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幽门螺杆菌glmM DNA重组质粒的构建及体外表达
目的构建幽门螺杆菌(Hp)pVAX1-glmM DNA重组质粒,体外转染SGC-7901细胞并鉴定其表达蛋白的抗原性.方法 RT-PCR方法从国际标准株NCTC11637中获取glmM全长基因,克隆插入T载体.测序后经酶切、连接反应将glmM的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pVAX1,酶切初步鉴定后测序确认.通过脂质体法将pVAX1-glmMDNA重组质粒转染SGC-7901细胞,检测其转染效率,确定转染成功后RT-PCR法检测glmM在转录水平的表达,ELISA法鉴定表达蛋白的抗原性.结果DNA测序结果显示扩增出的glmM全长基因与GenBank公布的Hp glmM序列有96%的同源性.PCR、酶切和测序结果证实glmM目的基因成功克隆入真核表达载体pVAX1.重组质粒转染的细胞经RT-PCR扩增获得1.4kb片段,与目的基因大小相符.ELISA结果显示重组质粒转染细胞的超声破碎物及培养上清液中抗原的滴度比对照组高2倍以上.结论成功构建了pVAX1-glmM DNA重组质粒,其表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究其抗Hp感染的效果及制备相应有效DNA疫苗奠定基础.
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日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达
目的构建日本血吸虫14kDa脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)和细胞因子IL-12共表达质粒,并观察其能否在小鼠体内获得表达.方法 TRIzol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA,采用RT-PCR方法逆转录Sj14FABP编码基因序列,经过双酶切后定向克隆到载体pVIVO2-IL12中,通过PCR、酶切及测序进行鉴定.大量制备重组质粒pVIVO2-IL12-Sj14FABP并免疫BALB/c小鼠,取注射部位肌肉组织进行间接免疫荧光试验.结果 RT-PCR扩增出一条大小为440bp的片段; 经PCR、酶切及测序鉴定表明所构建的重组质粒中含有Sj14FABP基因;间接免疫荧光试验结果为阳性.结论本试验成功构建重组质粒pVIVO2-IL12-Sj14FABP,并在小鼠体内获得表达.
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猪肺炎支原体168株黏附因子基因的克隆与表达
目的表达猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)168 株黏附因子(P97),探索其作为诊断抗原的可能性.方法采用PCR方法,从猪肺炎支原体168 株基因组DNA中扩增到黏附因子(P97)基因的抗原决定簇序列(R1区),产物经双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,具有正确阅读框架的重组表达质粒pET-32a(+)-P97(R1)转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的基因表达.结果 (1)获得Mhp168株黏附因子基因R1区长约270bp的DNA片段,测序证明重组质粒pET-32a(+)-P97(R1)的外源基因序列与已报告的Mhp232及J株黏附因子基因序列基本一致;(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量26.5kDa处有阳性表达条带,融合蛋白约占细菌蛋白总量的23.3%,主要以可溶性蛋白形式存在;(3)免疫印迹显示,该蛋白条带与兔抗猪肺炎支原体高免血清有阳性反应.结论 Mhp168株黏附因子基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组蛋白具有免疫反应性.
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含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjFABPc)基因DNA重组质粒pCD-SjFABPc在哺乳动物细胞中的表达
目的观察裸DNA重组质粒pCD-SjFABPc在体外转染HepG2细胞以及质粒DNA免疫鼠肌组织中的表达,为进一步应用该质粒进行DNA免疫实验奠定基础.方法用脂质体介导DNA转染法将pCD-SjFABPc转染贴壁细胞HepG2,G418加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养,SDS-PAGE及Western-blot鉴定目的基因在HepG2细胞中的表达;将pCD-SjFABPc质粒肌注免疫BALB/c小鼠,于6 5d后取注射部位的肌组织约0.3cm3大小,经固定、包埋、切片,免疫酶组织化学染色, 显微照相记录.结果在被转染的HepG2细胞裂解样品中,呈现一分子量约14kDa 大小且能被感染兔血清特异识别的条带;免疫组化结果显示免疫组切片标本中有特异性阳性反应.结论 pCD-SjFABPc质粒能在HepG2细胞及小鼠肌细胞中表达目的蛋白.
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问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121的初步研究
目的探讨问号赖型钩端螺旋体抗原基因的特点。方法应用6种常见内切酶(BamHI,Bgl Ⅱ,EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ,PstⅠ,Pvu Ⅱ)对从问号赖型钩端螺旋体017株的基因文库中筛选出来的重组质粒pDL121外源基因进行酶谱分析,同时用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体基因进行杂交分析。结果显示问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017, serovar hebdomadis strain 56610, serovar pomona strain 56608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc Ⅰ, serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。结论重组质粒pDL121外源基因可能是问号赖型钩端螺旋体的一个新基因,进一步测序分析将揭示该基因本质,同时因该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体,提示其可用于钩端螺旋体病的早期诊断及钩端螺旋体的鉴定和分类。
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恶性疟原虫FCC-1/HN株pcDNA3-Pfs25重组质粒在小鼠体内的免疫应答
目的探讨恶性疟原虫DNA疫苗在小鼠体内的免疫反应.方法将恶性疟原虫FCC-1/HN株有性期阶段的重组质粒pcDNA3-Pfs25经骨骼肌途径注射BALB/c小鼠,对注射部位的骨骼肌进行了预处理,即于注射前7d先在左后肢股四头肌注射0.5%盐酸布比卡因50μl,注射深度为2mm.观察免疫后不同时间点小鼠血清 IgG抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4+/CD8+ T细胞亚群比值和NK细胞杀伤活性的变化.结果 1)重组质粒pcDNA3-Pfs25经肌肉注射途径免疫小鼠后,机体IgG 抗体滴度增高、特异性T淋巴细胞增殖反应增强、CD8+ T细胞亚群比值增高以及NK细胞杀伤活性增强.2)肌肉注射为一有效的DNA疫苗免疫途径.结论采用编码有性期基因的重组质粒pcDNA3-Pfs25经骨骼肌注射途径免疫小鼠,能诱导机体有效的体液免疫、细胞免疫和NK细胞杀伤活性.本研究为恶性疟DNA疫苗的研究提供了免疫学实验依据.
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化
构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白.PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别.成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白.
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化
构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pET-23a(+),构建pET-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3);PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别.利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础.
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结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在Vero E6细胞中的表达
构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的真核表达质粒,并研究其在Vero E6细胞中的表达情况.采用PCR方法自结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增esat-6基因片段,定向亚克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-esat-6重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入Vero E6细胞,RT-PCR法检测mRNA表达情况,Western-blot法鉴定表达产物.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pVAC-esat-6;转染esat-6基因的Vero E6细胞,RT-PCR检测可见一条约288bp的目的条带,表达产物经Western-blot鉴定,其相对分子质量约为6000,能被结核病人血清所识别.构建的真核表达质粒pVAC-esat-6能在Vero E6细胞中表达,为结核病核酸疫苗的进一步研究打下基础.
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SARS病毒N蛋白真核表达质粒的构建及其诱导的体液免疫应答
构建SARS病毒核衣壳蛋白(N)的真核表达质粒,并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答.采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-N重组质粒;大量制备该重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠三次,间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价.成功构建了重组表达质粒pVAC-N,免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体.构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体,为SARS疫苗的进一步研究打下基础.
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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析
构建原核重组表达质粒pET23a-SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性.PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠埃希菌DH5α.测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET23a-SAG2,转化大肠埃希菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析表达产物.PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a-SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET 23a-SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性.成功构建了pET 23a-SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性.
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恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达
将恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的56kDa和47kDa外膜蛋白基因嵌合,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生双抗原融合蛋白.采用PCR方法,从Ot Karp株基因组DNA中扩增56kDa蛋白基因片段,将该片段分别与原核表达载体pQE30及47kD蛋白基因重组质粒pQE30/47连接,构建pQE30/56及pQE30/56-47重组质粒;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达.SDS-PAGE显示,pQE30/56转化的大肠杆菌产生一约50kDa的融合蛋白和pQE30/56-47转化大肠杆菌产生一约90kDa融合蛋白(56-47融合蛋白),免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应,56-47融合蛋白分别与47kDa、56kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应,以及56-47融合蛋白免疫血清与56kDa和47kDa重组蛋白反应.Ot Karp株的56kDa与47kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达,表达的融合蛋白具有56kDa和47kDa外膜蛋白的抗原特性.
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贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因表达及重组外膜蛋白免疫保护性的研究
研制贝氏柯克斯体30kDa重组外膜蛋白和分析该重组蛋白的免疫保护作用.将克隆贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因与原核表达载体pQE30重组,用重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠2次,用IFA和ELISA检查免疫小鼠的特异性抗体,以及用重组蛋白体外刺激小鼠T淋巴细胞增殖;免疫4周后,用柯克斯体毒株攻击免疫小鼠,攻毒后第7d,小鼠的主要脏器作病理学检查和柯克斯体量测定.(1)贝氏柯克斯体30kDa外膜蛋白基因在大肠杆菌细胞内表达,产生的重组蛋白约占全菌蛋白的14.6%,免疫印迹显示该重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应.(2)ELISA检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组外膜蛋白抗体,免疫小鼠的脾淋巴细胞经重组外膜蛋白刺激后,细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.(3)免疫小鼠的肺、肝、脾,无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏明显肿大并含有大量的柯克斯体.贝氏柯克斯30kDa重组外膜蛋白诱导小鼠产生抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答能有效地抵御贝氏柯克斯体的感染.
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贝氏柯克斯体表面抗原基因p1与hspB的融合基因在大肠杆菌中的表达
将贝氏柯克斯体(Coxiella burneil)表面抗原P1蛋白基因与热休克蛋白B(HspB)基因片段融合,并使该融合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生P1-HspB融合蛋白.采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增P1蛋白基因(p1)和HspB蛋白基因(hspB)片段,将两基因片段分别与原核表达载体pQE30连接,分别构建重组表达质粒pQE30/p1和pQE30/hspB.用BamHⅠ和SadI DNA内切酶将p1基因片段从pQE30/p1切下并与pQE30/hspB的hspB连接,构建重组质粒pQE30/p1-hspB.用IPTG诱导pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达融合基因p1-hspB.SDS-PAGE分析发现pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达一83 kDa融合蛋白;经薄层扫描分析,该融合蛋白约占到全菌体蛋白的12.1%;免疫印迹分析发现该融合蛋白能被贝氏柯克斯体感染小鼠血清所识别.构建的p1-hspB融合基因在大肠杆菌中得到了有效表达,表达的P1-HspB融合蛋白能与抗贝氏柯克斯体抗体特异反应,P1-HspB融合蛋白为Q热亚单位疫苗的研制提供了一种新型融合蛋白.
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贝氏柯克斯体34×103重组外膜蛋白的免疫保护性的研究
原核细胞表达贝氏柯克斯体34×103外膜蛋白基因,评价34×103重组外膜蛋白的免疫保护性.用PCR从我国贝氏柯克斯体分离株的基因组中扩增34×103外膜蛋白基因,用该基因与原核表达质粒重组,构建重组表达质粒;用IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌细胞内表达重组蛋白.用重组蛋白皮下接种免疫BALB/c小鼠2次,在加强免疫后的第28天,用ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平以及作体外脾淋巴细胞增殖试验检查小鼠的特异性细胞免疫水平;用10ID50贝氏柯克斯体腹腔注射攻击免疫小鼠,攻击后第7天病理学检查小鼠脏器的组织病变和染色镜检脾脏的贝氏柯克斯体量.SDS-PAGE和免疫印迹分析证明重组质粒转化的大肠杆菌产生了34×103重组蛋白,重组蛋白能与贝氏柯克斯体感染小鼠血清发生特异性反应.ELISA法检测出免疫小鼠血清中有高滴度的抗重组蛋白抗体,免疫小鼠的体外淋巴细胞增殖水平显著高于非免疫小鼠.组织病理学检查发现免疫小鼠的肺、肝、脾无明显病变,仅个别小鼠脾脏存在少量柯克斯体,而非免疫小鼠的肺、肝、脾病变十分明显,脾脏肿大并含有大量的柯克斯体.重组34×103外膜蛋白具有的免疫保护性,能够诱导机体产生有效的抗贝氏柯克斯体的体液和细胞免疫应答.
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恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中表达
采用PCR方法,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增58kDa热休克蛋白的基因,将该基因分别与原核表达载体pQE30及47kDa外膜蛋白的基因重组质粒(pQE30/47)连接,构建pQE30/58及pQE30/58-47重组质粒,用重组质粒转化大肠杆菌.SDS-PAGE显示,pQE30/58和pQE30/58-47转化的大肠杆菌分别产生一58kDa重组蛋白和一90kDa的双抗原(58-47)融合蛋白.免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别58kDa重组蛋白和90kDa融合蛋白,90kDa融合蛋白既与47kDa重组蛋白也与58kDa重组蛋白的免疫血清特异反应,58kDa与47kDa重组蛋白也被90kDa融合蛋白免疫血清所识别.研究结果证明58-47融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株47kDa外膜蛋白和58kDa热休克蛋白的抗原特性.
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普氏立克次体120 kDa表面抗原N端和C端基因的克隆与表达
采用PCR方法,从普氏立克次体基因组中扩增出120kDa表面抗原的N端和C端基因片断,并将其克隆于原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30/N和pQE30/C,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达.SDS-PAGE分析发现两重组质粒转化菌分别产生了一26kDa(N端)和67kDa(C端)重组蛋白;在免疫印迹分析中,26kDa和67kDa重组蛋白均与普氏立克次体免疫血清发生特异反应,证明27kDa和67kDa重组蛋白分别为120kDa表面抗原的N端和C端重组蛋白,具有普氏立克次体120kDa表面抗原特性.
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贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立
采用新型TaqMan-MGB探针建立贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR检测方法.根据贝氏柯克斯体特异的23S插入序列设计引物和探针,将PCR扩增的插入序列连接到T载体质粒,该重组质粒用作参比模板来建立方法.用建立的实时荧光定量PCR检测倍比稀释的参比模板,其敏感性是套式PCR检测方法的1000倍.用其它立克次体的DNA作对照模板,该定量PCR显示高度贝氏柯克斯体特异性.用建立的实时荧光定量PCR检测感染小鼠脏器样本,在小鼠的脾脏、肝脏样本中检测到贝氏柯克斯体,检测到的贝氏柯克斯体的量与感染的过程有线性关系.本研究建立的贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR检测方法具有比普通PCR检测方法更好的特异性和更高的敏感性,其定量检测的特性特别适合对贝氏柯克斯体感染程度的评价,以及对Q热疫苗的免疫保护效果的评价.
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mGM-CSF重组质粒的构建、表达及活性鉴定
目的构建pc-mGM-CSF重组质粒载体,为mGM-CSF基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法采用RT-PCR方法从小鼠脾脏中获得目的基因mGM-CSF,克隆于pcDNA3.1/Myc-His(-)(A)质粒上,成为pc-mGM-CSF,用PCR、酶切进行鉴定,然后用脂质体转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,用G418筛选后通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定,将转染SP2/0上清加入NFS-60细胞,检测蛋白活性.结果重组质粒中含有mGM-CSF基因,在SP2/0中有表达,且表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用mGM-CSF依赖株NFS-60细胞检测证明具有生物学活性.结论成功构建含mGM-CSF真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.
关键词: 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 重组质粒 基因治疗 -
心脏转录因子Nkx2-5、GATA-4真核表达质粒的构建
目的:构建人类心脏特异性转录因子Nkx2-5、GATA-4的真核表达质粒,探讨Nkx2-5、GATA-4在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础.方法:以质粒人脑cDNA为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2-5、GATA-4编码区序列.将真核表达载体pCDNA 3.1-HA、pCDNA 3.1-flag分别和Nkx2-5、GATA-4的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCDNA 3.1-HA-Nkx2-5、pCDNA 3.1-flag-GATA-4,转化至大肠杆菌,质粒抽提后经PCR、双酶切及测序鉴定.结果: 成功设计引物扩增出Nkx2-5、GATA-4基因编码区约1 kbp及1.3 kbp的目的片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2-5、GATA-4基因序列.结论:成功构建了含有Nkx2.5、GATA4的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础.