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3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中强化表达
9α-羟基雄烯二酮(9α-OH-AD)是制备倍他米松及地塞米松等甾体类药物的重要中间产物之一,在工业应用中,常使用谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等植物甾醇作为底物,通过分枝杆菌等菌种生物转化获得9α-OH-AD.在此过程中,3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是生物转化植物甾醇为9α-OH-AD的关键酶,该酶由3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)和3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)两个亚基构成.因此,提高3-甾酮-9α-羟基化酶的活性对促进9α-OH-AD的合成具有极其重要的作用.为了获得高效积累9α-OH-AD产物的重组菌株,根据NCBI提供的基因序列为主,相关设计引物软件Prime 5和DNAMAN等辅助工具设计引物KshA和KshB,PCR扩增,经过EcoRⅠ、NdeⅠ和EcoRⅠ、Hind Ⅲ分别双酶切KshA和KshB,同时与载体pNIT进行连接,获得了含有KshA基因和KshB基因的重组质粒pNIT-KshA-KshB,后再将构建好的质粒电转化入分枝杆菌中,根据小抑菌浓度卡那霉素抗性平板上筛选得到1株阳性转化子M-ksH.发酵催化积累9α-OH-AD的实验结果表明,当底物植物甾醇投料为10 g/L时,M-ksH积累9α-OH-AD产量相比较出发菌株提高了0.486 g/L,重组菌的转化率提高了50.78％.研究结果可为提高甾体类药物9-OH-AD生产效率提供一定的基础.
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大肠杆菌重组表达截短的人ACE2基因
利用E.coli原核表达系统克隆、重组表达截短的人血管紧张素转化酶2(ACE 2).通过细胞分子生物技术获取截短的人ACE2的基因,并将其克隆到pET28a载体上,且在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达该截短的人ACE 2蛋白.获取的截短的人ACE2基因,通过Nco Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切后,将其克隆到经过同样Nco Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切的pET28a表达载体上,得到pET28a-hACE2重组质粒.然后将pET28a-hACE2重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在37℃1mmol/L IPTG诱导下重组表达了截短的人ACE2,通过免疫学方法初步鉴定正确表达了该ACE2.在原核表达系统中,重组表达截短的人ACE2;为研究ACE2的结构与功能的关系奠定了一定研究基础.
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表达谷胱甘肽S转移酶-蜂毒素-88精氨酸变体白细胞介素2工程菌的发酵条件研究
目的 研究重组蜂毒素-88精氨酸变体白细胞介素2(Melittin-88AgrIL-2)工程菌的发酵条件.方法 采用摇瓶发酵,对含pGEX-4T-2-Melittin-88ArgIL-2重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、培养基的pH值等对谷胱甘肽S转移酶-Melittin-88AgrIL-2表达量的影响.同时研究培养温度对产物表达形式的影响.结果 根据优化的条件,蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的36%左右.结论 确立了该重组melittin-88AgrIL-2工程菌的发酵条件.
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mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒载体和真核表达载体的构建及体外的稳定表达
目的:构建以mLumin荧光蛋白为指示系统的小鼠T细胞免疫球蛋白和结构域蛋白(mouse T cell Ig and ITIM domin,mTIGIT)胞外区真核表达载体,并表达mTIGIT-mLumin融合蛋白.方法:分别设计mTIGIT和mLumin的特异性引物,通过PCR技术扩增两个目的基因序列,经酶切、连接,克隆至plenti-puro和pcDNA3.1载体.将构建的plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体进行病毒包装并感染HEK-293T细胞,而pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达质粒转染非洲绿猴肾成纤维Cos7细胞,利用两种表达载体的药物抗性进行筛选感染或转染的细胞,检测融合蛋白的表达情况.结果:通过PCR顺利扩增获得mTIGIT和mLumin,经酶切、连接插入至载体,基因测序结果证实克隆的mTIGIT和mLumin片段序列正确,并成功正确插入到plenti-puro载体和pcDNA3.1载体中;荧光显微镜和共聚焦显微镜观察显示,转染的HEK-293T细胞和Cos7细胞经过筛选能够稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白.结论:成功构建plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达载体,且能够在目的细胞中稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白.
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含EMC6基因重组真核表达载体的构建及其在人肝L-02细胞中的异位表达
目的:构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,并将其在人肝L-02细胞株中过表达.方法:查询PubMed上EMC6的基因序列,针对该序列设计引物,提取L-02细胞的总RNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,采用基因重组技术将EMC6的cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,经菌落PCR,测序验证构建的准确性.应用脂质体转染方法将重组载体转入L-02细胞中,RT-PCR、蛋白质印迹法检测EMC6基因的mRNA和蛋白表达水平.结果:PCR和基因测序结果均表明pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒构建成功,RT-PCR和蛋白质印迹检测结果证实EMC6在人肝L-02细胞中过表达.结论:成功构建人pcD-NA3.1(+)/EMC6重组质粒,并在L-02细胞中过表达.
关键词： 内质网膜蛋白复合体亚基-6 重组质粒 载体构建 转染 L-02细胞 -
小鼠microRNA-31反转录病毒载体重组质粒的构建及鉴定
目的:以pMSCV-puro载体(MGP)为骨架,构建带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的小鼠microRNA-31(miR-31)反转录病毒载体MGP-31.方法:PCR扩增带有NotⅠ以及XhoⅠ酶切位点的miR31的前体(premiR-31)序列,然后克隆至MGP载体上,测序鉴定.将构建的MGP-31质粒转染HEK-293T细胞,通过荧光显微镜观察GFP的表达情况,实时定量PCR检测miR-31转录水平以评估MGP-31质粒的转染效率.结果:基因序列分析显示pre-miR-31基因序列正确,并成功插入MGP载体,转染HEK-293T细胞可表达GFP,实时定量PCR结果表明转染MGP-31质粒的HEK-293T细胞可高表达miR-31.结论:MGP-31反转录病毒载体构建成功.
关键词： microRNA-31 反转录病毒载体 重组质粒 -
活性SET7/9融合蛋白的表达与纯化
目的:表达与纯化活性GST-SET7/9融合蛋白(SET7/9融合蛋白).方法:以含人SET7/9基因结构域全长cDNA的pCMV-SET7/9质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增获得目的基因片段,将测序正确的目的基因片段经EcoR Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切,插入载体pGEX-6P-3中,构得质粒经转染和异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,纯化后采用组蛋白甲基化转移酶(HMT)测定法鉴定蛋白活性.结果:构成pGEX-SET7/9重组质粒,表达分子质量约为77 kD的融合蛋白,纯化后测得CPM值明显高于对照组.结论:pGEX-SET7/9可表达高活性的SET7/9融合蛋白.
关键词： SET7/9融合蛋白 重组质粒 组蛋白甲基化转移酶 -
RegⅣ基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及pcDNA-RegⅣ的构建与转染
目的:探讨RegⅣ基因在4种结直肠癌细胞系中的表达水平,构建并转染pcDNA-RegⅣ重组质粒,为阐明RegⅣ基因在结直肠癌发生发展中的作用机制奠定基础.方法:采用RT-PCR方法检测HT-29、Caco-2、Sw480、LoVo细胞系的RegⅣ基因表达水平,将获得目的基因RegⅣ克隆于pcDNA3.1/(-)质粒上,用PCR、酶切进行鉴定后,脂质体转染至低表达甚至不表达RegⅣ的结直癌细胞系,用G418筛选后进行RT-PCR鉴定.结果:HT-29、Caco-2细胞系RegⅣ基因高表达,Sw480细胞系表达较前两者弱,LoVo细胞系RegⅣ阴性表达;构建的重组质粒中含有RegⅣ基因,经pcDNA-RegⅣ转染的LoVo细胞RegⅣ基因呈阳性表达.结论:RegⅣ基因在不同的结直肠癌细胞系中表达水平不同.成功构建和转染了pcDNA-RegⅣ,可使得RegⅣ(-)的LoVo细胞系RegⅣ基因呈阳性表达.
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大鼠pEGFP-PLZF真核载体的构建及在精原细胞中的表达
目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-PLZF,并了解其在大鼠精原细胞中的融合蛋白表达情况.方法:参考分子克隆技术,采用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中扩增早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF),将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用脂质体转染的方法导入精原细胞中,观察有无荧光的表达及用Western blot检测蛋白表达情况.结果:实验从大鼠睾丸组织中获取了编码plzf基因的全序列cDNA,产生了2 kb的目的插入片段,与pEGFP-N1载体连接后经酶切电泳鉴定及DNA测序证实序列正确;重组质粒转染精原细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,并用Western 1blot:检测到106 kD目的蛋白的表达.结论:新构建的重组质粒pEGFP-N1-PLZF通过鉴定,结构正确.转染到精原细胞后能在其中表达,发挥功能,为后续研究奠定了基础,对研究PLZF调控精原细胞增殖和分化机制具有重要的意义.
关键词： 早幼粒细胞白血病锌指蛋白 重组质粒 绿色荧光蛋白 精原细胞 -
小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因腺相关病毒载体的构建
目的:构建小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的腺相关病毒载体.方法:利用RT-PCR方法,从Balb/C小鼠脾细胞的mRNA中扩增T-bet基因全长cDNA,经测序证实后插入Pzac2.1质粒,用磷酸钙沉淀法,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,并通过抽提病毒DNA进行PCR扩增鉴定重组病毒的形成,设立eGFP基因为对照.结果:1592 bp的小鼠T-bet基因被成功克隆,分析表明,与Genbank中发表的序列相比具有99.8%的同源性.重组质粒Pzac2.1-T-bet的PCR及酶切鉴定表明T-bet基因被定向插入,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞包装成病毒后,经荧光显微镜和病毒DNA的PCR检测,证实已完成对重组病毒的包装.结论:成功构建了小鼠T-bet基因的腺相关病毒载体rAAV-T-bet,为免疫紊乱性疾病的T-bet基因干预治疗奠定了基础.
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DT390-IL2重组质粒治疗实验性变态反应性脑脊髓炎的初步研究
目的:研究DT390-IL2重组质粒对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的治疗效果.方法:提取髓鞘碱性蛋白(MBP)并经SDS-PAGE鉴定后,用MBP+CFA诱导豚鼠的EAE模型;采用亚精胺法进行DT390-IL2重组质粒的大量制备,并经肌注DT390-IL2重组质粒对EAE进行治疗,观察豚鼠临床症状和中枢神经系统病理改变.结果:①所提取的MBP,其分子量在17 kD左右,并具有良好的生物学活性,成功地建成了豚鼠的EAE模型;②通过DT390-IL2重组质粒治疗豚鼠EAE,各治疗组与未治疗组相比,其差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论:DT390-IL2重组质粒治疗EAE有效.
关键词： 实验性变态反应性脑脊髓炎 髓鞘碱性蛋白 重组质粒 免疫毒素 -
SFTSV糖蛋白Gn重组质粒的构建及其体液免疫原性研究
目的:研究严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)糖蛋白Gn的体液免疫原性.方法:将PCR方法扩增的SFTSV糖蛋白Gn基因和密码子优化后Gn基因克隆入载体pJW4303,构建Gn野生型和双优化重组质粒;经酶切和测序鉴定确认为目的质粒后,分别转染HEK293T细胞,Western blot检测糖蛋白Gn的表达;用Gn重组表达质粒及空载体分别免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性IgG抗体.结果:成功构建Gn重组野生型质粒pJW4303-WSP-Gn和双优化质粒pJW4303-tPA-Gn-opt;Western blot证实pJW4303-WSP-Gn编码Gn可在HEK293T细胞内表达,pJW4303-tPA-Gn-opt编码Gn在HEK293T细胞内表达并分泌到细胞外;ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性IgG抗体证实各重组质粒均能诱导特异性IgG抗体产生,双优化质粒较野生型质粒诱导产生的IgG时间更早、滴度更高.结论:SFTSV的糖蛋白Gn具有良好的免疫原性;和野生型质粒相比,双优化质粒更有利于糖蛋白Gn的表达和分泌,并且具有更好的体液免疫原性.
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表达EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)的小鼠移植瘤模型的建立
目的:建立表达EB病毒LMP2A小鼠移植瘤模型,为树突状细胞治疗EB病毒相关肿瘤的动物试验奠定基础.方法:将EB病毒LMP2A基因克隆至逆转录质粒pLXSN中,重组质粒用脂质体Clonfectin转入BALB/c小鼠来源的骨髓瘤细胞SP2/0,经G418筛选获得阳性克隆,亚克隆得到EB病毒LMP2A表达株并经PCR、RT-PCR、IFA、流式细胞仪鉴定.腹股沟皮下接种该细胞入BALB/c小鼠得到移植瘤模型,两周后切除肿瘤组织并作苏木精-伊红(H-E)染色切片.结果:构建出含EB病毒LMP2A基因的重组逆转录质粒,获得表达EB病毒LMP2A的SP2/0细胞,该细胞在BALB/c小鼠可生长成肿块.结论:成功地构建表达EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)的小鼠移植瘤模型.
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Cortactin功能性结构域GST融合蛋白的表达和纯化
目的:制备cortactin功能性结构域(NTA和ABR)GST融合蛋白,用于后续研究NTA和ABR多肽分子对肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响.方法:通过从cortactin基因cDNA克隆中扩增获得cortactin功能性结构域(NTA和ABR片段),经双酶切和连接后将其分别插入载体pGEX-4T-2中获得重组质粒.将重组质粒转化入感受态菌,诱导表达,蛋白粗提后纯化.结果:PCR扩增后获得和预期一致的cortactin功能性结构域(NTA和ABR片段),通过测序证实该两片段正确插入表达载体.纯化的蛋白作SDS-PAGE电泳,证实蛋白的完整性和纯度良好.结论:成功地获得cortactin功能性结构域(NTA和ABR)GST融合蛋白.
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Stat3mRNA靶向MicroRNA重组质粒的构建及其在HepG2肝癌细胞系中的表达
目的 构建并筛选靶向信号转导和转录激活因子3(Stat3mRNA)的微小RNA(MicroRNA)表达质粒.观察其在肝癌细胞系HepG2中对Stat3表达的影响.方法 针对人Stat3mRNA设计3条MicroRNA序列,经退火成互补双链,将双链DNA插入线性质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒中,分别构建重组表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3等3组质粒,并测序鉴定.脂质体法转染重组质粒至人肝癌HepG2细胞中,观察转染效果.RT-PCR和Western blot分别检测Stat3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力.结果 成功构建靶向Stat3的MicroRNA重组质粒,经测序证实插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致,转染人肝癌HepG2细胞后,荧光显微镜下可观察到带有绿色荧光的HepG2细胞.流式细胞仪检测3组质粒的转染效率分别为:76％、73％和63％.RT-PCR分析pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3的抑制率分别为:73.5％、47.2％和39.6％,下调Star3蛋白的比例分别为:89.1％、71.6％、67.3％.其中pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1的下调效应明显.MiR-1质粒转染组的细胞凋亡率升高,增殖受抑制,与阴性对照质粒组和未转染组比较,差异均有高度统计学意义(均P＜0.01).结论 成功构建了靶向Stat3的MicroRNA表达质粒,其对肝癌HepG2细胞Stat3的表达及增殖有显著抑制.
关键词： 信号转导和转录激活因子3 微小RNA RNA干扰 重组质粒 肝癌 -
人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建
目的 构建人源Diekkopf-1(DKK-1)基因的真核表达质粒,为进一步探讨DKK-1的生物学功能奠定基础.方法 Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-1的基因序列,将真核表达载体pcDNA3.1和DKK-1的PER产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pcDNA3.1-DKK-1,转化至大肠杆菌后经菌落PER、NHe I和EcoR I双酶切及测序鉴定.结果 RT-PCR法从人胎盘中扩增出816 bp大小的目的 片段,重组质粒转化至大肠杆菌后菌落PER同样扩增出816 bp大小的目的 片段,NHe I和EcoRI双酶切重组质粒能切出两条目的 条带,测序后与C,enbank中DKK-1的cDNA对比,证明DKK-1的基因序列完全正确.结论 成功构建了pcDNA3.1-DKK-1重组质粒,为研究人源DKK-1的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础.
关键词： Diekkopf-1 重组质粒 测序 -
RNA干扰抑制RPA70基因质粒载体的构建与鉴定
目的 构建含复制蛋白A 70(RPA70)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,诱导RNA干扰(RNA interference,RNAi).方法 根据GenBank中RPA70基因的mRNA序列,设计、合成2条反向重复多聚寡核苷酸序列,退火形成双链DNA.利用分子克隆技术,将含RPA70基因的双链DNA与经双酶切后的载体pSi-U6-GFP-Neo连接,构建pSi-U6-GFP-Neo-shRNA-RPA70重组质粒,通过DNA测序证实表达质粒构建成功.设空白对照组、阴性对照组及实验组,在脂质体2000的介导下转染食管癌TE-1细胞株,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况.结果 DNA测序证实含RPA70基因的shRNA表达质粒构建成功.结论 成功地构建了重组质粒pSi-U6-GFP-Neo-shRNA-RPA70,为下一步干扰实验奠定了基础.
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人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定
目的构建端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体.方法化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6 shRNA表达载体的U6 RNA 聚合酶Ⅲ(Pol Ⅲ)启动子的下游,构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT.结果经酶切电泳及测序分析证实,目的序列成功插入到预计位点.结论已成功构建pSliencer-hTERT载体,为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础.
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抑制肿瘤细胞皮层肌动蛋白装配功能的重组质粒的构建和鉴定
目的:构建一个具有拮抗肌动蛋白装配功能的重组质粒EGFP-N2/CA.为观察该基因片段对于肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响.方法:通过PCR扩增获得目的片段N-WASP-CA,通过双酶切和连接将其插入荧光表达载体EGFP-N2获得重组质粒.结果:PCR扩增后获得和预期一致的特异性DNA片段,通过PCR、双酶切和测序证实该片段已正确插人表达载体.结论:成功获得重组质粒EGFP-N2CA.
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靶向血管内皮生长因子和神经生长因子的shRNA真核表达载体的构建与鉴定
目的利用RNA干扰(RNAi)技术,构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)双基因的短发夹RNA(short hairpin, shRNA)真核表达载体用于胶质瘤基因治疗.方法分别设计并体外合成靶向基因VEGF、NGF的特异性编码shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经Bgl Ⅱ-HindⅢ酶切线性化的pSUPER质粒H1启动子下游,构建shRNA重组质粒,进而脂质体介导瞬时转染胶质瘤细胞系U251,半定量RT-PCR检测VEGF mRNA、NGF mRNA表达.结果重组质粒经过酶切鉴定和测序,插入片段的序列大小、位点和方向均与已合成的寡核苷酸的序列完全一致,在瞬时转染胶质瘤细胞后下调了VEGF mRNA、NGF mRNA的表达.结论成功构建靶向基因VEGF、NGF的shRNA真核表达载体,为进一步应用RNAi技术,研究其对胶质瘤的抑制作用奠定基础.
