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靶向融合肽TAT-OSBP-MKK6(E)对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用
目的:探讨靶向融合肽{转录反式激活因子(trans-activator of transcription,TAT)-卵巢癌特异性结合肽(ovarian cancer specific binding peptide,OSBP)-丝裂原活化蛋白激酶激酶6突变体(E) [mitogen-activated protein kinase kinase 6 mutant (E),MKK6 (E)]]对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其可能的机制.方法:建立卵巢癌HO8910细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,分为实验组[给予TAT-OSBP-MKK6 (E)腹腔注射]、阴性对照组(给予TAT-OSBP腹腔注射)和空白对照组(给予0.9％ NaC1溶液腹腔注射),比较3组裸鼠移植瘤的生长速度、体积和裸鼠体质量;TUNEL法、免疫组织化学法和蛋白质印迹法分别检测移植瘤组织中细胞的凋亡情况、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达以及p38蛋白的表达.结果:实验组裸鼠移植瘤的生长速度滞后于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05),实验组裸鼠移植瘤体积和裸鼠体质量小于阴性对照组和空白对照组(P均＜ 0.05);而阴性对照组与空白对照组之间的差异无统计学意义(P＞0.05).实验组肿瘤细胞的凋亡指数(apoptosis index,AI)高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05),实验组肿瘤组织中PCNA的阳性表达率低于阴性对照组和空白对照组,而p38蛋白的表达水平则相反(P均＜0.05);阴性对照组与空白对照组的AI、PCNA阳性表达率及p38蛋白的表达水平之间的差异均无统计学意义(P均＞ 0.05).结论:靶向融合肽TAT-OSBP-MKK6 (E)可抑制卵巢癌裸鼠移植瘤的生长和PCNA的表达,其机制可能与促进细胞凋亡有关.
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PTD-OD-HA融合蛋白对bcr/abl阳性细胞凋亡的影响
目的:研究含有蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)、寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)和HA标签的PTD-OD-HA融合蛋白对几种bcr/abl阳性细胞株细胞凋亡的影响.方法:将前期制备的PTD-OD-HA蛋白作用于几种bcr/abl阳性细胞后,应用FCM法、DNA 梯度电泳(DNA ladder)和透射电子显微镜检测细胞凋亡,RT-PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因bax、bcl-2的mRNA和蛋白水平变化.结果:FCM法检测发现,PTD-OD-HA能促进bcr/abl阳性细胞发生凋亡;DNA ladder实验检测发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210和K562细胞DNA电泳有梯状条带;透射电子显微镜观察发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210细胞发生了凋亡;RT-PCR及Western印迹法检测显示,促凋亡基因bax的mRNA及蛋白水平增高,抗凋亡基因bcl-2的mRNA及蛋白水平降低.结论:PTD-OD-HA蛋白可以特异性诱发bcr/abl阳性细胞的凋亡.
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具有缺氧反应性的Notch信号抑制蛋白调节鼠结肠癌细胞的体内生长
目的:研究缺氧细胞中的Notch信号对小鼠结肠癌细胞体内生长的影响.方法:将缺氧诱导因子 (hypoxia-inducible factor,HIF)- 1α中的氧依赖性蛋白降解结构域(oxygen-dependent degradation domain,ODD)、抑制Notch信号的mastermind样(mastermind-like,MAML)突变体蛋白1和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)重组构建融合蛋白表达载体.通过在免疫荧光显微镜下观察荧光强度,应用Western 印迹和实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测融合蛋白对缺氧的反应性和抑制Notch信号的能力.通过失巢凋亡实验和小鼠体内肿瘤形成实验,观察融合蛋白DNMAML1-ODD-GFP(DOG)对CT26结肠癌细胞体外失巢凋亡和小鼠体内肿瘤生长的影响.结果:DOG融合蛋白在细胞中的稳定表达依赖于缺氧条件,该融合蛋白能够靶向抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号靶基因Hes1 mRNA的表达(P<0.01).体外失巢凋亡实验表明,DOG融合蛋白可显著促进缺氧CT26细胞的失巢凋亡(P<0.01).小鼠体内成瘤实验显示,DOG融合蛋白的表达可抑制结肠癌细胞CT26在小鼠体内的生长(P<0.01).结论:成功构建了靶向阻断缺氧细胞中Notch信号的融合蛋白表达载体.缺氧结肠癌细胞中的Notch信号对于肿瘤生长起重要作用.
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人源重组ICOSIg对鼠不成熟树突状细胞的生物学作用
目的 分析人源可诱导共刺激分子(ICOS)可溶性融合蛋白(ICOSIg)与鼠源不成熟树突状细胞(DCs)是否发生特异性结合及其一般生物学特性.方法 通过流式细胞术结合特异性抗体检测了解ICOSIg与不成熟DCs的结合作用;以Annexin V/PI双染色、活细胞染料CSFE和CCK-8研究ICOSlg对DCs的细胞毒性作用；以[3H]掺入法研究ICOSIg对于混合淋巴细胞反应的阻断作用.结果 ICOSIg可结合小鼠DCs表面的ICOSL,ICOSIg不引起DCs早期和晚期凋亡,不影响DCs细胞的增殖,可以抑制不同基因小鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应.结论 本实验室构建的体外表达的ICOSIg具有较强的生物学活性,对鼠DCs无明显的生物学毒性作用,首次从实验角度证实人源ICOSIg可以特异性结合小鼠不成熟DCs表面配体ICOSL,可以用于进一步探讨ICOSL/ICOS共刺激通路的免疫作用.
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人Oct4与细胞穿膜肽融合蛋白的表达
目的 通过原核表达获得人Oct4(hOct4)与细胞穿膜肽融合蛋白,优化其表达方法并观察其穿膜效果.方法 通过基因工程手段构建了pET原核表达载体,利用BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)蛋白表达菌表达蛋白.Ni亲和纯化方法纯化蛋白,蛋白质印迹分析检测融合蛋白组成.将融合蛋白用罗丹明染色后加入人正常皮肤成纤维细胞株BJ观察其穿膜进入细胞情况.结果 构建了pET21a(+)-hOct4-11R-His和pET21a(+)-EGFP-11R-His表达载体,转入大肠杆菌中后诱导获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,经蛋白质印迹分析检测表明融合蛋白正确.经BJ细胞测试,观察到融合蛋白进入细胞中.结论 成功获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,且融合蛋白能够高效进入BJ细胞并聚集于细胞核周围.
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铁蛋白轻链的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备
目的:构建FTL的原核表达载体,获得FTL纯化蛋白,制备抗体,为研究其生物学作用奠定基础.方法:采用基因重组技术将PCR扩增的FTL基因产物与原核表达载体pET30a(+)连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果,用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫日本大白兔,制备FTL多抗,采用Western印迹法检验抗体特异性.结果:成功地构建了FTL的原核表达载体,经大肠杆菌中诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到较纯的相对分子质量约25 800的融合蛋白,免疫日本大白兔后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与FTL蛋白特异性结合.结论:本研究获得FTL纯化蛋白,制备了FTL多克隆抗体,为进一步研究FTL的作用机制及其在肺癌组织中的表达情况奠定了基础.
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插入甘氨酸对HIV Tat-胸苷激酶融合蛋白生物学活性的影响
目的:探讨插入甘氨酸(Gly)对HIV Tat-TK融合蛋白功能的影响.方法:利用基因重叠(gene splicing by overlap extension, gene SOEing)PCR技术,将不同长度的甘氨酸密码子(0、2、4、6个)插入HIV Tat-TK融合基因,经转染、鉴定证实后诱导表达,并经偶联Tat单克隆抗体的Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化.4种HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白(n=0、2、4、6)、HIV Tat蛋白、TK蛋白(1 μg/ml)分别与HepG2细胞在普通培养基共培养24 h后,间接免疫荧光检测各自透过细胞膜效率;在加入更昔洛韦的培养基培养3 d后,锥虫蓝染色计算细胞死亡率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:精确克隆出HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合基因,成功表达HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白以及HIV Tat和TK蛋白.HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白与HIV Tat蛋白透过细胞膜的效率相似,但单独TK蛋白无法进入细胞;在含有更昔洛韦的培养基中HIV Tat-(Gly)4-TK融合蛋白致HepG2细胞凋亡率高(14.77%),其余依次为HIV Tat-(Gly)2-TK融合蛋白(12.69%)、HIV Tat-TK(8.31%)、HIV Tat-(Gly)6-TK(4.36%)和HIV Tat 组(1.03%),组间均有显著性差异(P<0.05);细胞死亡率也发现类似的结果(分别为80.2%、65.4%、58.4%、56.7%、9.1%,组间有显著差异,P<0.05).结论:插入2、4、6个甘氨酸对HIV Tat-TK融合蛋白上游Tat蛋白的细胞融合穿透功能不产生影响,而对融合蛋白下游TK蛋白介导的更昔洛韦的细胞毒作用干扰较大,其中插入4个甘氨酸对TK蛋白介导的更昔洛韦的细胞毒作用影响小.
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重组人单核细胞趋化蛋白-1在大肠杆菌中表达的优化
目的:优化重组人单核细胞趋化蛋白-1(rhuMCP-1)在大肠杆菌DE3中的表达,生产rhuMCP-1.方法:应用NBS 15 L T.DR发酵罐,研究了诱导时不同的pH值、温度、搅拌速率、通气量和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度对表达的影响,并利用正交设计对发酵条件进行优化.结果:正交试验表明溶氧条件对rhuMCP-1表达水平的影响较显著,其中搅拌速率和通气量为大的影响因素,搅拌速率为300 r/min和通气量10 L/min时,表达水平高,重组蛋白的含量可达40%以上.结论:本实验为该工程菌的中试提供了佳的表达诱导条件,对大规模工业生产具有重要的指导意义.
关键词： 单核细胞趋化蛋白-1 重组融合蛋白质类 大肠杆菌 正交设计试验 基因表达 -
重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗银屑病及其对白细胞介素17A和肿瘤坏死因子α的影响
目的 探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc,商品名益赛普)联合甲氨蝶呤对中重度斑块型银屑病患者血清和单个核细胞中白细胞介素(IL) 17A和肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响.方法 2014年8月至2016年2月同济大学附属第十人民医院皮肤科门诊收治的30例中重度斑块型银屑病患者,分为益赛普组(15例)和益赛普+甲氨蝶呤组(15例),疗程24周.采用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时定量PCR法检测两组患者治疗前后血清和外周血单个核细胞的IL-17A和TNF-α的浓度和mRNA表达水平.结果 治疗前益赛普+甲氨蝶呤组和益赛普组患者,血清IL-17A,TNF-α水平以及外周血PBMC中IL-17A,TNF-α mRNA的表达均显著高于健康对照组(P＜0.05);治疗后,益赛普+甲氨蝶呤组血清IL-17A、TNF-α浓度(142.67±14.82,70.07±25.02)及外周血PBMC中IL-17A、TNF-α mRNA表达(1.12±0.33,2.50±1.04)与益赛普组血清IL-17A、TNF-oα浓度(163.54±23.18,91.98±14.62)及外周血PBMC中IL-17A、TNF-α mRNA的表达(1.56±0.77,3.61±2.14)比较显著下降(P＜0.05).结论 益赛普联合甲氨喋呤治疗银屑病疗效优于单用益赛普治疗,联合治疗可以缩短治疗时间,提高疗效,其作用机制可能与下调IL-17A、TNF-α的表达量有关.
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C型凝集素受体Langerin的细胞表达模型构建及功能研究
目的 构建朗格汉斯细胞特异性C型凝集素受体Langerin体外细胞表达模型.方法 PCR方法获得Langerin分子的cDNA,克隆入真核绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-C1(EGFP位于Langerin的N末端),转染人肾胚细胞癌HEK 293T细胞后,激光共聚焦显微镜检测EGFP-Langerin融合蛋白的细胞表达情况,流式细胞仪检测Langerin受体的表达,并进一步检测转染表达的Langerin受体对尘螨抗原(nDerp 2)的识别和内吞情况.结果 构建的荧光融合蛋白重组表达质粒转染HEK 293T细胞后,经PCR及Western印迹检测证明Langerin转染及表达成功.重组表达质粒转染HEK293T细胞后,经流式细胞仪检测转染Langerin融合质粒的HEK293T细胞的Langerin受体表达率较转染前增多约43％,经激光共聚焦显微镜检测显示绿色荧光标记的Langerin成功表达,并可与红色荧光素标记的尘螨抗原(nDerp 2)结合,将nDer p 2内吞入细胞内.结论 构建的EGFP-Langerin融合蛋白在HEK293T细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布,具有结合、内吞过敏原功能.
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C型凝集素受体树突细胞特异性捕获细胞间黏附分子3非整合素细胞表达模型的构建及功能研究
目的 构建C型凝集素受体树突细胞特异性捕获细胞间黏附分子3非整合素(DC-SIGN)细胞表达模型,为后续进行DC-SIGN蛋白受体功能研究提供基础.方法 PCR扩增获得DC-SIGN分子的cDNA,克隆入真核表达载体p巨细胞病毒启动子-绿色荧光蛋白重组质粒(PCMV-EGFP),EGFP位于DC-SIGN N末端,转染人胚肾细胞癌HEK 293T细胞后,流式细胞仪检测DC-SIGN重组分子的表达,激光共聚焦显微镜检测DC-SIGN-EGFP融合蛋白的细胞定位情况,并进一步检测转染表达的DC-SIGN受体对过敏原抗原的识别和内吞过程.结果 构建的荧光融合蛋白重组表达质粒,经PCR及Western印迹证明DC-SIGN表达成功;经流式细胞仪检测转染DC-SIGN融合质粒的HEK293T细胞的DC-SIGN受体表达量增多(约50％).重组表达质粒转染293T细胞后,激光共聚焦显微镜检测显示,绿色荧光标记的DC-SIGN位于细胞膜上,可结合红色荧光素标记的过敏原抗原Derp2,并可将Derp2内吞入细胞内.结论 构建的DC-SIGN-EGFP融合蛋白在293T细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布,可被DC-SIGN特异性抗体识别并具有摄取过敏原功能,是研究DC-SIGN分子功能的理想细胞模型.
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D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的克隆、表达、鉴定及其免疫原性初探
目的 获得D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3基因及其蛋白,并鉴定其免疫原性.方法 PCR扩增目的基因,将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中,连接产物转化入大肠埃希菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定.再将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21并诱导表达,Western印迹鉴定目的蛋白,谷胱甘肽巯基转移酶(GST)磁珠纯化pgp3-GST融合蛋白.用纯化后的蛋白免疫新西兰家兔,Western印迹检测抗体与pgp3蛋白的结合,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价.结果 克隆目的基因序列长度为795 bp,与基因库中一致,Western印迹显示目的蛋白相对分子质量为54 000,并得到纯化蛋白.所得兔血清可识别pgp3蛋白,ELISA检测多克隆抗体效价达1∶25 600.结论 成功表达具有强免疫原性的pgp3-GST融合蛋白,为进一步研究奠定基础.
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沙眼衣原体热休克蛋白60基因的克隆和表达
目的 探讨克隆和表达沙眼衣原体热休克蛋白60(hsp60)基因.方法 PCR分离扩增hsp60的基因片段,纯化后双酶切,克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组表达载体pET-28a-hsp60.PCR、双酶切及测序鉴定.转染大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western印迹检测.结果 PCR与双酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆hsp60基因,测序结果与基因库公布的一致.SDS-PAGE检测表达产物.在相对分子量60 000处有表达条带.Western印迹鉴定是表达目的蛋白.纯化后纯度达90%以上,产量为17.85 mg/L.结论 构建pET-28a-hsp60重组体并成功表达可溶性hsp60蛋白.
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淋病奈瑟菌外膜Porin I蛋白基因的构建、表达和鉴定
目的构建、克隆淋病奈瑟菌外膜PorinI(PI)蛋白基因,并进行表达、纯化和鉴定.方法用PCR法克隆淋病奈瑟菌外膜PI蛋白基因,再与pGEX-4T-2载体连接成表达重组体pGEX-4T-2/PI;经大肠杆菌P2392表达后,用SDS-PAGE、切胶、电洗脱回收等方法纯化GST-PI融合蛋白;然后用特异性淋球菌外膜PI蛋白的单克隆抗体进行斑点免疫层析试验鉴定该蛋白.结果成功地获取了pGEX-4T-2/PI表达重组体,经诱导表达后能获得高表达的GST-PI融合蛋白,其相对分子质量为60000;斑点免疫层析试验显示其为淋病奈瑟菌外膜PI蛋白特异性的.结论本研究将有利于进一步研究淋病奈瑟菌外膜PI蛋白的功能.
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沙眼衣原体热休克蛋白60抗原基因的克隆和表达
目的对沙眼衣原体热休克蛋白60(Chsp60)进行表达和纯化,以获得高纯度的蛋白抗原.方法应用PCR扩增技术分离Chsp60的基因全长,采用基因工程的方法,应用融合表达载体重组、克隆得到Chsp60特异抗原基因的重组菌株,经诱导表达获得重组融合蛋白,并经亲和层析获得纯品.结果得到了热休克蛋白60重组克隆菌株,成功地诱导表达并纯化了相对分子质量为87000的融合蛋白,纯度达90%以上,产量为2.5mg/L.结论获得的相对分子质量为60000的特异性抗原可用于检测衣原体感染患者血清中的抗体,有助于探讨Chsp60在免疫发病中的作用.
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抗癌胚抗原单链抗体与核心链霉亲和素融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的预定位显像
目的研究153Sm-生物素和抗癌胚抗原单链抗体与核心链霉亲和素融合蛋白(CEA ScFv-core-streptavidin)在荷人结直肠癌裸鼠体内的两步法预定位显像和体内分布.方法对23只荷人结直肠癌裸鼠腹腔注射CEA ScFv-core-streptavidin进行预定位,24 h后腹腔注射153Sm-生物素,其中20只于1、4、8和24 h进行体内分布研究,余3只于8和24 h进行定位显像.结果在荷人结直肠癌裸鼠腹腔注射CEA ScFv-core-streptavidin预定位后24 h,注射153Sm-生物素后1 h,肿瘤/血比值为0.49,4和8 h达1.21和1.56,24 h达高,为3.09.裸鼠定位显像示,8 h肿瘤部位放射性明显浓聚,24 h本底明显降低,肿瘤呈放射性"热"区.结论 153Sm-生物素和CEA ScFv-core-streptavidin 预定位显像能提高靶/非靶比值,缩短显像时间,改善图像质量.
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新型融合蛋白hIFNα1-CB表达载体的构建
目的:构建人干扰素α1(hIFNα1)和抗菌肽B(CB)的融合蛋白表达质粒.方法:将人工改造后的hIFNα1基因与CB基因按正确的阅读框架融合,并定向克隆至大肠杆菌表达载体pBV220.结果:经PCR检测及质粒的限制性分析,所挑选的Amp抗性菌落均含有插入了hIFNα1-CB融合基因的重组质粒pHC.结论:以pBV220为载体,成功构建了hIFNα1-CB融合蛋白表达质粒pHC.
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融合蛋白质在微生物疫苗制备中的研究进展
融合蛋白质是利用重组DNA技术将两个或两个以上不同基因的编码序列克隆在一起,表达出一个单一的多肽.这种新型的融合蛋白质在蛋白质工程中,特别是在疫苗的研究和开发上发挥了重要的作用.本文就融合蛋白质在微生物疫苗制备中的研究进展进行综述.
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Retronectin和CD3mAb联合培养CD56+细胞用于治疗胰腺癌的研究
目的 探讨CD56+细胞体外富集培养的扩增效率和对JF305胰腺癌细胞系的杀伤效果,评价这种MHC非限制性杀伤效应细胞作为新型过继免疫治疗细胞的应用价值.方法 通过CD56磁珠富集系统分离出外周血中CD56+细胞,分别验证CD3mAb和Retronectin对细胞增殖作用的影响,并通过流式细胞技术检测细胞的CD3、CD16和CD56表达情况,MTS法检测体外杀伤胰腺癌细胞JF-305的效果.结果 磁珠系统能够有效的富集CD56+细胞,CD3mAb和Retronectin联合应用可使细胞的增殖倍数明显提高,且培养后细胞对于JF-305具有较强的杀伤活性.结论 CD3mAb和Retronectin联合培养CD56+细胞的方法能够提高细胞的增殖效率和杀伤活性,具有良好的临床细胞治疗应用前景.
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CCL21-CD40L融合蛋白的肿瘤免疫实验研究
目的:探讨CCL21-exCD40L融合基因的抗肿瘤作用.方法:构建CCL21-exCD40L真核表达载体,Western blot法检测CCL21-exCD40L融合蛋白的表达,Transwell法检测CCL21-exCD40L融合基因趋化活性,体外转染CCL21-exCD40L融合基因,观察其在小鼠结肠癌肿瘤模型中的抗肿瘤作用.结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1+/CCL21-exCD40L,Transwell法验证融合蛋白对树突细胞具有较强趋化功能,其每高倍镜视野穿膜细胞数是空载体对照组的14.95倍.将融合基因原位转染肿瘤局部,荷瘤小鼠全部存活,肿瘤体积缩小.结论:CCL21-exCD40L融合基因能通过真核细胞正常表达,CCL21-exCD40L融合蛋白能够趋化树突细胞,在体内发挥抗肿瘤作用.
