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重组质粒pEGFP-GPC3的抗小鼠肝癌研究
目的 探讨pEGFP-GPC3转染小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)是否能诱导小鼠产生特异性抗肝癌免疫以达到抗肝癌目的.方法 建立荷瘤小鼠模型,随机分A、B、C三组,分别予腹腔注射pEGFP-GPC3转染的DC、pEGFP-N1转染的DC及生理盐水,提取各组小鼠脾淋巴细胞(脾LC)检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性,观察瘤体内淋巴细胞浸润及肿瘤细胞坏死情况并计算抑瘤率.结果 A组小鼠脾LC对小鼠H22肝癌细胞(H22细胞)的杀伤率相比差异明显高于其对小鼠C127乳腺癌细胞(C127细胞)的杀伤率(t=17.365,P＜0.01)；B组小鼠脾LC对H22细胞及C127细胞的杀伤率无统计学意义(t=0.654,P＞0.05)；C组小鼠脾LC对H22细胞及C127细胞的杀伤率无统计学意义(t=1.291,P＞0.05)；A、B、C组对H22细胞杀伤率分别比较,A＞B＞C(F=587.658,P＜0.01).A组瘤体石蜡病理切片淋巴细胞浸润情况明显高于B组和C组(x2=1.075,P＜0.01).以C组为对照组,A、B组抑瘤率比较:A组＞B组.结论 重组质粒pEGFP-GPC3转染的DC能显著提高小鼠机体对H22肝癌细胞的特异性免疫.
关键词： GPC3 重组质粒 pEGFP-GPC3 树突状细胞 -
人BRCA1干涉慢病毒载体的构建与验证
目的:设计合成干涉BRCA1表达的小干扰RNA,并克隆入pLKO.1慢病毒表达载体,为研究基因BRCA1在乳腺癌细胞增殖中的作用提供基础.方法:根据人BRCA1的基因序列,设计合成三对BRCA1干涉片段(序列前后加入酶切位点EcoRI和AgeI),再利用酶切连接反应将其插入到慢病毒载体pLKO.1中,经过酶切鉴定及测序正确后,将重组质粒转染入MCF-7细胞,48h后提取蛋白质和RNA,通过蛋白印迹验证BRCA1的蛋白水平的表达情况,Realtime PCR验证BRCA1的RNA水平的表达变化.结果:重组质粒经酶切鉴定和测序比对完全正确,转染乳腺癌细胞48h后可见BRCA1表达的明显下调.结论:成功构建BRCA1干涉的慢病毒载体,并且转染MCF-7细胞证实其能够下调BRCA1的表达,为后续研究BRCA1在乳腺癌细胞的功能奠定了基础.
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HE4荧光素酶报告基因载体构建与鉴定及其在肾脏纤维化中的作用
目的:通过构建HE4荧光素酶报告基因载体以及质粒转染以分析HIF-1α对HE4靶向调控,明确HE4调控肾脏纤维化的分子机制.方法:采用巢式PCR扩增HE4启动子片段,纯化酶切后定向克隆进pGL-3basic报告基因栽体,进而与PRL-TK质粒共转染HK2细胞,检测荧光素酶的表达HIF-1α过表达质粒转染HK2细胞,western blot检测HE4分子的表达.HK2细胞转染HE4过表达质粒后检测COL4A1、COL1A1分子的表达.结果:获得HE4启动子荧光素酶报告载体,酶切鉴定结果与初期预测一致,荧光素酶检测结果证实HIF-1α可结合于HE4启动子上,从而启动HE4的表达.HK2细胞转染HIF-1α正义过表达质粒,HE4的mRNA和蛋白水平均显著增加.HK2细胞转染HE4过表达质粒,COIAA1、COL1A1表达水平上调.结论:本研究成功构建HE4启动子荧光素酶报告基因栽体,证实HIF-1α为HE4上游靶基因,过表达的HE4可能通过上调COL4A1、COL1A1促进细胞外基质沉积促进肾脏纤维化的发生发展.
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人色素域解旋酶DNA结合蛋白5的基因克隆及其真核表达载体的构建
目的:克隆人色素域解旋酶DNA结合蛋白5(chromodomain helicase DNA-binding protein 5,CHD5)基因并构建真核表达载体.方法:应用PCR扩增人CHD5基因的编码区,使用基因重组方法构建真核细胞表达载体peGFPc1-CHD5,实时定量PCR技术检测重组质粒peGFPc1-CHD5转染293T工具细胞后的过表达能力.结果:经过PCR方法,有效扩增了CHD5基因编码区,构建了peGFPc1-CHD5真核细胞表达质粒,测序分析表明所克隆的CHD5基因编码区序列无误.实时定量PCR检测结果表明重组质粒peGFPc1-CHD5能有效地过表达CHD5基因.结论:成功地构建了人CHD5的真核细胞表达载体peGFPc1-CHD5.并在293T工具细胞中实现过表达,为进一步研究奠定了实验基础.
关键词： 人色素域解旋酶DNA结合蛋白5 基因克隆 重组质粒 -
人snail真核表达载体构建与鉴定
目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定.方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长cDNA,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切、连接,插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达.结果:pcDNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI GenBank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高.结论:成功构建pcDNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础.
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柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病关系的研究
病毒性心肌炎和扩张型心肌病是心血管疾病中的常见病和多发病.许多学者的研究证实病毒性心肌炎的发病大部分与肠道病毒感染有关,尤其以柯萨奇病毒为多见[1-4],占心肌炎的40%～50%.关于扩张型心肌病的病因很复杂,可能与病毒感染、免疫障碍、神经体液因素、小血管病变、酗酒、遗传、中毒等因素有关.但目前有许多资料提示扩张型心肌病与病毒感染有关[5-8],主张它是由CBV感染导致心肌炎进一步发展的结果.确定病毒感染与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系,对两病的预防、诊断和治疗均具有指导意义.本实验用CBV3cDNA重组质粒PGP51BDNA片断,通过光敏生物素法制备CBV3cDNA核酸探针与心肌切片标本进行原位杂交,检测心肌组织中柯萨奇B组病毒核酸,证实了柯萨奇B组病毒与病毒性心肌炎和扩张型心肌病的关系.
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人腺病毒3型六邻体基因的克隆与鉴定
目的克隆人腺病毒3型(Ad3)六邻体-L1(Hexon-L1)、六邻体-L2(Hexon-L2)区基因,构建含有该基因的重组质粒,并进行测序鉴定,为进一步构建表达载体,制备基因工程疫苗打下基础.方法从Ad3感染的HeLa细胞中提取 Ad3 DNA, 用PCR方法扩增Hexon-L1、Hexon-L2基因,将得到的片段定向克隆到克隆载体pUC19质粒中,对克隆片段进行DNA测序鉴定.结果构建了重组质粒pUC19Hexon,测序结果与Genebank中该序列进行同源性比较证明克隆的片段为Ad3六邻体序列.结论成功克隆了Ad3的Hexon-L1、Hexon-L2区基因.
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pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达
目的 构建人神经生长因子β(NGF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达.方法 以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-β cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-β cDNA完全一致.将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达.结论 成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础.
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pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达
目的 构建大鼠神经营养因子3(NT-3)基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况.方法 采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒.将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达.结论 成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础.
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人腺病毒五邻体基因重组质粒的构建及鉴定
目的 构建腺病毒五邻体基因重组表达质粒.方法 通过PCR方法扩增获得腺病毒五邻体基因的完整序列,将此片段定向克隆到pQE30载体的多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用酶切鉴定方法与核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.结果 用PCR法获得了人腺病毒的五邻体基因,将该基因正确地重组到表达质粒pQE30中,构建出腺病毒五邻体基因重组表达质粒pQE30-penton.结论 构建腺病毒五邻体基因重组表达质粒pQE30-penton.
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人3型腺病毒六邻体基因表达质粒的构建及表达
目的表达人腺病毒3型六邻体蛋白,为制备基因工程疫苗打下基础.方法 BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组克隆质粒pUC19Hexon和载体pQE31,将得到的目的片段定向连接到表达载体pQE31中,对目的片段进行DNA测序鉴定,IPTG诱导高效表达.结果构建了表达重组质粒pQE31 Hexon,测序鉴定了克隆序列的准确性.在大肠杆菌中成功地表达了Ad3六邻体蛋白.结论成功表达了Ad3的六邻体蛋白.
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pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达
目的构建pcDNA3.1(+)胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达.方法将GDNF逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)产物克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以Fu Gene 6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性.结果 RT-PCR产物为640bp特异片段,pcDNA3.1(+)GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1(+)GDNF表达质粒克隆成功.可见pcDNA3.1(+)GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能够刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白.结论以Fu Gene 6介导pcDNA3.1(+)GDNF质粒转染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础.
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流感病毒RNA聚合酶PA亚基重组质粒pQE32-PA-2转化效率的实验研究
目的将甲型流感病毒RNA聚合酶PA亚基的基因工程重组质粒pQE32-PA-2转化入受体菌,并优化转化条件,以建立其高效、快速的转化体系.方法以大肠杆菌DH5α菌株为受体菌,研究了氯化钙溶液浓度(0、25、50、75、100、150mmol/L),热休克温度(0、30、37、42、50℃),转化时间(7、15、30、45、60、75、90、105、120min)及转化后的温浴时间(0、0.5、1、1.5、2hr)对基因工程重组质粒pQE32-PA-2转化效率的影响.结果氯化钙溶液浓度及热休克温度对转化效率的影响极为显著,转化时间在一定范围内对转化效率有明显的影响,而转化后的温浴时间对转化效率的影响不明显.结论在本实验条件下,以75mmol/L氯化钙制备感受态细胞,转化30分钟,经42℃热休克作用90秒后直接涂平板选择转化子,可获得高效、快速的转化效果.
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大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中.经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接.将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中,用RT-PCR鉴定BDNF mRNA的表达,免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平.结果:克隆了BDNF的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性；免疫印迹法分析显示,转染48 h时,COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主.结论:成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达,BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外,在不同时间点分泌组合不同.
关键词： 脑源性神经营养因子基因 重组质粒 基因表达 COS-7细胞 -
膜联蛋白A5过表达对宫颈癌细胞系SiHa细胞凋亡的影响
目的:构建膜联蛋白A5的重组表达质粒,转染宫颈癌细胞使其过表达后检测宫颈癌细胞的凋亡情况.方法:PcR法从pJLA503膜联蛋白A5中获得膜联蛋白A5基因;磷酸钙共沉淀法转染宫颈癌细胞系SiHa细胞,免疫印迹法和免疫组织化学ABC法检测了细胞中膜联蛋白A5蛋白的过表达;对过表达膜联蛋白A5的细胞采用免疫荧光法检测其细胞凋亡情况.结果:重组质粒中膜联蛋白A5基因序列正确;转染重组质粒后的SiHa细胞过表达膜联蛋白A5蛋白;过表达膜联蛋白A5的SiHa细胞凋亡显著增多.结论:膜联蛋白A5可促进宫颈癌细胞系SiHa细胞的凋亡.
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膜联蛋白A5绿色荧光蛋白重组质粒的构建及其在宫颈癌细胞系Hela细胞中的表达
目的:构建在哺乳动物细胞中表达的膜联蛋白A5(anxA5)的重组质粒,并在真核细胞中表达.方法:用PCR方法从pJLA503-anxA5质粒中扩增anx A5的基因序列,引入酶切位点Xho I和Bam HI.将真核表达质粒pEGFP-N1和anxA5的PCR产物经双酶切后用T4连接酶连接,并经鉴定序列正确后,用磷酸钙共沉淀法稳定转染Hela细胞,荧光显微镜下观察;免疫细胞化学染色观察anxA5在Hela细胞的表达.结果:重组质粒鉴定正确,稳定转染Hela细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光,免疫细胞化学染色可见anxA5表达.结论:成功构建了pEGFP-anxA5重组质粒,并能在宫颈癌细胞系Hela细胞中表达,为研究anxA5的功能及其在细胞系中的作用奠定了基础.
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miR-570对胃癌细胞B7-H1蛋白表达的抑制作用
B7-H1是一种重要的负性共刺激分子,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,而微小RNA具有直接的转录后调控作用.本文研究miR-570对B7-H1表达的调控作用.首先将miR-570及其抑制剂anti-miR-570分别转染B7-H1表达阳性的人胃癌细胞SGC-7901和B7-H1表达阴性的人乳腺癌细胞MDA-MB-435,以流式细胞术检测B7-H1分子表达情况；然后构建pcDNA/B7-H1表达质粒与miR-570共转染CHO细胞,以流式细胞术检测CHO细胞上B7-H1分子的表达情况；后分别构建含B7-H1基因3'-UTR片段和含miR-570作用靶点序列的荧光素酶表达载体与miR-570共转染CHO细胞,用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性.结果显示miR-570能显著抑制SGC-7901细胞和B7-H1基因转染细胞膜上B7-H1蛋白的表达,并能显著抑制荧光素酶表达载体表达的荧光素酶蛋白,而且anti-miR-570能上调MDA-MB-435细胞上B7-H1表达.本研究证明miR-570能显著抑制B7-H1蛋白表达,为通过抑制B7-H1信号通路以增强机体抗肿瘤免疫力的治疗途径奠定了基础.
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结核杆菌Ag85A和mGM-CSF共同表达载体的构建与CTL活性的诱导
构建、鉴定结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共同表达质粒,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略.先从质粒pBSby5中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES上成为pI85A,用PCR方法从pc-mGM-CSF质粒中扩增出mGM-CSF,构建于pI85A质粒上,成为共同表达质粒pI85AGM.然后转染7721细胞,进行蛋白的表达和鉴定.结果经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确.通过RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot检测证实Ag85A与mGM-CSF基因的转录和蛋白表达正确.Ag85A与mGM-CSF免疫组小鼠的CTL活性明显增强.表明细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A共同表达载体构建成功,并能诱导小鼠的CTL活性,为研制新型结核病疫苗奠定了基础.
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血栓调节蛋白表皮生长因子样结构功能域在毕赤酵母中的表达
目的:构建血栓调节蛋白表皮生长因子样结构功能域(thrombomodulin-domain 2,TM-D2)的毕赤酵母表达体系,以获得重组TM-D2蛋白.方法:以人cDNA序列为模板,用PCR扩增出TM-D2片段,并将其插入pPICZaB质粒,构建重组表达质粒TM-D2-pPICZaB,重组质粒电击转化入毕赤酵母菌株GS115,用甲醇诱导酵母进行蛋白表达,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白印迹法鉴定蛋白表达及纯化情况.结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和质粒测序证实,TM-D2片段已正确克隆到表达载体中;SDS-PAGE和蛋白印迹法检测结果证实,上清液中含His-tag的重组TM-D2的表达,且其相对分子质量约为55000.结论:TM-D2-pPICZaB初步判断TM-D2蛋白可在毕赤酵母中表达.
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人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达
目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达.方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况.结果:BT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGN cDNA全长897 bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGN cDNA序列一致.经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株.激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达.结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达.
