的表达.结果流式细胞仪检测结果显示CD105、CD90及CD146表达阳性,CD45、CD31表达阴性;CCK-8法结果显示TNF-α能够促进PDLSCs增殖能力(P<0.05);ALP活性检测结果显示,实验组与对照组相比,ALP活性降低(P<0.05);茜素红染色结果显示,与对照组相比,实验组矿化结节减少;实时定量PCR结果显示,与对照组相比,成骨标志基因牙骨质附着蛋白(CAP)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)表达量明显降低(P<0.05);Notch信号通路相关分子中Notch1、Notch2、JAG1、JGA2、Hes-1的表达水平显著降低(P<0.05),而Notch3、DLL1的表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 TNF-α能够促进PDLSCs增殖而抑制其骨向分化,同时抑制Notch信号通路的表达,说明Notch信号通路对PDLSCs骨向分化具有一定的调控作用.
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牙龈间充质干细胞与牙周膜干细胞膜片牙周再生能力的实验研究
目的 对比牙龈间充质干细胞(GMSCs)与牙周膜干细胞(PDLSCs)膜片的牙周再生能力.方法 制备能够稳定表达增强绿色荧光蛋白(eGFP)的GMSCs和PDLSCs膜片及雄性比格犬牙周炎Ⅲ度根分叉病变模型4只(均选择双侧下全面第2、3、4前磨牙作为手术牙位制备模型),分别将GMSCs、PDLSCs膜片移植入模型作为GMSCs组和PDLSCs组,不植入膜片作为空白对照组.8周后处死动物,评价2种膜片对牙周缺损的修复能力.结果 HE染色组织形态学分析、免疫组织化学分析、天狼星红染色结果均显示GMSCs和PDLSCs能够有效促进牙周组织再生,效果明显好于空白对照组(P＜0.05).但2种膜片再生能力对比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 GMSCs与PDLSCs膜片均具备良好的牙周再生能力.
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miR-17对炎症微环境中PDLSCs骨向分化特性的影响
目的 探讨体外炎症微环境中,miR-17对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)骨向分化能力的影响.方法 体外有限稀释法克隆化和密度梯度离心法分别培养牙周膜干细胞(PDLSCs)和外周血免疫细胞(PBMCs),并建立PDLSCs与免疫细胞的Transwell共培养炎症微环境体系.使用定量PCR技术检测miR-17的表达,并将PDLSCs转染miR-17模拟物Mimics和抑制剂Inhibitor后进行成骨诱导,ALP染色,定量PCR和Western Blot检测细胞成骨分化的能力.结果 共培养组PDLSCs中miR-17表达降低,转染Mimics后共培养细胞成骨分化能力升高,转染Inhibitor后细胞成骨分化能力降低.结论 炎症微环境中miR-17可以促进PDLSCs骨向分化.
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胰岛素样生长因子1(IGF-1)促进人牙周膜干细胞增殖并诱导其向牙周膜成纤维细胞分化
目的 明确外源性胰岛素样生长因子1(IGF-1)多肽对体外培养的人牙周膜干细胞(hPDLSC)增殖及分化的影响.方法 有限稀释法分离培养hPDLSC,流式细胞术检测细胞表面标志物的表达.结晶紫染色观察细胞集落形成.采用成骨及成脂诱导液诱导hPDLSC分化.采用CCK-8法分析(1、10、30、50、100) ng/mL IGF-1处理对hPDLSC增殖活性的影响.实时定量PCR检测IGF-1处理的hPDLSC中1型胶原蛋白α1(Col1 α1)、3型胶原蛋白α1(Col3α1)、抗Runt相关转录因子2(Runx2)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、牙骨质蛋白1(CEMP1)、scleraxis(SCXA) mRNA的表达.Western blot法检测Col1、Col3、Runx2、CEMP1及SCXA蛋白表达的水平.结果 有限稀释法分离培养的hPDLSC高表达干细胞表面标志物CD105 (95.4％)和CD90 (96.1％),而低表达造血细胞标志物CD34(1.58％)、CD45(1.74％).hPDLSC可形成集落并具有向成骨和成脂分化能力.IGF-1可提高hPDLSC的增殖活性,并呈剂量依赖效应.与对照组相比,IGF-1处理的hPDLSC中Runx2、BSP、OPN及CEMP1 mRNA的表达水平无明显变化,而Col1 α1、Co13α1、SCXA显著增加.并且IGF-1处理后hPDLSC中Col1、Col3及SCXA的蛋白含量增加.结论 IGF-1可促进hPDLSC增殖和胶原蛋白合成,加速其向牙周膜成纤维细胞分化.
关键词： 胰岛素样生长因子1(IGF-1) 牙周膜干细胞 增殖 分化 -
骨形成蛋白-2和牙胚细胞联合作用诱导人牙周膜干细胞表达成牙骨质细胞的表型研究
目的:探讨大鼠牙胚细胞(Tooth germ cells,TGC)与骨形成蛋白-2 (Bone morphogenetic proteins-2,BMP-2)联合作用对人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)向成牙骨质细胞表型分化的作用.方法:将免疫磁珠法分离的hPDLSCs与TGC共培养,并加入50ng/mL的BMP-2,通过RT-PCR,茜素红染色和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测等方法分析其相关成牙骨质基因及蛋白的表达变化.结果:诱导后hPDLSCs的ALP活性明显升高(P＜0.001),牙骨质细胞相关基因如牙骨质附着蛋白(Cementum attachment protein,CAP)、牙骨质蛋白(Cementum protein1,CEMP-1)、ALP,骨钙素(Osteocalcin,OCN)的转录水平表达量均有不同程度的增高(P＜0.001).矿化诱导14d后,诱导组形成大量矿化结节,与对照组相比具有统计学意义(P＜0.001).结论:TGC与BMP-2联合作用能够诱导hPDLSCs与向成牙骨质细胞的表型分化.
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葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化的作用
目的:探讨葛根素对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化的影响.方法:向体外培养的hPDLSCs中分别加入0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作为实验组,另设阳性对照组和空白组.MTT法检测葛根素对hPDLSCs活性影响,采用免疫荧光法、碱性磷酸酶(alkaline phosphotase,ALP)试剂盒、茜素红染色及qRT-PCR对葛根素作用后hPDLSCs生物学特性作初步观察.结果:0.01mmol/L葛根素可明显促进hPDLSCs增殖,免疫荧光染色显示实验组Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)均阳性表达；与空白组对比,实验组诱导7天后ALP活性升高,14天后茜素红染色见矿化结节形成,qRT-PCR检测ALP和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)分别在加药后7天和14天表达上调.结论:葛根素能够促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化.
