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miRNA Sponge介导的miR-17和miR-20a基因沉默的抗白血病作用机制
本研究旨在检测急性白血病患者中miR-17和miR-20a前体的表达水平,并探讨miRNA Sponge介导的miR-17和miR-20a沉默的抗白血病作用机制.采用荧光实时定量PCR方法检测初治急性白血病患者及8种白血病细胞株中miR-17和miR-20a前体的表达水平,分析其在各型白血病中的表达情况.利用前期构建的针对miR-17和miR-20a基因的miRNA Sponge慢病毒表达载体,感染高表达miR-17和miR-20a的Jurkat细胞株;用CCK-8方法及流式细胞术分别检测miR-17和miR-20a沉默对Jurkat细胞增殖能力及细胞周期的影响.结果表明:初治急性白血病患者中miR-17和miR-20a前体的表达明显高于正常对照(P＜0.05);且与急性髓系白血病患者相比,急性淋巴细胞白血病患者中的表达量更高;然而二者表达量与患者外周血高白细胞计数无明显相关性(P＞0.05).miR-17和miR-20a沉默能抑制Jurkat细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1—S期,同时促进细胞的凋亡.结论:急性白血病患者中miR-17和miR-20a呈过表达,可能参与白血病的发生、发展;高表达的miR-17和miR-20a可通过在转录后抑制P21和E2F1表达,从而促进细胞增殖及细胞周期G1 —S期转换,抑制细胞凋亡.
关键词： miRNA Sponge miR-17 miR-20a 基因沉默 抗白血病机制 -
MiR-17/RB通路调节血管平滑肌细胞增殖
目的 探索miR-17在血管平滑肌细胞(VSMCs)中对视网膜母细胞瘤(RB)基因和蛋白水平的调控作用,以及对增殖效应的影响.方法 培养HA-VSMCs并诱导其增殖,应用芯片技术筛选出差异表达水平显著的微小RNA(miR).在293T细胞应用荧光素酶报告基因验证生物信息学软件预测的miR-17与RB的靶向结合作用.分别向VSMC转染miR-17 mimic和miR-17 inhibitor并建立阴性对照,检测RB水平及细胞增殖相关指标PCNA表达水平.结果 荧光素酶报告分析证实miR-17与RB mRNA-3'UTR具有靶向结合效应.转染miR-17 mimic促进VSMC增殖相关指标PCNA表达上调,并且可以下调RB蛋白及mRNA水平,转染miR-17 inhibitor后下调PCNA表达且可上调RB表达(P<0.05).结论 miR-17通过靶向结合RB mRNA-3'UTR调控RB表达从而调控VSMCs增殖.
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miR-17在动脉粥样硬化中下调ATG7蛋白水平抑制巨噬细胞的自噬功能
目的 在动脉粥样硬化患者的血液中检测自噬相关miRNA的水平变化,探究差异miRNA是否参与巨噬细胞的自噬过程,并影响巨噬细胞的凋亡及炎症表达.方法 在动脉粥样硬化患者的血液中,用荧光定量PCR的方法检测miRNA的水平.在转染miR-17后,通过蛋白质免疫印迹的方法检测巨噬细胞中ATG7蛋白以及自噬标志物LC3Ⅱ表达.同时,使用MTT实验检测转染miR-17后双氧水诱导巨噬细胞凋亡的改变,通过荧光定量PCR检测炎性因子水平探究转染miR-17后巨噬细胞的炎症表达.结果 在动脉粥样硬化患者的血液中,miR-17的水平特异升高.而转染miR-17后,巨噬细胞中miR-17靶向蛋白ATG7和自噬标志物LC3Ⅱ表达下降.miR-17在巨噬细胞中的升高同时促进了双氧水诱导的细胞凋亡,并增强了TNF-α等炎性因子的表达.结论 miR-17水平在动脉粥样硬化患者的血液中特异升高,并在巨噬细胞通过靶向ATG7介导细胞自噬水平降低,进而增强巨噬细胞的炎症表达并促进其凋亡.
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miR-17表达对内皮细胞氧化应激作用的影响
目的：探讨microRNA-17（miR-17）表达对内皮细胞氧化应激作用的影响。方法培养原代人脐静脉内皮细胞（ HUVEC），分别转染阴性对照病毒[ Ad（ N）组]、上调miR-17腺病毒（ Ad-Pre-miR-17组）及下调miR-17腺病毒（ Ad-Antagomir-17组），用硝酸银法检测细胞内源性NO的释放，DAF FM探针检测细胞内NO含量，以及采用DHE探针检测细胞内超氧化物（ ROS）的含量，并进行统计分析。结果与Ad（ N）组比较，Ad-Antagomir-17组细胞内NO含量提高（ P ＜0怂．05），细胞内ROS含量降低（ P ＜0．05）；而Ad-Pre-miR-17组细胞内NO含量降低（ P ＜0．05），细胞内ROS含量增加（ P ＜0．05）。结论降低miR-17可以改善冠心病患者血流供应，降低氧化应激反应，有助于其血管功能的改善。
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MicroRNA在肺发育过程中作用的研究进展
MicroRNA是一类数量庞大的、小的非编码RNA,在物种间高度保守.至今,研究者们已经发现microRNA在很多生物学过程中扮演着重要的角色,包括发育时间调控、细胞程序性凋亡、免疫应答、胰岛素分泌和多种癌症的进展等.近年来,microRNA已成为肺发育研究领域的热点.该文针对在肺发育过程中已报道的众多microRNA进行概述.
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miR-18a、miR-17和miR-20在结直肠癌组织中表达增高
目的 MicroRNAs(miRNAs)是一类在转录后调控基因表达的非编码RNA,越来越多的证据显示:一些在肿瘤中异常表达的miRNAs,有做为肿瘤诊断分子标记和判断预后的潜在价值.该研究应用miRNAs芯片技术筛选结直肠癌组织中差异表达的miRNAs,探索与结直肠癌相关的miRNAs.方法 从3对手术切除的结直肠癌和相配对的正常结直肠组织中提取总RNA,miRNA芯片检测miRNA表达情况,然后在90例配对的结直肠癌和正常结直肠组织中,用Real-time RT-PCR(Taqman)对部分差异表达miRNA进行验证.结果 与配对的正常结直肠组织相比,有22个miRNAs在结直肠癌中异常表达,其中miR-18a、miR-17和miR-20经Real-time RT-PCR(Taqman)验证,在结直肠癌组织中表达显著增高(P=0.006,0.023,0.034).结论 miR-18a、miR-17和miR-20可能参与了结直肠癌的发生过程.
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miR-17在非小细胞肺癌放射抗拒细胞中的表达及作用研究
目的 建立肺癌放射抗拒细胞系H1975R,并探究miR-17在其放射抗拒中的作用.方法 通过梯度剂量连续照射,体外建立肺癌放射抗拒细胞系H1975R.采用克隆形成实验对H1975R和H1975细胞的放射敏感性进行验证.利用RT-PCR检测亲本细胞和放射抗拒细胞的miR-17的表达水平,并通过上调或下调miR-17表达,比较其放射敏感性变化,应用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布.结果 H1975R的放射生物学参数D0、Dq和SF2均比亲本H1975大(P<0.05),显示更强的放射抗拒性.从RT-PCR结果可知,miR-17在H1975R的表达量是H1975的2.67倍(P<0.01).上调H1975细胞的miR-17表达后,其放射敏感性降低,而细胞增殖和抗凋亡能力均增强,G2/M期细胞比例增多(P<0.05).下调H1975R细胞的miR-17表达后,其放射敏感性升高,而细胞增殖和抗凋亡能力均降低,G2/M期细胞比例减少(P<0.05).结论 miR-17参与非小细胞肺癌放射抗拒的调控,其可能成为治疗放射抗拒的新靶点.
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微小RNA在人类压疮组织中的异常表达
目的 建立人类压疮组织微小RNA表达谱.方法 收集本院24例压疮组织临床样本,选取其中4例用于压疮微小RNA芯片制备.采用生物信息学算法比较压疮组织与正常组织中差异表达的微小RNA,获得压疮微小RNA表达谱.进一步利用20例测试样本,采用实时荧光定量-逆转录-聚合酶链反应对所鉴定的表达谱进行验证.结果 获得了12个差异表达的微小RNA,其中包括5个表达水平上调和7个表达水平下调的微小RNA,其中表达水平下调的miR-17差异表达水平显著.结论 作者建立了一组由12个微小RNA组成的压疮组织微小RNA表达谱,为压疮发生及发展分子调控机制研究提供了丰富的素材.
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miR-17在结肠癌中的表达及其临床意义
目的：探讨 miR-17在结肠癌中的表达与临床病理特征间的关系。方法选取2012年1月至2013年6月经手术切除的50例原发性结肠癌及癌旁组织标本，采用实时荧光定量 PCR 分析 miR-17的表达情况。结果相对于癌旁组织，50例结肠癌组织中 miR-17表达下调（P ﹤0.05），其表达与TNM 分期以及浸润深度有关（均 P ﹤0.05）。结论 miR-17参与了结肠癌的发生发展。
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系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞中miR-17和miR-20a的表达及与病情活动的相关性研究
目的 探讨miR-17和miR-20a在系统性红斑狼疮(SEE)患者CD4+T细胞中的表达及与疾病活动的相关性.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测SLE患者活动组17例、缓解组13例及健康对照组18例外周血CD4+T细胞中miR-17和miR-20a的表达水平,并与SLE患者临床指标进行相关性分析.结果 SLE患者组30例miR-17的表达水平(0.24±0.08)显著高于健康对照组(0.15±0.06),两组比较,P＜ 0.05；两组miR-20a的表达水平分别为0.19±0.10和0.12±0.09,两组比较,P＜0.05.SLE活动组、缓解组与健康对照组miR-17表达水平分别为0.27±0.07、0.20±0.05、0.16±0.08,活动组高于缓解组(P＜0.05)和健康对照组(P＜0.05)；miR-20a表达水平三组分别为0.22±0.10、0.15±0.07、0.13±0.09,活动组高于缓解组(P＜0.05)和健康对照组(P＜0.05)；缓解组miR-17和miR-20a的表达水平与健康对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).SLE患者组miR-17、miR-20a的表达与SLE活动指数(SLEDAI)均呈正相关(r=0.45,P＜0.05和r=0.38,P＜0.05),与抗dsDNA抗体滴度呈正相关(r=0.54,P＜0.01和r=0.46,P＜ 0.01),而与C3水平呈负相关(r=-0.43,P＜0.05和r=-0.42,P＜0.05).结论 SLE患者外周血CD4+T细胞中miR-17、miR-20a表达上调,且miR-17、miR-20a表达水平与SLE病情活动相关.
关键词： 红斑狼疮 系统性 CD4阳性T淋巴细胞 miR-17 miR-20a -
miR-17对人包皮成纤维细胞衰老的影响
目的：探讨 miR-17对人包皮成纤维细胞（HFF）衰老的影响。方法 miR-17重组慢病毒感染细胞， qRT-PCR确定感染效率，CCK-8法观察 miR-17对细胞增殖的影响，衰老相关β-半乳糖苷酶染色观察 miR-17对细胞衰老的影响，流式细胞法检测 miR-17对细胞周期的影响，Western blotting 检测 cyclin D1和 p21蛋白的表达。结果成功分离得到 HFF，并建立了稳定表达 miR-17的 HFF-miR-17细胞系。且 HFF-miR-17细胞增殖能力明显升高，β-半乳糖苷酶染色阳性率降低；S 期细胞群比例明显增高，细胞周期蛋白 cyclin D1表达显著上调，p21蛋白明显下调。结论miR-17可通过上调 cyclin D1蛋白、下调 p21蛋白促进原代细胞的增殖，抑制原代细胞的衰老。
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miR-17对靶基因转化生长因子受体β2的负性调控表达
目的 探讨miR-17在HEK293T细胞中对转化生长因子受体β2(transforming growth factor receptor beta 2,TGFRβ2)的调控作用.方法 采用生物学信息预测软件对miRNA-17的靶基因进行预测,选定TGFRβ2为靶基因,构建pCDNA3.1+ miRNA 17重组表达载体.将HEK293T细胞分为3组,分别为对照组(无转染)、空载组(转染空质粒)和miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒),3组采用实时定量PCR检测miRNA-17和TGFRβ2mRNA表达水平,采用Western blot检测TGFRβ2蛋白表达水平.将HEK293T细胞再分为3组,分别为CTL组(转染miR-17无义寡核苷酸序列)、miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒)和ASO-miR-17组(转染miR-17反义寡核苷酸序列),采用免疫荧光法检测各组TGFRβ2荧光强度.结果 转染24 h后,空载组和miR-17组HEK293细胞处于对数生长期,细胞突起和包体均正常,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);miR-17组miR-17表达量(5.391±0.053)明显高于空载组(1.654±0.075)与对照组(1.436±0.038),TGFRβ2 mRNA和蛋白表达量(2.449±0.092、1.030±0.030)明显低于空载组(6.135±0.058、5.550±0.040)和对照组(6.862±0.074、5.090±0.030) (P＜0.05);ASO-miR-17组TGFRβ2荧光强度(1.144±0.079)明显高于CTL组(0.776±0.044)和miR-17组(0.917±0.096) (P＜0.05).结论 miR-17可负性调节靶基因TGFRβ2的表达.
关键词： miR-17 转化生长因子受体β2 HEK293T细胞 靶基因 -
强直性脊柱炎患者外周血miR-17和基质金属蛋白酶3表达及其临床意义
目的 探讨miR-17和基质金属蛋白酶3(MMP-3)在强制性脊柱炎(AS)患者血浆、外周血单个核细胞(PBMC)表达及其临床意义.方法 选取2015年1月-2017年6月AS患者60例作为研究组,同期健康体检者60例作为对照组,qRT-PCR检测血浆及PBMC中miR-17,酶联免疫吸附(ELISA)法检测MMP-3的表达.ROC曲线分析评价其对AS诊断灵敏度及特异度.结果 患者血浆、PBMC中miR-17表达水平降低,其在血浆中表达低于PBMC,两者存在正相关(r =0.736,P＜0.01);MMP-3表达水平显著升高,疾病活动期高于稳定期.miR-17、MMP-3与BASDAI、HLA-B27、CRP及ESR呈正相关(r值分别为-0.698、-0.497、-0.703、-0.662、-0.578,0.654、0.798、0.660、0.763,P＜0.01).ROC曲线分析表明miR-17及MMP-3对AS具有较高诊断灵敏度和特异度,联合检测能提高对AS的诊断能力.结论 miR-17及MMP-3在AS外周血中存在差异表达,有望成为新的临床诊断指标.
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miR-17抑制ATG7介导的自噬促进小鼠肝细胞胰岛素抵抗
目的：探讨细胞自噬在小鼠肝细胞胰岛素抵抗中的作用以及microRNA调控自噬的机制。方法通过高脂饮食诱导小鼠糖尿病模型， Western印迹检测高脂饮食组小鼠肝细胞自噬相关蛋白（ autophagy?re?lated protein 7， ATG7）的表达。生物信息学预测调控ATG7的候选microRNA。借助于双荧光素酶报告基因方法验证miR?17对ATG7的靶向调控作用。采用葡萄糖胺诱导小鼠肝原代细胞的胰岛素抵抗模型，验证miR?17调控自噬对小鼠原代肝细胞胰岛素敏感性的作用。结果高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗模型中肝细胞ATG7蛋白表达显著下调，而miR?17的表达增高。双荧光素酶报告基因检测结果显示， miR?17可以直接结合于ATG7的3′UTR靶向调控ATG7，降低其的表达。小鼠肝原代细胞胰岛素抵抗模型的结果表明，抑制内源性miR?17的水平可以上调ATG7蛋白表达，增强细胞胰岛素敏感性。结论 miR?17通过靶向调控小鼠肝细胞中自噬相关蛋白ATG7的表达，抑制细胞自噬，参与了肝细胞的胰岛素抵抗。
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长链非编码RNA PTENP1在膀胱癌发生发展中的分子机制
目的 探讨长链非编码RNA PTENP1在膀胱癌发生发展中的分子机制.方法 通过逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测PTENP1,PTEN,miR-17在膀胱癌中的基础表达并关联分析.利用Western blot检测膀胱癌细胞系T24与5637中超表达PTENP1后PTEN的表达变化.通过荧光素酶报告试验验证miR-17对PTENP1及PTEN的靶向作用.后通过在膀胱癌细胞系T24和5637中共表达miR-17和PTENP1,建立稳定共表达细胞系进行增殖和迁移实验,探索长链非编码RNA PTENP1在膀胱癌发生发展中的分子机制.结果 miR-17在膀胱癌中普遍呈现高表达趋势,PTENP1在膀胱癌中呈现普遍低表达趋势(P<0.05).与此同时miR-17和PTENP1的基础表达为负相关,PTENP1与PTEN的基础表达为正相关.WB实验发现于膀胱癌细胞系T24和5637中过表达PTENP1后可以在翻译水平增加PTEN的表达,荧光素酶报道实验验证了miR-17可同时靶向PTENP1及PTEN,在膀胱癌中miR-17具有促癌功能,同时在膀胱癌细胞中我们发现miR-17可以部分回复PTENP1的抑癌功能.结论 长链非编码RNA PTENP1在膀胱癌中发挥抑癌功能的分子机制可能是PTENP1结合miR-17作为竞争性内源RNA竞争,从而降低miR-17对抑癌基因PTEN的表达抑制.
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miR-17与冠心病患者冠状动脉病变程度、侧支循环形成及血清Ox-LDL、25(OH)D3的关系
目的 研究miR-17与冠心病患者冠状动脉病变程度、侧支循环形成及血清氧化修饰低密度脂蛋白(Ox-LDL)、25羟基维生素D3[25(OH)D3]的关系.方法 选择2014年3月至2017年10月在胜利油田胜利医院心内科确诊的157例稳定性冠心病患者作为病例组,100例健康者为对照组.根据SYNTAX评分将病例组分为冠脉病变重度组44例、中度组61例和轻度组52例,根据Rentrop将病例组分为侧支循环良好组82例,不良组75例.分别检测受试者血清miR-17、25(OH)D3、Ox-LDL水平,分析病例组血清miR-17与SYNTAX评分、Rentrop分级及Ox-LDL、25(OH)D3水平的关系.结果 病例组血清miR-17、Ox-LDL水平显著高于对照组,冠脉病变重度组和中度组显著高于轻度组,重度组显著高于中度组,冠脉侧支循环不良组显著高于良好组;病例组血清25(OH)D3水平显著低于对照组,冠脉病变重度组和中度组显著低于轻度组,重度组显著低于中度组,冠脉侧支循环不良组显著低于良好组;病例组血清miR-17与SYNTAX评分、Ox-LDL分别呈显著正相关关系(r=0.653、0.711,P=0.000、0.000),与Rentrop分级、25(OH)D3分别呈显著负相关关系(r=-0.624、-0.735,P=0.000、0.000).结论 冠心病患者血清miR-17水平显著升高,与患者冠脉病变程度、侧支循环形成及血清Ox-LDL、25(OH)D3水平密切相关,可能在冠脉病变发生发展中发挥重要作用.
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miR-17下调整合素分子β1抑制卵巢癌腹腔播散
目的：寻找调控整合素分子β1（ITGB1）的 microRNA，并验证在卵巢癌中其对 ITGB1的特异性调控作用及对卵巢癌细胞腹腔播散的影响。方法：用生物信息学网站预测特异性调控ITGB1的microRNA，比较NCI-60细胞信息库中两者之间 mRNA 水平的相关性；在多种卵巢癌细胞系中进一步验证 microRNA的表达和ITGB1蛋白水平之间的相关性；双荧光素酶报告系统验证microRNA对ITGB1特异性调控作用， Western blot 检测高低表达microRNA 后对ITGB1蛋白水平的影响；体内外黏附试验比较过表达 microRNA后对卵巢癌细胞黏附细胞外基质能力的影响。后通过免疫缺陷小鼠体内腹腔成瘤试验对比过表达此microRNA对腹腔成瘤能力的影响。结果：在NCI-60中验证生物信息学预测到得miR-17与ITGB1的mRNA表达水平显著负相关（r＝-0．567， P＜0．0001）；在卵巢癌细胞系中，高表达ITGB1的细胞系SKOV3、OV90、CaOV4和 OVCAR3的 miR-17表达水平显著低于 ITGB1低表达组（TOV21G、ES2、CaOV3、TOV112D）；双荧光素酶报告系统证明卵巢癌细胞中miR-17特异性的结合ITGB1-3′UTR区域并下调ITGB1蛋白水平；黏附试验结果表明过表达miR-17后卵巢癌细胞体内外黏附能力均下降；体内成瘤试验结果过表达miR-17后卵巢癌细胞SKOV3-GFP腹腔播散病灶较对照组显著减少。结论：卵巢癌细胞中miR-17与ITGB1水平显著负相关，过表达miR-17可以下调ITGB1进而抑制卵巢癌细胞腹腔播散。
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慢性髓细胞白血病患者骨髓单个核细胞miR-203、miR-451、miR-17表达及其临床意义
目的 分析探讨miR-203、miR-451、miR-17在慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)骨髓单个核细胞中表达水平的动态变化及在不同治疗方案后的表达差异,评价miR-203、miR-451、miR-17的表达水平在CML诊治中应用的可行性.方法 收集2011年1月至2014年1月在西南医院经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学(morphologie,immunophenotypie,cytogenetic,molecular,MICM)联合检测,由WHO造血组织和淋巴系统肿瘤分类的标准确诊为CML的患者98例及20例正常对照,采用实时定量PCR检测miR-203、miR-451、miR-17的表达水平,同步检测BCR-ABL融合基因的表达水平.结果 ①CML患者的miR-203表达水平明显低于对照组(P＜0.05),且逐步多元回归分析显示miR-203与BCR-ABL融合基因表达水平呈负相关(r=-0.934,P＜0.01);②CML患者的miR-451表达水平明显低于对照组(P＜0.05),miR-451与BCR-ABL融合基因表达水平呈负相关(r=-0.917,P＜0.01);③miR-17表达水平在CML-CP患者中上升,在CML-AP、BP患者中下调,差异有统计学意义(P＜0.05);④3种miRNA表达水平均提示传统化疗组与TKI治疗组、造血干细胞移植组有统计学差异,而TKI治疗组与造血干细胞移植组无统计学差异.结论 miR-203、miR-451、miR-17表达水平与BCR-ABL融合基因表达水平、CML疾病分期、治疗和预后评估等均有密切关系,有望成为CML新的生物学标志.
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miR-17对炎症微环境中PDLSCs骨向分化特性的影响
目的 探讨体外炎症微环境中,miR-17对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)骨向分化能力的影响.方法 体外有限稀释法克隆化和密度梯度离心法分别培养牙周膜干细胞(PDLSCs)和外周血免疫细胞(PBMCs),并建立PDLSCs与免疫细胞的Transwell共培养炎症微环境体系.使用定量PCR技术检测miR-17的表达,并将PDLSCs转染miR-17模拟物Mimics和抑制剂Inhibitor后进行成骨诱导,ALP染色,定量PCR和Western Blot检测细胞成骨分化的能力.结果 共培养组PDLSCs中miR-17表达降低,转染Mimics后共培养细胞成骨分化能力升高,转染Inhibitor后细胞成骨分化能力降低.结论 炎症微环境中miR-17可以促进PDLSCs骨向分化.
