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甲氨蝶呤联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗严重未分化脊柱关节病的短期疗效观察
目的 探索甲氨蝶呤联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白etanercept治疗严重未分化眷柱关节病的临床疗效和安全性.方法 60例确诊为严重活动性未分化脊柱关节病的患者随机分为两组,30例作为对照组接受甲氨堞呤(10mg,口服每周1次)联合柳氮磺吡啶(1.0,1日2次)治疗,30例接受甲氨蝶呤(10mg,口服每周1次)联合etanercept(25 mg,皮下注射,每周2次)治疗.观察12周末患者的临床症状改善情况及药物不良反应.结果 治疗12周末甲氨蝶呤联合etanercept治疗的患者较对照组在疼痛程度、外周关节肿胀数、BASDAI、BASFI以及CRP、ESR等临床指标上有明显改善,差异有统计学意义(P<0.05).两组在达到BASDAI改善大于20%的患者数上差异无统计学意义(P>0.05);但etanercept组达到BASDAI改善大于50%及70%的患者数远远多于对照组(P<0.05).etanercept组有1/3(10名)患者在停用etanercept后(平均4.2周)病情复发.两组总的药物不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05).结论 甲氨蝶呤联合etanercept治疗严重未分化脊柱关节病的短期疗效可能优于甲氨堞呤联合柳氮磺吡啶治疗,且不良反应不增加,耐受性好.
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肿瘤坏死因子受体-IgG1Fc段融合蛋白对脂多糖致大鼠急性肾损伤的保护作用
目的 探讨重组人肿瘤坏死因子受体-IgG1Fc段融合蛋白(rhuTNFR:Fc)对脂多糖(LPS)致大鼠急性肾损伤的保护作用及机制.方法 采用静脉注射LPS建立大鼠急性肾损伤模型.Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、rhuTNFR:Fc组、LPS组和rhuTNFR:Fe+LPS组.监测各组大鼠平均动脉压(MAP)变化情况,血液尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)水平,观察肾组织病理学改变,同时检测血清TNF-α含量及其生物活性,并测定肾组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)活性.结果 rhuTNFR:Fc预处理能显著降低TNF-αf.生物活性,改善肾功能,减轻LPS所致病理损伤及MPO活力的增高,但对组织MDA含量及SOD活力无明显影响.结论 rhuTNFR:Fc预处理可以部分减轻LPS引起的大鼠急性肾损伤.
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结核菌抗原基因Rv3881c在大肠杆菌中的高效表达分析
目的:从结核分枝杆菌基因组克隆Rv3881c基因并重组入pET24b载体,在大肠杆菌中进行融合表达,重组蛋白经纯化后通过Western blot分析初步鉴定其抗原性和特异性.方法:提取H37Rv标准株的基因组DNA,以基因组DNA为模板PCR扩增出Rv3881c基因,连接到pGEMT上,经过筛选鉴定后,将重组子测序;将测序正确的基因双酶切后连接到pET24b载体上,筛选得到重组载体pET24b-48;在BL21菌株中优化表达并采用金属鍪合层析方法纯化蛋白;选取6例结核病阳性临床血清标本和6例健康人血清标本进行Western blot分析.结果:发现从保存的H37Rv菌株克隆得到了读码框完全正确的Rv3881c基因,它在大肠杆菌中可以高效表达,表达量约占细菌总蛋白的20%以上.重组蛋白不与健康人血清反应,可与结核标本血清有较强的免疫印迹反应.结论:重组Rv3881c具有较好的特异性,该抗原有潜力成为检测结核的有效抗原组分之一.
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包涵体复性的研究进展
大肠杆菌表达的外源基因产物通常是不可溶的包涵体.包涵体需要经过溶解和复性才能得到有活性的蛋白质.复性是蛋白质从未折叠到折叠形式的过程,受到许多因素的影响,包括变性剂对包涵体的溶解度、变性剂的去除、一些小分子对复性的帮助等等.现就影响蛋白复性的相关因素进行阐述.
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高糖对HSkMCs细胞株AT1R、mfn2mRNA表达的影响
目的 探讨骨骼肌局部肾素血管紧张素系统(RAS)在高糖状态的变化及对线粒体融合蛋白2(mfn2)基因表达的影响.方法 体外培养人骨骼肌细胞(HSkMC),分为不同浓度葡萄糖组进行培养:5.55 mmol/L组,11.1 mmol/L组,22.2 mmol/L组,分别培养48 h,应用RT-PCR检测各组的血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)、mfn2基因表达.结果 以5.55 mmol/L组作为基础对照组,11.1 mmol/L组、22.2 mmol/L组AT1R mRNA表达均较对照组增加(P<0.05),而mfn2基因表达则下降(P<0.05).结论 高糖能诱导骨骼肌细胞AT1R mRNA表达上调,mfn2 mRNA表达下调,且呈剂量依耐性.
关键词： 肾素-血管紧张素系统 胰岛素抗药性 重组融合蛋白质类 -
Fcγ-Der f2载体构建及融合蛋白表达
目的 构建人IgG Fcγ1片段Fcγ与粉尘螨Ⅱ类抗原Der f2嵌合基因真核表达载体pDisplay-Fcγ-Der f2,并转染入HEK293T细胞系瞬时表达,获得Fcγ-Der f2融合蛋白.方法 以pMD19-T-Der f2载体为模板,设计引物并加入linker序列,经PCR扩增得到linker-Der f2 DNA片段.经限制性内切酶酶切后,先后将人Fcγ及linker-Der f2基因片段接入pDisplay真核表达载体.用Attractene转染试剂将其转染至HEK293T细胞使之表达融合蛋白.免疫荧光检测转染后72 h的HEK293T细胞并裂解细胞进行Western Blot检测.结果 pDisplay-Fcγ-Der f2质粒经双酶切鉴定及DNA测序鉴定证实序列完全正确,真核表达载体构建成功.免疫荧光鉴定转染细胞可见明显红色荧光.Western Blot检测证明融合蛋白相对分子质为40×10~3,与理论预期值相符合,并证明了Fcγ与Der f2双功能特性.结论 构建的融合蛋白Fcγ-Der f2符合目的要求.
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融合蛋白胸腺素α1-干扰素α抗乙型肝炎病毒活性的实验研究
目的观察融合蛋白胸腺素α1-干扰素α(TA1-IFN)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)作用,并与胸腺素α1、干扰素α两者联合(TA1+IFN)应用的体外抗HBV作用进行比较. 方法 HepG2 2.2.15细胞接种后24h,换用含5种不同浓度(8000、4000、2000、1000、500U/ml)药物的培养基,37℃、体积分数5% CO2条件下培养,每3d换用原浓度含药培养液1次,并于第6天收集培养液,用Abbott诊断试剂盒,分别检测不同组药物作用后上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的含量,并计算其抑制率;同时用四甲基偶氮唑盐比色分析法检测不同组药物对HepG2 2.2.15细胞的细胞毒性作用. 结果 TA1-IFN体外对HBsAg、HBeAg的抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系,并且在药物浓度达8000U/ml后趋于稳定,此时TA1-IFN对HBsAg、HBeAg抑制率分别为72.2%±0.8%、60.4%±1.1%,细胞存活率为85.2%±2.0%;而相应浓度的TA1+IFN对HBsAg、HBeAg抑制率为40.0%±0.7%、34.5%±3.2%,细胞存活率为70.0%±1.9%,两者HBsAg、HBeAg抑制率及细胞存活率比较差异均有统计学意义 (P值均<0.05). 结论融合蛋白TA1-IFN体外具有良好的抗HBV作用,其体外抗HBV活性比TA1+IFN联合应用强,且细胞毒性比TA1+IFN联合应用时小,本实验为融合蛋白TA1-IFN的临床研究提供了重要的理论依据,同时为乙型肝炎的治疗带来了新的希望.
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rhTNFR-Fc治疗幼年特发性关节炎的临床观察
目的 探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)治疗幼年特发性关节炎(JIA)的临床疗效与安全性.方法 选取该院JIA患者18例,随机分为治疗组8例和对照组10例,治疗组采用rhTNFR-Fc治疗,对照组采用常规治疗.观察两组患者治疗效果,以及红细胞沉降率和C反应蛋白(CRP)水平.结果 治疗组起效迅速,治疗后第l、2、4、8周疗效优于对照组(P<0.05).结论 rhTNFR-Fc治疗JIA短期疗效非常明显,安全性高.
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重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白治疗类风湿关节炎疗效分析
目的 观察不同剂量重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗类风湿关节炎(RA)患者的疗效,了解不同剂量、不同用法之间的优劣,为临床用药提供依据.方法 将60例RA患者根据治疗方案平均分为3组(低、中、高剂量组):低剂量组每次rhTNFR:Fc 25.0 mg,2次/周;中剂量组每次 rhTNFR:Fc 37.5 mg,1次/周;高剂量组每次rhTNFR:Fc 50.0 mg,1次/周,3组患者均每周用甲胺蝶呤(MTX)10 mg.所有患者均于治疗前后不同时间点(0、4、8、12周)进行相关检查,包括疾病活动度量表-28(DAS28)、视觉模拟量表(VAS)评分,红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸抗体(CCP)检测,并观察治疗前后3组患者关节功能相关指标变化情况评价疗效.结果 治疗前后3组患者关节功能相关指标检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.01);治疗不同时间患者关节功能相关指标检测结果比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 选用rhTNFR:Fc治疗RA能有效改善患者症状和体征,但应根据实际临床情况、治疗目标、治疗成本选用剂量和治疗周期.
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细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究
目的 构建表达细胞穿透肽融合蛋白第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)-VP22的真核表达质粒,在食管癌细胞Eca109细胞中验证细胞穿透肽VP22能否增强抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用.方法 通过本实验室前期构建成功的重组真核表达质粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22和pcDNA3-VP22,转染至Eca109细胞,以pcDNA3空质粒转染作为阴性对照,细胞免疫荧光法检测各组PTEN蛋白表达情况,Western blot法检测各组PTEN蛋白和免抗磷酸化-Akt(p-Akt)蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术测细胞凋亡率.结果 与pcDNA3相比,pcDNA3-PTEN、pcD-NA3-PTEN-VP22都能抑制Eca109细胞增殖(P＜0.05),促进Eca109细胞凋亡(P＜0.05);pcDNA3-PTEN-VP22抗肿瘤活性显著高于pcDNA3-PTEN(P＜0.05),pcDNA3-PTEN-VP22的p-Akt表达显著低于pcDNA3-PTEN(P＜0.05).结论 细胞穿透肽VP22能增强抑癌蛋白PTEN对Eca109细胞体外抗肿瘤活性,其机制可能与其下调p-Akt表达水平有关.
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MAP2K6-FP和紫杉醇对上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用
目的:研究靶向融合肽MAP2K6-FP(mitogen-activated protein kinase kinase 6-fusion protein)、紫杉醇单独和两者联合对上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用.方法:建立卵巢癌HO8910细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,分为空白对照组(予生理盐水5 ml/kg腹腔注射治疗)、MAP2K6-FP组(予0.25 mg/kg MAP2K6-FP腹腔注射治疗)、紫杉醇组(予15 mg/kg紫杉醇腹腔注射治疗)、联合用药组(予0.25 mg/kg MAP2K6-FP+15 mg/kg紫杉醇腹腔注射治疗),比较4组裸鼠的移植瘤生长速度、体积、裸鼠体质量;TUNEL法、免疫组织化学法和蛋白印迹法分别检测移植瘤中细胞凋亡情况、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达以及Bcl-2、Beclin 1蛋白的表达.结果:联合用药组裸鼠移植瘤体积(90 mm3),小于MAP2K6-FP组(324 mm3)、紫杉醇组(215 mm3)和空白对照组(804 mm3)(P<0.05).联合用药组肿瘤细胞的凋亡指数(apoptosis index,AI)(28.88±2.03)％,高于MAP2K6-FP组(14.36±0.56)％、紫杉醇组(15.78±0.87)％以及空白对照组(4.78±0.87)％(P<0.05).联合用药组VEGF蛋白表达水平(0.14±0.06),低于MAP2K6-FP组(0.32±0.10)、紫杉醇组(0.29±0.08)及空白对照组(0.78±0.14)(P<0.01);联合用药组PCNA表达水平(18.4％),低于MAP2K6-FP组(32.3％)、紫杉醇组(29.8％)及空白对照组(81.4％)(P<0.05).联合用药组Beclin 1/Bcl-2比例较单一用药组高(P<0.05).结论:MAP2K6-FP联合紫杉醇能够显著抑制卵巢癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与促进细胞凋亡有关.
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TAT/LMP-3融合蛋白的制备及其诱导成骨活性的初步研究
目的:表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT/LMP-3,观察融合蛋白TAT/LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能.方法:采用基因工程技术构建原核表达载体pET43.1a-TAT/LMP-3和pET43.1 a-LMP-3并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-NTA树脂亲和层析柱纯化后进行初步鉴定,同时制备重组蛋白LMP-3的多克隆抗体.将融合蛋白与人骨髓间充质干细胞共孵育,Western Blot技术分析融合蛋白的入胞效应,检测成骨细胞标志性基因表达以分析重组蛋白对人骨髓间充质十细胞成骨分化的影响.结果:成功地构建了pET43.1a-TAT-LMP-3融合基因原核表达载体,获得了TAT/LMP-3的可溶性表达,纯化后融合蛋白TAT/LMP-3纯度大于90%.成功制备了TAT/LMP-3的兔源性多克隆抗体.Western Blot分析证实TAT-LMP-3融合蛋白能以浓度和时间依赖性的方式转导进入人骨髓间充质干细胞,同时,TAT/LMP-3能成功诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化.结论:成功进行了TAT/LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定,构建的TAT/LMP-3融合蛋白具有入胞转导能力同时保持了骨诱导活性,为其在脊柱融合的进一步应用奠定了实验基础.
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重组猪生长抑素的基因克隆、表达与纯化
目的:在大肠杆菌中克隆表达猪重组生长抑素基因,并进行纯化和鉴定.方法:根据GenBank公布的猪生长抑素基因序列,按照大肠杆菌偏爱密码子设计并合成2条DNA单链,退火后获得猪生长抑素基因序列.克隆至原核表达载体pGEX-4T-1质粒中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白并用GST亲和柱对其进行纯化.结果:重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定证明基因完全正确,经IPTG诱导后在大肠杆菌DH5α中得到高水平表达,表达产物经超声和溶菌酶破碎和Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化获得重组蛋白.结论:猪牛长抑素基因得到了高水平表达,纯化后纯度达到95%以上,为表达产物的大量制备、重组疫苗的进一步优化及在畜牧业生产上的应用研究奠定了基础.
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融合蛋白HSP70-EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用
目的:研究树突状细胞(DCs)对热休克蛋白70(HSP70)融合蛋白的内化作用.方法:首先原核表达并分离纯化HSP70和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白HSP70-EGFP.实验中所用DCs来源于人外周血.内化实验分3组进行:将1,2组DCs分别与融合蛋白HSP70-EGFP和蛋白EGFP孵育30 min;第3组先将DCs与HSP70孵育30 min,再与HSP70-EGFP孵育30 min.之后将3组DCs转至37 ℃孵箱内,培养0.5,1,2和24 h,应用流式细胞仪检测含HSP70-EG-FP或EGFP的DCs数量.应用IL-12 Eli-spot法检测HSP70-EGFP等抗原促进DCs分泌IL-12的效果.结果:①成功获得了重组蛋白HSP70-EGFP,Mr约为97 000,HSP70-EGFP表达量占总蛋白的35.7%.纯化后的融合蛋白HSP70-EGFP溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光.②流式细胞仪检测结果显示在37 ℃孵育0.5 h后,HSP70-EGFP孵育的DCs组阳性率为63.3%,其余两组为阴性.在37 ℃孵育1,2和24 h后,3组阳性率均大于80.0%.IL-12 Eli-spot检测结果显示,在刺激DCs活化及分泌IL-12的水平上,HSP70-EGFP与脂多糖(LPS)之间的差别无统计学意义(P＞0.05),而HSP70-EG-FP的活化DCs能力明显高于EGFP(P=0.001).结论:①受体介导的吞噬作用在DCs内化HSP70-EGFP的初始阶段起主要作用,随孵育时间的延续,吞饮作用占主要地位.②HSP70-EGFP可促进DCs分泌特征性细胞因子IL-12.
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TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性
目的:构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果:成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29 ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论:通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.
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重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定
目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力
目的: 研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力.方法: 采用皮下包埋的方法,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠3次,每次间隔2 wk,用MTB培养上清滤液蛋白(culture filtrate proteins, CFP)作为抗原,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答,后一次免疫完成后4 wk,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞,体外用抗原刺激,MTT法检测淋巴细胞刺激反应,ELISA检测悬液中IFN-γ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果: Ag85B-ESAT6 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1: 1000,ESAT6-Ag85B 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1: 5000. 融合蛋白Ag85B-ESAT6和ESAT6-Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为2.40±0.17 和2.60±0.25,而生理盐水组只有0.90±0.21;相对应的IFN-γ含量分别为(3.51±0.30) μg/L和(4.05±0.41) μg/L,显著高与生理盐水对照组(0.50±0.25) μg/L, P<0.05,但不及BCG免疫组(5.55±0.31) μg/L. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.31±0.13)相比较,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷分别为5.04±0.11和5.15±0.29, P<0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微. 结论: Ag85B与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.
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人类髓样分化蛋白-2的原核表达
目的:在大肠杆菌DH-5α中表达人类髓样分化蛋白-2(human myeloid differentiaton protein-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-s-transferase,GST)的融合蛋白(GST/hMD-2),并对融合蛋白进行免疫学鉴定及初步的变性复性处理.方法:建立GST/hMD-2表达菌,在不同温度下以不同浓度IPTG诱导不同时间后采样,用SDS-PAGE分析各种组合条件下融合蛋白的表达量和溶解性;用Western-Blot鉴定融合蛋白免疫性;用尿素变性和透析法对融合蛋白进行初步纯化.结果:在37℃经0.4 mmol/L IPTG诱导4 h后,GST/hMD-2可获高表达量(约占菌体总蛋白的20%),未见可溶性表达;Western-Blot证实GST/hMD-2能与抗MD-2单克隆抗体特异性结合;GST/hMD-2溶于8 mol/L尿素,梯度透析后纯度提高至40%.结论:hMD-2可在大肠杆菌DH-5α中与GST融合表达.
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重组腺病毒介导的HBV核心蛋白和hEDN融合蛋白基因在小鼠肝脏的表达
目的:使HBc-hEDN基因重组腺病毒载体(AdHBc-hEDN)及其对照载体AdhEDN在小鼠肝脏获得表达. 方法: 将体外扩增获得的高滴度AdHBc-hEDN和AdhEDN经尾静脉注射感染小鼠,并用免疫组化的方法检测AdHBc-hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏中的表达. 结果: 重组腺病毒AdHBc-hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏均获得了阳性表达. 结论: HBc-hEDN基因重组腺病毒载体在正常小鼠肝脏的成功表达为其在乙型肝炎小动物模型体内的抗病毒功能研究奠定了良好的基础.
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丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定
目的: 构建HCV ns5b基因的重组原核表达质粒,并获得NS5B蛋白的高效表达,为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件. 方法: 利用PCR技术扩增HCV ns5b基因,XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上,转化大肠杆菌JM109菌株,获得阳性重组质粒pRSETA-ns5b, 阳性质粒转化BL21(DE3), IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot电泳进行鉴定,并以薄层扫描分析对其定量. 结果: 成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pRSETA-ns5b,经诱导明显表达出6His-NS5B融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白25%,Western-Blot结果显示表达蛋白保持活性. 结论: HCV NS5B蛋白在体外得到了有效表达.
