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牙龈卟啉单胞菌超声提取物对hPDLSCs表达VEGF的影响
目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)超声提取物对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的影响.方法:标准厌氧培养环境下培养Pg,收集细菌菌落,离心,制备细菌的超声提取物,然后以不同的浓度加入hPDLSCs的培养液中.培养6 d,分别观察第2、4、6 天时hPDLSCs的增殖情况.提取蛋白并用Western Blotting法检测VEGF和MMP-9的表达.结果:与对照组相比,第2 天时,10 μg/ml和100 μg/ml Pg轻度促进hPDLSCs的生长,第4 天时,10 μg/ml和100 μg/ml Pg则明显抑制hPDLSCs的生长(P＜0.05),第6 天时,3 种浓度的Pg均明显抑制hPDLSCs的生长(P＜0.05);1 μg/ml和10 μg/ml Pg上调VEGF的表达,100 μg/ml Pg明显抑制VEGF的表达;3 种浓度的Pg均上调hPDLSCs中MMP-9的表达.结论:作为牙周炎病原菌,大量的Pg可能通过抑制hPDLSCs的生长增殖,抑制局部血管重建以及加速细胞外基质的降解而降低了牙周组织的自我修复能力.
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线粒体融合蛋白-1对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响
目的: 比较正常及炎症来源的牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs) 中线粒体融合蛋白-1 (mitofusion 1,Mfn1) 的表达差异及其对PDLSCs 成骨分化的影响.方法: 分离培养PDLSCs,分别为正常来源(HPDLSCs)、牙周炎来源(P-PDLSCs) 及应用IL-1β 模拟炎症微环境诱导牙周膜干细胞(H-PDLSCs + IL-1β) .RT-PCR 方法检测对比H-PDLSCs 与P-PDLSCs、H-PDLSCs 与H-PDLSCs + IL-1β 中Mfn1 表达差异;RT-PCR 检测成骨基因、茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量,对比P-PDLSCs 及siMfn1 下调Mfn1 表达后的成骨分化能力.结果: 与H-PDSLCs 组相比,P-PDSLCs 组及H-PDLSCs + IL-1β 组中Mfn1 表达量显著升高(P＜ 0. 05);siMfn1 下调P-PDSLCs 中Mfn1 表达量后,其成骨分化能力增强(P＜ 0. 05) .结论: 炎症微环境下,PDLSCs 中Mfn1 表达量升高,导致成骨分化能力下降.
关键词： 牙周膜干细胞 炎症微环境 线粒体融合蛋白-1(Mfn1) 成骨分化 -
冷冻干燥牙本质对牙周膜干细胞影响的研究
目的:制作冷冻干燥牙本质生物支架(FDDM)并研究其对牙周膜干细胞(PDLSCs)的影响.方法:制作FDDM生物支架;将PDLSCs分别接种在FDDM、普通牙本质(D)、羟基磷灰石/磷酸三钙(HA)、盖玻片/α-MEM表面或浸提液中.MTT法检测细胞增殖;粘胶纤维红检测胶原分泌量;扫描电镜检测细胞形态;共聚焦显微镜观察各组细胞骨架形态.结果:研制出FDDM;MTr结果显示FDDM组细胞增殖活性高于HA组(P＜0.05);胶原检测显示FDDM组细胞分泌的胶原多于HA组(P＜0.05);电镜结果显示FDDM组细胞紧密粘附,细胞突起的数目和长度大于HA与盖玻片组;共聚焦结果显示,FDDM组细胞骨架较HA、盖玻片组粗大、清晰.结论:FDDM促进PDLSCs的增殖、胶原分泌,促进细胞粘附及细胞应力纤维形成.
关键词： 冷冻干燥牙本质(FDDM) 牙周膜干细胞 胶原分泌 细胞骨架 -
内毒素条件下苯妥英钠对人牙周膜干细胞钙调蛋白表达的影响
目的:探讨内毒素(LPS)环境下,苯妥英钠(PHT)对人牙周膜干细胞钙调蛋白(CaM)表达的影响.方法:体外培养人牙周膜干细胞,设空白对照、LPS5μg/ml、PHT5μg/ml、PHT20μg/ml、PHT5μg/ml+LPS5μg/ml和PHT20μg/ml+LPS5μg/ml共6个实验组,刺激24h、3d、5d后,运用RT PCR、免疫荧光细胞化学技术结合共聚焦显微镜检测各实验组牙周膜干细胞中CaM表达的变化.结果:①适宜浓度的PHT、LPS单一刺激、PHT和LPS共同刺激均可增强牙周膜干细胞CaM的表达.②PHT20μg/ml对牙周膜干细胞产生CaM的正向作用强.③PHT5μg/ml+LPS5μg/ml的混合刺激作用强于PHT20μg/m+LPS5μg/m.结论:PHT可能是通过CaM途径对牙周膜干细胞的增殖产生促进作用.低浓度的PHT和LPS混合刺激作用要优于较高浓度的PHT与LPS的混合刺激.
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2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞骨向分化研究
目的:比较牙周炎和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞成骨分化能力.方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周炎患者牙周膜干细胞(P-PDLSCs组)和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞(D-PDLSCs组),计算克隆形成率,免疫荧光检测细胞表型分子CD146、STRO-1进行干细胞鉴定,矿化诱导后茜素红染色观察矿化结节形成,实时定量聚合酶链反应(real time PCR)检测成骨相关基因表达.结果:P-PDLSCs组和D-PDLSCs组细胞的克降形成率分别为(25.6±2.7)％和(17.9±1.7)％(P＜0 05)；P-PDLSCs组CD146和STRO-1表达明显高于D-PDLSCs组；成骨诱导21 d后茜素红染色,2组均出现不同程度的矿化结节,P-PDLSCs组的矿化能力较D-PDLSCs组强；成骨诱导1周后D- PDLSCs组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白(type-Ⅰ collagen,Col-Ⅰ)的mRNA表达均明显低于P-PDLSCs组(P＜0.05).结论:糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞成骨分化能力低于单纯牙周炎患者牙周膜干细胞.
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不同诱导环境对牙周膜干细胞膜片生物学特性的影响
目的:探讨不同诱导体系对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)膜片的构建以及生物学性能的影响.方法:分离培养大鼠发育期根端复合体( developing apical complex,DAC)细胞,隔天更换收集细胞培养液上清并过滤冻存(DAC条件培养液).分离培养人PDLSCs,并扩增构建PDLSCs细胞膜片,利用DAC条件培养液和成骨诱导液分别诱导PDLSCs膜片5、10、15 d.通过倒置显微镜、HE染色、免疫组化、RT-PCR检测经过诱导的人PDLSCs细胞膜片形态学和功能学变化.结果:与成骨诱导相比,DAC诱导后膜片含有丰富短棒状细胞和大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM),细胞膜片ALP和periostin表达丰富,体外成骨基因表达更高.结论:与成骨诱导体系相比,DAC诱导体系更适合PDLSCs膜片的形成.
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牙源性干细胞的研究进展
牙源性干细胞（dental stem cells）具有优越的干细胞特性，可以从医疗废弃物（如正畸需要拔除的牙、智齿等）中获得，日益成为组织工程和再生医学研究的干细胞来源，这些干细胞的开发研究将为组织工程和再生医学的研究拓展更为广阔的空间，具有重要的转化研究价值。本文将对几种常见的牙源性干细胞的研究背景、研究现状等进行综述，并对未来应用前景进行展望。
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影响牙周膜干细胞功能的重要因素
牙周膜干细胞(PDLSCs)是维持牙周组织动态平衡和缺损修复的关键细胞,也是牙周组织再生治疗新策略的基础.近年来研究证明PDLSCs具有良好的增殖和分化能力,然而在不同因素的影响下其功能也呈现出较大的差异性.研究这些影响因素不仅有助于深入认识和发掘PDLSCs的生物学功能,而且对今后基于干细胞的牙周疾病治疗具有理论指导意义.该文就影响PDLSCs功能的多种重要因素作一叙述,并展望其在牙周缺损再生修复治疗中的应用前景.
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TNF-α及LPS刺激下牙周膜干细胞IκB磷酸化及其下游基因的表达
目的:研究TNF-α及LPS刺激下牙周膜干细胞IκB磷酸化及其下游基因的表达.方法:体外分离、培养人牙周膜干细胞,分别在10 ng/mL TNF-α和500 ng/mL Ecoli.LPS刺激下进行培养,并于刺激培养即时(0 h)、5、30 min和1、2h,采用Western Blot法检测IκBα总蛋白和磷酸化IκBα蛋白的表达变化;Real-time PCR检测IL-6、IL-8 mRNA的表达水平.结果:牙周膜干细胞在10 ng/mL TNFα或500 ng/mL Ecoli.LPS刺激下培养0～2h不同时间后,IκBα总蛋白随刺激时间逐渐降低,1h时低;磷酸化IκBα随刺激时间逐渐升高,2h时高;NFκB的下游基因IL-6及IL-8mRNA表达水平均随刺激时间逐渐升高,2h时升高明显(P＜0.05).结论:炎症细胞因子TNF-α或LPS均可促进牙周膜干细胞中IκBα蛋白的磷酸化,并上调IL-6、IL-8 mRNA的表达;提示NFκB信号通路的活化可能是导致炎症状态下牙周膜干细胞功能损害的重要因素.
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SDF-1α/CXCR4轴影响牙周膜干细胞血管内皮向分化的初步研究
目的:探讨牙周炎时SDF-1α/CXCR4轴对PDLSCs血管内皮向分化的影响.方法:分别从正常和炎症牙周组织分离培养鉴定牙周膜干细胞(H-PDLSCs、P-PDLSCs);Real time PCR检测两种干细胞中基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)及趋化因子受体4[chemokine(c-x-c motif)receptor4,CXCR4]的表达;然后用SDF-1α分别对两种干细胞进行诱导(14d),Real time PCR检测H-PDLSCs和P-PDLSCs中成血管相关基因CD31、VWF mRNA的表达; Matrigel基质胶管腔形成实验观察、比较H-PDLSCs和P-PDLSCs的管腔形成情况及差异.结果:P-PDLSCs较H-PDLSCs高表达CXCR4 mRNA (P<0.05),低表达SDF-1αmRNA(P<0.05);经SDF-1α诱导后,P-PDLSCs中成血管相关基因CD31、VWF mRNA的表达水平均明显高于H-PDLSCs(P<0.05);其管腔形成数量也明显高于H-PDLSCs (P<0.05).结论:P-PDLSCs中CXCR4 mRNA高表达,对牙周炎症组织环境中的SDF-1α更加敏感,其血管内皮向分化的趋势和能力均增强.
关键词： 牙周膜干细胞 炎症 基质细胞衍生因子-1α 趋化因子受体4 内皮向分化 -
血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞体内外增殖、矿化能力的影响
目的:研究血小板裂解液(Platelet Lysate,PL)在体内外对人根尖牙乳头干细胞(SCAP)和牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖、矿化的干预效应,以期找到PL应用于这两种细胞的佳方式.方法:在矿化诱导培养体系中按一定体积比加入PL,分别作用于体内、外复合HA-TCP支架材料三维生长的SCAP和PDLSCs,扫描电镜(SEM)以及组织学观察细胞生长、分化情况.结果:体外三维培养模式下,PL能够促进SCAP和PDLSCs的增殖以及矿化细胞外基质的形成,并利于在支架材料上形成完整的细胞膜片(cell sheet)样结构,以上效应对于PDLSCs作用更为显著.而在体内移植模式下,经50 mL/L、10 mL/L PL培养体系预培养的SCAP能形成包含成牙本质细胞样细胞、牙本质样基质和牙髓组织的牙本质牙髓复合体样结构；而PDLSCs经50 mL/L PL干预后,可分化为成牙骨质细胞样细胞,并生成牙骨质样基质、牙周膜样组织.结论:一定体积浓度比的PL能促进SCAP和PDLSCs在体内外的增殖以及成骨、成牙本质分化.
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糖基化终末产物对牙周膜干细胞增殖及其Wnt经典信号通路相关基因表达的影响
目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)增殖及其Wnt经典信号通路相关基因DKK-1、β-catenin表达的影响.方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养HPDLSC,并与100 μg/mL AGEs共同培养,通过细胞克隆形成率、细胞生长曲线观察AGEs对HPDLSC增殖能力的影响；RT-PCR和Western Blot检测实验组和对照组DKK-1、β-catenin mRNA以及核蛋白β-catenin的表达量.结果:经100 μg/mL AGEs刺激的HPDLSC,其克隆形成率、增殖速度以及β-catenin mRNA和核蛋白β-catenin的表达量均明显低于对照组(P＜0.05)；而DKK-1 mRNA则明显高于对照组(P＜0.05).结论:AGEs能抑制HPDLsC的增殖及其Wnt经典信号通路.
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年龄因素对人牙周膜干细胞培养和性能的影响
目的:探讨年龄因素对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)体外培养及其生物学特性的影响.方法:收集临床＜30岁、＞50岁具有完整牙根的第三磨牙各4个,分别刮取根面残留牙周膜进行PDLSCs分离培养,观察其细胞克隆形成能力、MTT方法检测生长曲线、流式细胞仪分析细胞表面分子,并进行体外成骨、成脂诱导,对比分析PDLSCs多向分化能力.结果:两组第三磨牙中均可培养出具有明显间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)特性的PDLSCs,但＞50岁组获得的PDLSCs克隆形成率显著降低(P＜0.05),其增殖、分化能力亦较＜30岁组明显减弱(P＜0.05).结论:年龄因素对PDLSCs体外培养及其生物学特性具有明显影响；PDLSCs的基础和临床研究中,应充分考虑到病人年龄因素.
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Bio-Gide生物膜与人牙周膜干细胞的生物相容性研究
目的:评价Bio-Gide生物膜与人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的生物相容性,为其作为细胞载体用于牙周组织工程提供依据.方法:体外分离培养人PDLSCs,经鉴定后与Bio-Gide生物膜浸提液共同培养,评价该膜材料的细胞毒性;将人PDLSCs接种于Bio-Gide生物膜后,通过扫描电镜和Hochest荧光核染色观察其在膜材料上的粘附、生长情况.结果:人PDLSCs和Bio-Gide生物膜浸提液共同培养后,其增殖率为122.66％,无细胞毒性;人PDLSCs接种于膜材料上培养1～12d后扫描电镜观察可见,PDLSCs在膜材料上能正常增殖且成膜性生长;经Hochest荧光核染色观察人PDLSCs与膜材料的粘附率为86.7％.结论:Bio-Gide生物膜除具有良好的物理屏障外,无细胞毒性,且能支持PDLSCs的成膜性生长.
关键词： 牙周膜干细胞 Bio-gide生物膜 细胞毒性 细胞相容性 -
牙周膜干细胞膜片的构建及其生物学特性的研究
目的:探讨牙周膜干细胞膜片的构建及其生物学特性.方法:采用胶原酶消化人牙周膜组织,获得牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs),经体外鉴定、扩增后构建PDLSCs细胞膜片,并通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜(SEM)对PDLSCs细胞膜片形态学进行检测.此外,细胞膜片厚度及膜片中细胞密度也被检测.结果:PDLSCs成功被分离、培养、鉴定,并且PDLSCs体外培养2周后,获得白色膜状PDLSCs细胞膜片.倒置显微镜下观察显示,细胞复层生长,细胞呈典型的纺锤状.体式显微镜下观察显示,细胞与细胞之间紧密连接.组织学观察显示,细胞与细胞之间存在着大量细胞外基质(Extracellular matrix,ECM).扫描电镜下观察膜片表面显示,细胞在膜片上充分伸展,细胞之间紧密连接.PDLSCs细胞膜片厚度由起初的(48±3.2)μm到3周后的(69±3.4)μm,但在第2周细胞厚度(64±3.3)μm,变化明显.细胞膜片中的细胞密度检测显示连续培养3周后仍然有大量具有活性的细胞存在,然而细胞密度在第2周时大.结论:本研究证明我们已经成功探索出一套稳定、可靠的PDLSCs细胞膜片构建方法,为利用PDLSCs细胞膜片修复、再生牙周组织及牙周缺损提供了一定的技术保证.
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rhBMP-7缓释微球的制备及其对人牙周膜干细胞增殖分化的影响
目的:制备一种具有良好缓释功能和降解性的rhBMP-7载体材料,并观察其对牙周膜干细胞增殖分化的影响.方法:采用复乳-溶剂蒸发技术制备缓释rhBMP-7的3-羟基丁酸酯与3-羟基戊酸酯的共聚物(PHBV)的载体微球,测定微球的粒径和形态,载药率,体外释放率,将其释放液与人牙周膜干细胞共培养,观察其对细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响.结果:微球形态均匀圆整,平均粒径为(50±12)μm,载药率为(0.67±0.27)%,体外释放1 d为(17.22±0.94)%,累计释放量不断增加,56 d时达到(52.75±4.67)%.与空白对照组相比.微球释放液可促进细胞增殖和碱性磷酸酶活性(P<0.05),且7 d后的释放液对细胞的影响随时间增加逐渐加强(P<0.05).结论:载有rhBMP-7的微球具有较好的缓释作用和生物活性,是一种较为理想的生长因子载体材料和缓释系统.
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人牙周膜干细胞雌激素受体表达检测的实验研究
目的:检测体外分离纯化的人牙周膜干细胞(PDLSCs)是否有雌激素受体(ER)表达.方法:采用免疫细胞化学染色、Western blot、RT-PCR技术检测PDLSCs中雌激素受体ER-α、ER-β的表达.结果:免疫细胞化学检测显示ER-α、ER-β在牙周膜干细胞内均呈棕黄色阳性染色,定位于细胞核;Westem blot与RT-PCR测定结果显示,PDLSCs中ER-α及ER-β表达高于相同来源的牙周膜细胞,PDLSCs中ER-α表达高于ER-β,且在雌激素作用下ER-α及ER-β表达均增加.结论:体外分离纯化的PDLSCs中存在雌激素受体(ERα、ERβ)的表达,且受雌激素的调控.
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转化生长因子β1对牙周膜干细胞成骨分化影响的实验研究
目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖和骨向分化的影响. 方法:将体外培养的hPDLSCs随机分为对照组(不含TGF-β1)和2个实验组(1、10 ng/mL TGF-β1),用CCK8检测细胞的增殖情况;碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色及实时定量PCR检测各组细胞的成骨分化情况.结果:TGF-β1可促进细胞增殖,且10 ng/mL组细胞的增殖能力较强(P<0.05);与对照组相比,实验组的ALP活性明显升高,且10 ng/mL 组较1 ng/mL组升高更明显(P<0.05);茜素红染色结果显示,实验组hPDLSCs染色显著,矿化结节形成范围大且呈深橘色,10 ng/mL组较1 ng/mL组染色更显著;RT-PCR结果显示,与对照组相比,10 ng/mL组成骨相关基因牙骨质附着蛋白(CAP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2)表达量明显升高( P<0.05).结论:10 ng/mL的TGF-β1可明显促进hPDLSCs的骨向分化.
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白藜芦醇预处理提高衰老牙周膜干细胞克隆和增殖潜能的研究
目的:观察白藜芦醇预处理能否衰使老牙周膜干细胞(Aged-PDLSCs)的增殖潜能和克隆形成能力得到增强.方法:将体外分离培养的中老年个体来源PDLSCs随机分为常规培养组、白藜芦醇预处理组、尼克酰胺预处理组;各组经相应处理后,采用MTT法检测其增殖潜能,结晶紫染色检测其克隆形成能力,RT-PCR和Western Blot检测其细胞中SIRT1和P53基因及蛋白的表达水平.结果:Aged-PDLSCs经白藜芦醇预处理后增殖潜能和克隆形成能力均得到了显著提高,而经尼克酰胺预处理后,其增殖潜能和克隆形成能力均明显降低;分别与常规培养组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).此外,白藜芦醇预处理还可显著提高Aged-PDLSCs中SIRT1活性(P<0.05),显著降低了P53的表达水平(P<0.05).结论:白藜芦醇能够增强Aged-PDLSCs的克隆形成能力和增殖潜能,其作用可能是通过提高SIRT1的表达水平而实现的.
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牙周膜干细胞在正畸牙移动中的作用及机制研究
目的：探讨牙周膜干细胞（PDLSCs）在正畸牙移动（OTM）中的作用及经典 Wnt 信号通路对其骨向分化能力的影响。方法：将24只 SD 大鼠随机分为4组（n ＝6），3个实验组用加力装置对其右侧上颌第一磨牙施加近中向正畸力，对照组不加力；加力0、1、3、7 d 后牙周组织取材，HE 染色观察形态学变化、TRAP 染色观察破骨细胞数的变化，免疫组化染色观察 nestin 和 active－β－catenin 的表达。分离培养 hPDLSCs 并将其随机分为3组，实验组给予100 KPa／12 h 的静压力刺激，另2组为对照组，分别于0 KPa 静压力和低氧条件下培养12 h，Western blot 法检测细胞中 OPG、RANKL、ALP、Runx2、p－GSK3β、active－β－catenin 的表达水平。结果：随着正畸加力时间的延长，移动牙压力侧的牙周膜间隙逐渐变窄、破骨细胞数逐渐增多；牙周膜内 nestin 和 active－β－catenin 的表达亦随加力时间而呈逐渐上升（P ＜0．05）。Western blot 法检测显示，100 KPa／12 h 静压力刺激组的 hPDLSCs 中，p－GSK3β和 active－β－catenin 的表达水平增加（P ＜0．05），ALP 和 Runx2的表达水平下降（P＜0．05），RANKL／OPG 比例上升（P ＜0．05）。结论：牙周膜干细胞参与正畸牙移动过程，静压力作用可使 hP-DLSCs 中的 Wnt 信号通路激活，使其成骨活性降低、破骨活性增强。
