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福州口岸入境船舶上首次发现埃及伊蚊及其携带的病原体
[目的]通过加强入境船舶医学媒介监测,防止新蚊种、蚊媒传染病传人和传播.[方法]对入境船舶的积水容器进行蚊幼虫监测,并采样送实验室进行形态学鉴定,登革热、黄热病、基孔肯雅热等病原检测,对船舶实施灭蚊等卫生处理,对船员施行流行病学调查、体温检测、医学检查等措施.[结果]全船发现9处积水,1处蚊幼虫阳性,积水4000ml,幼虫70条,羽化后经实验室鉴定该蚊幼虫均为埃及伊蚊,未检出登革热、基孔肯雅、西尼罗、乙脑等病毒.对该轮船员进行流行病学调查、医学检查,未发现登革、基孔肯雅热、乙型脑炎、西尼罗热、黄热病等病人.对船舶实施灭蚊等卫生处理措施后,未再发现成蚊和蚊幼虫.[结论]埃及伊蚊属福州地区外来蚊种,是传播黄热病、登革热等热带病的重要媒介.提示福州口岸应提高防范意识,特别应加强来自蚊媒传染病疫区船舶的蚊媒监测、卫生处理工作.
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基孔肯雅病毒实验室检测方法研究进展
基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒引起的一种急性虫媒传染病,基孔肯雅病毒属甲病毒属,披膜病毒科.近年来,该病毒曾引起全球多处疫情暴发,并造成全球性的公共卫生问题.本文对基孔肯雅病毒及其实验室检测方法作一综述,以指导国内开展对该病的检测.
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基于扩增后分析的单管双重荧光PCR方法的建立
目的 建立单通道双重荧光PCR方法检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒,为探索超多重荧光PCR方法奠定基础.方法 根据TOCE原理,首先在寨卡病毒的TaqMan探针荧光PCR技术基础上,设计两条含有不同标签序列的杂交探针,通过寨卡病毒毒株选择合适的标签序列,再根据合适的标签序列设计合成两条理论上解链温度不同的检测探针,同样用寨卡病毒毒株评估两条检测探针;接着按相同原则设计合成基孔肯雅病毒的杂交探针和检测探针,进行单管内单通道双重荧光PCR试验.结果 标签序列的选择结果表明,只有当标签序列的解链温度低于荧光PCR的退火延伸温度时,阳性样本才能获得相应的扩增曲线;根据合适的标签序列设计合成的两条理论上解链温度不同的检测探针,实际检测时可以在同一检测通道中通过融解曲线分析准确区分.单管双重荧光PCR可准确检测出基孔肯雅病毒、寨卡病毒的毒株和阳性样本.结论 建立了一种针对基孔肯雅病毒和寨卡病毒的单通道双重荧光PCR检测方法,为后续多种虫媒病毒超多重荧光PCR检测方法的开发提供借鉴.
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广州市2010年新发现一株基孔肯雅病毒基因特征研究
基孔肯雅热（CHIK）是由CHIK病毒（CHIKV）经伊蚊传播的一种急性传染病。2010年广州市疾病预防控制中心监测到1名疑似登革热发热症状的患者，血样经实验室检测显示登革病毒核酸为阴性，CHIKV核酸为阳性，继而分离获得1株CHIKV。采用RT-PCR 扩增此毒株的全基因并测序，与 GenBank 中的中国地区和全球代表株进行全基因进化分析，以了解其序列特征和可能的传播来源。
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基于病毒样颗粒的检测基孔肯雅病毒IgM抗体的MacELISA方法的建立与评价
为了建立捕获法ELISA检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法,本研究分离基孔肯雅病毒结构蛋白编码基因C-E3-E2-6K-E1基因元件,通过昆虫细胞杆状病毒表达体系,制备病毒样颗粒,免疫昆明鼠制备多克隆抗体,纯化后用辣根过氧化物酶标记,建立一种以羊抗人IgM抗体、VLPs抗原和酶标多克隆抗体为基础的MacELISA检测基孔肯雅病毒IgM抗体的方法,通过商业化质控血清,实验室确诊基孔肯雅热、肾综合症出血热患者和健康人群血清标本对所建立方法进行优化和初步评价,并与德国欧蒙公司商业化CHIKV IgM抗体检测试剂盒IIFA-IgM进行比较研究.所建立方法特异性为99％(99/100),重复性检测板内变异性系数低于10％,板间变异系数低于15％,检测限明显低于IIFA-IgM商业化试剂盒(P＜0.0001).结果显示,本方法属常规ELISA方法,操作简单,具有较高的敏感性、特异性,可用于基孔肯雅病毒IgM抗体实验室检测,为该病的诊断和流行病学调查提供新的手段.
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两例输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染实验室检测
对不明原因发热病人开展登革病毒和基孔肯雅病毒合并感染的检测,明确合并感染的可能性,为防御这两种虫媒传染病的传播提供依据.通过流行病史调查,临床症状和实验室检测对两名从泰国普吉岛旅行归来的发热病人进行了登革病毒和基孔肯雅病毒感染的诊断.两名患者在泰国旅行停留10天,在此期间两人均有蚊虫叮咬史.回国3天后两患者相继出现高热症状(39℃以上),且伴有皮疹,肌肉酸痛和乏力.实验室血常规检测发现轻度血小板降低伴淋巴细胞减少,登革病毒IgG/IgM快速诊断试剂盒检测发现一名患者登革病毒IgM阳性.实时荧光RT-PCR检测证实两患者血液中登革病毒和基孔肯雅病毒核酸均阳性,同时用RT PCR方法扩增获得了登革病毒C-prM蛋白部分基因,经测序和同源性分析,证实感染登革病毒属于Ⅰ型登革热病毒.这是我国首次出现的输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染病例,本研究建议对流行病史和临床症状满足的病例要同时进行两种病毒的实验室检测.
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含内参的登革病毒与基孔肯雅病毒3重荧光定量PCR检测方法的建立与评估
目的 建立一种含内参的,针对登革病毒和基孔肯雅病毒核酸检测的3重荧光定量PCR方法. 方法 针对登革病毒3'端非结构蛋白编码区和基孔肯雅病毒5'端非结构蛋白编码区设计引物与探针,建立一套含有内参的并且能同时检测登革病毒和基孔肯雅病毒的3重实时荧光定量RT-PCR方法.对其低检测限和特异度进行验证,通过检测血清标本对该方法进行临床应用评估. 结果 建立的3重荧光定量PCR登革病毒与基孔肯雅病毒绝对定量标准曲线显示,病毒拷贝数的对数值与CT值之间具有良好的线性关系,梯度稀释后的标准品核酸检测均呈现典型的S型曲线.检测日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、辛德毕斯病毒各1株,结果均为阴性,特异度为100％.用该方法检测294份登革热患者血清,灵敏度为100％,特异度为89.3％,阳性预测值为92.1％,阴性预测值为100％;测定33份基孔肯雅热病患者血清的灵敏度、特异度及阴、阳性预测值均为100％. 结论 建立的含有内参的能同时检测登革病毒与基孔肯雅病毒的3重荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度和特异度,可用于登革病毒与基孔肯雅病毒感染检测,为早期筛查和鉴别登革病毒和基孔肯雅病毒感染提供依据.
关键词： 3重荧光定量RT-PCR 登革病毒 基孔肯雅病毒 -
基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,检测基孔肯雅病毒.方法 通过序列比对挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列,在此序列上设计引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR反应体系.结果 经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达21拷贝/μl,通过检测与传播媒介相似的流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应.结论 该方法的建立在基孔肯雅热的疾病防控方面有较好的应用前景.
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基孔肯雅病毒的纳米金实时荧光PCR方法的建立
目的 建立一种检测基孔肯雅病毒纳米金实时荧光定量PCR的方法.方法 以课题组建立的普通实时荧光PCR方法为基础,在PCR体系中添加不同大小粒径的纳米金进行体系优化,评价优化后的体系.结果 添加纳米金的实时荧光PCR较不添加的扩增效率高；优化后的纳米金实时荧光PCR产物的Ct值与模板稀释浓度存在良好的线性关系,回归方程:y=-3.31x+41.78,R2=0.9997,PCR扩增效率为99.5％.结论 纳米金能提高实时荧光PCR的反应效率.
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一起基孔肯雅热暴发的蚊媒监控及其病毒检测
目的 分析基孔肯雅热流行与诱蚊诱卵指数的关系,调查白纹伊蚊成幼虫感染基孔肯雅病毒状况.方法 基孔肯雅热流行期间,通过诱蚊诱卵器和布雷图指数调查蚊虫密度和采集蚊虫,用实时荧光PCR和细胞分离2种方法对野外捕获的白纹伊蚊体内病毒进行检测.结果 确认基孔肯雅热暴发流行后,启动包括应急灭蚊的综合控制措施1周后,疫情得到有效控制,布雷图指数和诱蚊诱卵指数下降到5以下;采集的蚊样品按照时间和地点分成27份进行病毒检测,成蚊标本都显示病毒阴性,有3份乙醇浸泡处理的蚊幼虫标本为可疑阳性,占总幼虫标本(24份)的12.5％.细胞培养分离病毒均为阴性.该社区共报告病例253例,应急控制在22d结束.结论 基孔肯雅热暴发流行时,诱蚊诱卵器法作为应急灭蚊安全、有效、简便易行的评价方法,尤其在成蚊控制效果评价和捕获成蚊检测带病毒指数上有优势,流行期间白纹伊蚊对基孔肯雅病毒的感染率、传播率有待进一步研究.
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全球基孔肯雅热流行现状及分子流行病学研究进展
近几年,基孔肯雅热在东非海岸、印度洋岛屿、印度及东南亚地区广泛流行,导致数百万人感染发病,且流行地区不断扩大,发病数不断上升,成为该地区重要的公共卫生问题.掌握该病流行特点,防止该病传人我国并引起流行是当前面临的重要任务.现就基孔肯雅热全球流行情况以及临床学、媒介生物学和基孔肯雅病毒的分子流行病学等方面的研究进展做一综述.
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深圳市输入性基孔肯雅热病例的流行病学和病原学特征分析
目的 对深圳市2010年首例基孔肯雅热疫情及病原学特征进行分析.方法 调查分析流行病学特点;对疑似患者血清标本采用ELISA和荧光PCR方法分别检测病毒IgM、IgG抗体和核酸,并用BHK-21细胞分离病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒结构蛋白基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的基孔肯雅毒株进行同源性比较.结果 深圳市2010年10月报告的一起基孔肯雅热疫情为输入性病例.从患者血清标本中检测到病毒IgM抗体和核酸,并首次成功分离到基孔肯雅病毒,将其命名为CHIKV-SZ1050.深圳市基孔肯雅病毒分离株SZ1050与CHIKV非洲原型株S27-African、我国广东省2010年暴发疫情株GD05/2010、印度2010年流行株TN06310在E1基因上核苷酸同源性分别为98.2％、98.3％和98.7％.进化树显示SZ1050株与2010年中国分离株GZ1029亲缘关系近,其次为印度2010年流行株TN06310,属于ECSA基因型.结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该例基孔肯雅热输入病例是由基孔肯雅病毒ECSA基因型引起,病毒遗传特征与印度地区流行CHIKV一致,输入病例未引起继发病例.
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基孔肯雅病毒样颗粒的制备及免疫原性研究
目的 评价基孔肯雅病毒(CHIKV)病毒样颗粒(VLPs)免疫原性.方法 通过构建CHIKV结构蛋白编码基因C-E3-E2-6K-E1昆虫细胞表达载体,然后与杆状病毒线性DNA共转染SF9昆虫细胞制备重组杆状病毒,感染悬浮培养的SF9细胞制备VLPs.IFA、SDS-PAGE和Western-Blot法对表达产物进行鉴定分析,用纯化VLPs免疫BALB/c小鼠,评价免疫原性.结果 CHIKV结构蛋白装配形成病毒样球形颗粒,免疫小鼠可诱导CHIKV特异性抗体,能够有效中和CHIKV感染Vero细胞.结论 CHIKV VLPs能够通过杆状病毒系统在昆虫细胞中有效分泌表达,并具有较强免疫原性,为基于CHIKV VLPs的免疫学检测试剂乃至疫苗的研制奠定了基础.
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检测基孔肯雅病毒抗原方法的建立与初步评价
目的 建立基孔肯雅病毒抗原检测方法.方法 利用重组杆状病毒表达的基孔肯雅病毒全部结构蛋白组成的病毒样颗粒免疫小鼠和兔,制备了基孔肯雅病毒特异性多克隆抗体,建立了检测基孔肯雅病毒抗原双抗体夹心ELISA方法.优化了抗体使用浓度和ELISA反应条件,以灭活基孔肯雅病毒为阳性参考品评价了该方法的检测限和重复性.结果 利用10份模拟阳性血清、90份阴性血清、40份其他病毒感染者急性期血清初步评价该方法的特异性、灵敏性.结果显示特异性为100%,检出限约为10TCID50,板间变异系数小于10%,板内变异系数小于5%.结论 双抗体夹心ELISA方法可以用于检测急性期血清样本中基孔肯雅病毒抗原,为基孔肯雅热的病原学诊断提供了新的手段.
关键词： 基孔肯雅病毒 病毒样颗粒 双抗体夹心ELISA -
基孔肯雅热确诊患者81例临床分析
基孔肯雅热( Chikungunya fever,CHIK)是以伊蚊为传播媒介的急性传染病,主要流行于东南亚和非洲的部分国家和地区[1].1987年,我国云南西双版纳曾发现CHIK患者,并从其血液中分离出病毒[2].2008年3月起,我国广东省广州市、茂名市,浙江省杭州市等先后出现了基孔肯雅热输入性散发病例[3-5].2010年10月,广东省东莞市报告了全国首起基孔肯雅热社区疫情.作为一种在我国新发的传染病,掌握其临床学特点可指导临床医师对患者的救治并为修订该病的防治指南提供参考.
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基孔肯雅病毒中和表位的筛选及表达
目的:寻找基孔肯雅病毒中和表位,并将其表达为重组融合蛋白.方法:对噬菌体展示12肽库进行了生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆,使用 ELISA方法筛选并鉴定阳性克隆,分析阳性克隆的DNA序列,将其翻译成氨基酸序列进行同源性比较.将其中一个表位连同M13噬菌体PⅢ蛋白结构域Ⅰ～Ⅱ的编码序列用PCR技术扩增后插入原核表达载体pQE30,用IPTG诱导融合蛋白表达.结果与结论:从经过3轮淘洗的噬菌体中随机挑选123个克隆,从中筛选到20个阳性克隆,其中包含7种不同的氨基酸序列,这些序列缺乏同源性,表明该单抗表位应为构象型表位.在室温培养条件下成功地在大肠杆菌周质腔表达了一种可溶性的表位融合蛋白,经亲和层析得到了纯化的表位融合蛋白.
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基孔肯雅病毒WJ0601株基因组全序列测定及分析
目的 对保存的基孔肯雅病毒WJ0601株基因组序列进行测定,并阐明该病毒与已报道毒株序列的关系.方法 对基孔肯雅病毒基因组编码区分14段进行RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列.结果 与结论基孔肯雅病毒WJ0601株基因组核苷酸共11 826 nt,编码3722个氨基酸,其中5′端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4;3′端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白.结构基因和非结构基因之间有68 nt的连接区为非翻译区.病毒基因组5′端和3′端分别有76 nt、526 nt的非编码区.序列同源性分析结果表明,此株病毒与S27-African株的同源性高,两者核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为99.8%,同属于(ESCA)基因型.
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基孔肯雅病毒，不容小觑肆虐美洲的“登革病毒”
2014年，一种类似于登革热的传染病———基孔肯雅热席卷了中南美洲，其病原体为基孔肯雅病毒，隶属于披膜病毒科甲病毒属的单股正链RN A病毒，传播媒介主要是伊蚊属，尤其是白纹伊蚊和埃及伊蚊。基孔肯雅热的临床症状与登革热十分相似，临床上需要鉴别诊断。2010年该疾病在我国广东曾小规模流行，其对人民健康造成的危害以及所带来的经济负担不亚于登革热，应高度重视，遏制其蔓延。
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基孔肯雅病毒E2蛋白的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)E2主要结构蛋白,为预防CHIKV感染及亚单位疫苗的研究奠定基础.方法 根据GenBank上公布的CHIKV基因序列合成E2基因,并进行密码子优化,以提高原核表达效率.设计引物并以合成的E2基因为模板,PCR扩增CHIKV E2,连接到原核表达载体pET-28a上,构建重组原核表达质粒pET-28a-CHIKV E2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后进行纯化.结果 重组原核表达质粒pET-28a-CHIKV E2经双酶切鉴定构建正确,测序结果与原序列一致.表达的CHIKV E2融合蛋白相对分子质量约为47 000,可与His标签抗体特异性结合,纯化后纯度达95％以上.结论 成功在大肠埃希菌中表达了CHIKV E2蛋白,纯化后蛋白纯度较高,为CHIKV亚单位疫苗的免疫试验奠定了基础.
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基孔肯雅病毒与基孔肯雅热
基孔肯雅热（chikungunya fever）是由基孔肯雅病毒（chikungunya virus）引起的一种蚊媒传染病，感染率高，可引起持续的关节症状。近几年来，基孔肯雅热暴发次数增加，流行范围不断扩大，全球范围内每年可导致100万人感染。同时，基孔肯雅病毒中某些基因突变使其可有效通过白纹伊蚊传播，不仅对热带和亚热带地区，还对白纹伊蚊广泛存在的温带地区的民众构成了潜在威胁。
