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采用多重PCR结合高分辨熔解曲线法单管同时检测JAK2V617F突变和JAK2外显子12突变
目的 建立能单管同时检测JAK2 V617F突变和外显子12突变的方法.方法 以PC-3细胞株DNA为野生型对照,分别以HEL细胞株DNA和含有JAK2外显子12突变的质粒作为JAK2V617F突变和外显子12突变的阳性对照,采用多重PCR扩增不同DNA片段,并结合高分辨熔解曲线法建立检测JAK2V617F和外显子12突变的联合检测体系.同时选取42例真性红细胞增多症患者,分别采用上述方法和常规方法在外周血中检测JAK2的2种突变.结果 采用多重PCR结合高分辨熔解曲线法成功建立了JAK2突变联合检测体系,能够同时检测JAK2V617F突变和外显子12突变,2种突变的检测灵敏度皆可达5％,2种扩增片段的溶解温度(Tm)的批间及批内变异系数都小于0.01％.42例真性红细胞增多症患者中,发现37例携有JAK2V617F突变,在5例JAK2V617F突变阴性真性红细胞增多症病例中检出2例JAK2外显子12突变.与常规方法相比,结果符合率达到100％.2例JAK2外显子12突变经克隆测序确认突变类型为H538K539delinsL和F537-I546dul10+F547L.结论 该方法可同时在外周血中检测出JAK2的2种突变,将有助于对骨髓增殖性肿瘤尤其是真性红细胞增多症的分子诊断.
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高分辨熔解曲线技术检测血液 BRCA1／2基因突变在乳腺癌高危人群中的应用
目的：通过高分辨熔解曲线技术（ HRM）分析乳腺癌患者及高危人群BRCA1／2基因的突变特征，探讨HRM技术在乳腺癌高危人群中BRCA1／2基因突变检测的应用价值。方法采用临床对照研究方法，收集2015年3月至2016年6月间在安徽省肿瘤医院和亳州市人民医院就诊的乳腺癌患者及其一级亲属（高危人群）各52例，无乳腺癌家族史的健康人40名，年龄性别无统计学差异，通过外周静脉血提取基因组DNA，应用HRM法检测血液中乳腺癌易感基因BRCA1／2突变情况，并对突变阳性结果进行DNA测序验证；采用logistic回归方法分析BRCA1／2基因突变与易感因素之间的相关性。结果52例乳腺癌患者发现9例BRCA1／2基因突变，突变率为17．3％，52例乳腺癌高危人群中发现5例BRCA1／2基因突变，突变率为9．6％，在40名健康人群中发现1例BRCA1／2基因突变。采用HRM法检测的9例BRCA1／2基因突变阳性结果与基因测序结果全部相符。 BRCA1／2基因突变与初产年龄、慢性乳腺疾病的易感因素有一定的相关性。9例BRCA1／2基因突变阳性的乳腺癌患者一级亲属中发现有5例BRCA1／2基因突变，一致性达到44．4％（4／9）。结论 BRCA1／2基因突变阳性的乳腺癌患者一级直系亲属存在较高的BRCA1／2突变率，因此HRM技术可用于乳腺癌高危人群的健康筛查和风险评估。（中华检验医学杂志，2017，40：105－108）
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高分辨熔解曲线分析技术的发展与展望
高分辨熔解曲线分析技术简便快速、灵活性高、成本低、敏感性及特异性高、闭管操作的优势，使其成为临床实验诊断及科研工作中得到广泛应用的分子诊断技术之一。随着高分辨熔解曲线分析检测仪器、DNA染料及熔解曲线分析软件的发展，高分辨熔解曲线分析技术的敏感性、特异性及准确度不断提高，为遗传病、肿瘤、病原微生物及个体化用药等提供快速、高效、经济的分子诊断检测平台。（中华检验医学杂志，2017，40：77－79）
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高分辨熔解曲线分析在肿瘤分子检测中的应用
高分辨熔解曲线分析具有检测成本低、操作简便的特点，且闭管操作无交叉污染的风险，已经成为临床诊断的一大有力工具，尤其在肿瘤的分子检测中已经得到了广泛使用，检测手段包括突变检测、测序前筛查、甲基化程度分析、拷贝数变异分析等，涵盖了肿瘤筛查、诊断、个体化治疗、预后判断等各个阶段。利用高分辨熔解曲线分析具有较高检测灵敏度的特点，与测序技术相结合可以显著提高分子检测的准确性，同时大大降低检测成本，为分子检测技术的发展开拓了新的空间。（中华检验医学杂志，2017，40：80－83）
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高分辨熔解曲线分析在临床细菌鉴定及药敏检测中的应用
高分辨熔解曲线（ HRM）分析技术是一项利用real－time PCR仪检测DNA序列多态性的技术。在含有饱和荧光染料的体系中进行常规PCR反应后，随即对PCR产物进行升温变性、采集荧光数据。根据熔解曲线的不同能够对单个碱基的差异进行区分。该技术操作简单、结果准确、成本低廉、真正实现了闭管检测，因此受到广泛的关注。快速、灵敏的病原学检测是细菌感染性疾病诊断的关键和难题，HRM技术在临床细菌鉴定及耐药性检测方面的临床研究，尤其基于熔解曲线分析的一体化床旁检测技术将为细菌感染性疾病临床诊治提供有力支持。（中华检验医学杂志，2017，40：84－87）
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钙网蛋白基因突变检测技术及临床应用选择
钙网蛋白基因(CALR)突变的发现有助于诊断JAK2/MPL突变阴性的骨髓增生性肿瘤(MPN),并与疾病进展、患者预后等关系密切.利用Sanger测序、PCR-片段分析、高分辨率熔解曲线、实时荧光定量PCR以及新一代测序等技术可进行CALR基因突变的检测.选择合适的突变检测技术并遵循相关分子标志物的实验室诊断思路有利于MPN快速有效的诊治.
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高分辨熔解曲线分析在遗传病分子诊断中的应用
高分辨熔解曲线分析（ HRM）技术基本原理为：DNA饱和荧光染料加入PCR反应体系，在一定的温度范围内将PCR扩增子进行加热变性，专业仪器检测变性双链DNA荧光信号并绘制熔解曲线，根据不同熔解曲线形状来区分野生型和杂合突变型。 HRM技术因其简单易行、准确快速、低成本，周期时间短、高通量等优点而广泛应用于基因突变扫描。此外，与其他突变筛查方法相比， HRM实现真正的闭管操作， PCR 结束后直接运行高分辨熔解分析，使HRM 技术更加方便易行。HRM技术是应用于突变筛查、基因分型等的遗传学分析新技术。（中华检验医学杂志，2017，40：146－148）
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应用高分辨率熔解曲线法分析FTO rs9930506变异与北京居民代谢综合征的关联
目的 基于高分辨率熔解(HRM)技术,建立敏感、经济、快速、适合临床应用的FTO基因rs9930506分型方法,并评价该基因变异与北京居民代谢综合征(MS)的关系.方法 参考GenBank的序列,设计rs9930506特异性的C3-spacer封闭的非标记探针,预混LC-Green plus染料,经PCR扩增和HRM反应,扫描荧光信号并分析基因型.设立酶切法和测序法为方法学对照,评价准确度和可操作性.在北京地区MS患者(500例)和对照组(500例)中应用该方法,探讨rs9930506变异与MS的关系.结果 3种方法均能较好实现rs9930506基因分型,HRM法为简便快速,应答率为100％,以测序法为金标准,抽样准确度为99.3％.MS组中,AA、AG、GG基因型分别有290例、185例和25例,对照组中分别为344例、138例和18例.对照组与HapMap数据库中北京汉族人各基因型分布无统计学差异(P =0.520)并满足Hardy-Weinberg平衡.AA基因型可能降低MS的发生风险( OR=0.626,95％ CI=0.483～0.812).结论 FTO基因s9930506 AA基因型的携带,可能是北京居民MS的保护因素；基于HRM技术建立的FTO基因rs9930506分型方法快速、准确、经济.
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高分辨率熔解曲线方法在指导华法林使用起始剂量基因分型中的应用及临床各种基因分型方法的比较
目的 探讨高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)方法对需接受华法林治疗患者进行CYP2C9*3(1075A/C,rs1057910)和VKORC1(-1639A/G,rs9923231)基因分型和估计华法林起始剂量的可行性,同时比较不同基因分型方法的优缺点和使用价值.方法 建立检测CYP2C9*3( 1075A/C,rs1057910)和VKORC1( -1639A/G,rs9923231)两个多态性位点基因型的HRM方法,在接受华法林治疗的100例患者中进行基因型的检测与分析,并与传统的PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),TaqMn探针法及DNA测序法相比较.结果 3种方法检测CYP2C9*3(1075A/C,rs1057910)和VKORC1(-1639A/G,rs9923231)的基因型完全一致,与DNA测序法相符合.而HRM方法更简单、经济、快速,临床应用的可行性高.100份临床标本的检测结果显示VKORC1-1639 AA、AG、GG3种基因型分别有73(73％)、23(23％)和4例(4％)；CYP2C9 1075 AA、AC、CC 3种基因型分别有94(94％)、6(6％)和0例.敏感性和特异性分析结果发现HRM方法检测这两种突变的敏感性和特异性均为100％.结论 HRM的方法能有效的检测CYP2C9*3(1075A/C；rs1057910)和VKORC1(-1639A/G；rs9923231)基因多态性且与其他方法相比临床操作的可行性高.
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AhR 基因 -1661G/A 位点与 GSTP1基因-313A/G 位点联合基因型多态性与内异症发病的相关性
目的 探讨芳香烃受体(AhR)基因- 1661G/A( AhR - 1661G/A)位点与谷胱甘肽硫转移酶p1( GSTP1)基因- 313A/G(GSTP1 - 313 A/G)位点联合基因型单核苷酸多态性与内异症发病的相关性.方法 采集2008年10月至2009年11月在南方医科大学珠江医院及佛山市第一人民医院经腹或腹腔镜手术及术后病理检查证实的432例内异症患者(病例组)和因输卵管结扎、输卵管复通、腹腔镜下输卵管通液、卵巢单纯性囊肿、畸胎瘤等进行腹、盆腔手术且术中未发现内异症病灶的493例患者(对照组)的外周血,采用荧光定量PCR技术为基础的高分辨率熔解(HRM)曲线分析技术检测两组患者外周血中AhR -1661G/A位点及GSTP1 - 313A/G位点单核苷酸多态性.结果 两组中AhR - 1661G/A及GSTP1 - 313A/G位点同时分型成功的例数分别为病例组431例、对照组490例.病例组患者AhR - 1661G/A位点与GSTP1 -313A/G位点联合基因型分布分别为AG+ AA(120例)、AG+ AG(64例)、AG +GG(8例)、GG +AA(109例)、GG +AG(84例)、GG +GG(4例)、AA+ AA(31例)、AA+ AG(10例)、AA+GG(1例)；对照组中联合基因型分布分别为AG+ AA (131例)、AG+ AG(68例)、AG +GG(6例)、GG+ AA(157例)、GG+ AG(66例)、GG +GG(4例)、AA+ AA(35例)、AA+ AG(20例)、AA+GG(3例)；两组患者外周血中联合基因型频率比较,差异无统计学意义(x2= 12.558,P=0.128).联合基因型GG+AG携带者比基因型GG+AA携带者内异症的发病风险高1.833倍(95％ CI为1.233～2.274).结论 AhR - 1661G/G位点与GSTP1-313A/G位点联合基因型多态性与内异症的发病有关.
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PR基因H770H位点多态性与子宫内膜异位症易感性的关联研究
目的：探讨中国汉族妇女PR基因第5外显子区H770H位点单核苷酸多态性（SNP）与子宫内膜异位症（内异症）遗传易感性的相关性。方法收集2008年10月—2010年4月经手术病理检查确诊的431例内异症患者（内异症组）和499例无内异症的妇女（对照组）的外周血，采用荧光定量PCR为基础的高分辨率熔解曲线分析（HRM）技术检测PR基因H770H位点的SNP，通过病例对照研究评估SNP与内异症的相关性。结果内异症组和对照组PR H770H位点等位基因C、T的频率分别为97.9%（844/862）、2.1%（18/862）和99.4%（992/998）、0.6%（6/998），CC、CT、TT基因型频率分别为95.8%（413/431）、4.2%（18/431）、0和98.8%（493/499）、1.2%（6/499）、0，两组分别比较，差异均有统计学意义（χ2=7.386，P=0.007；χ2=8.135，P=0.004）。携带等位基因C使内异症发病风险降低（OR=0.986，95%CI为0.976~0.996），而携带T等位基因使其增高3.319倍（OR=3.319，95%CI为1.323~8.325）；携带基因型CC使内异症发病风险降低（OR=0.970，95%CI为0.949~0.991），而携带CT基因型使其增高3.473倍（OR=3.473，95%CI为1.391~8.671）。结论中国汉族妇女PR基因H770H位点多态性与内异症遗传易感性相关。
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TNF-α-1031T/C与IL-6-634C/G位点联合基因型多态性与内异症遗传易感性的关系
目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因启动子区- 1031T/C(TNF-α - 1031T/C)位点与白细胞介素6(IL-6)基因启动子区- 634C/G(IL-6-634C/G)位点联合基因型单核苷酸多态性与内异症遗传易感性的关系.方法 2008年10月至2010年4月,收集在南方医科大学南方医院、珠江医院及佛山市第一人民医院妇产科行腹、盆腔手术并经病理检查证实的内异症患者432例(内异症组)和同期因输卵管结扎、输卵管复通、腹腔镜下输卵管通液、卵巢单纯性囊肿、畸胎瘤等在珠江医院妇产科行腹、盆腔手术且术中及术后病理检查均未发现内异症病灶的499例(对照组)患者的外周血,采用荧光定量PCR技术为基础的高分辨率熔解(HRM)曲线分析技术检测TNF-α - 1031T/C和IL-6 - 634C/G位点单核苷酸多态性.结果 (1)TNF-α - 1031T/C位点:内异症组TNF-α - 1031T/C位点等位基因T和C频率分别为79.2％( 684/864)、20.8％( 180/864),对照组分别为81.8％( 816/998)、18.2％( 182/998)；基因型TT、TC、CC频率内异症组为63.7％( 275/432)、31.0％( 134/432)、5.3％( 23/432),对照组为66.5％ (332/499)、30.5％ (152/499)、3.0％( 15/499),两组等位基因及基因型频率分别比较,差异均无统计学意义(P =0.158,P=0.186).(2)TNF-α - 1031T/C与IL-6 - 634C/G位点联合基因型:联合基因型TT+CC、TC +CC、CC+ CC、TT+CG、TC+CG、CC+CG、TT+ GG、TC +GG、CC +GG频率内异症组分别为39.4％ (170/432)、19.4％( 84/432)、4.6％( 20/432)、20.6％ (89/432)、8.8％( 38/432)、0.9％ (4/432)、3.5％ (15/432)、2.3％ (10/432)、0.5％(2/432),对照组分别为36.7％( 183/499)、17.4％( 87/499)、1.4％(7/499)、26.1％( 130/499)、10.4％ (52/499)、1.2％( 6/499)、3.8％ (19/499)、2.6％ (13/499)、0.4％( 2/499),两组联合基因型频率比较,差异也无统计学意义(P=0.107).联合基因型CC+ CC携带者与TT+CC携带者比较,患内异症的风险高3.076倍(95％ CI为1.268～ 7.457,P =0.009),其余联合基因型携带者与TT +CC携带者患内异症的风险比较,差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 TNF-α - 1031T/C位点多态性的单独存在与内异症的遗传易感性无明显关联,但TNF-α - 103 IT/C位点与IL-6 - 634C/G位点联合基因型多态性与内异症的遗传易感性相关.
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外周血K-ras基因突变和CA19-9联合检测对胰腺癌的诊断作用
目的 探讨联合检测患者外周血K-ras基因突变和血清CA19-9对胰腺癌的诊断作用.方法 采用高分辨率熔解曲线(HRM)法和电化学发光免疫分析法,分别检测胰腺癌患者(25例)、胰腺非癌性患者(15例)和正常对照组(15例)外周血中,K-ras基因突变和CA19-9水平,并对结果进行统计学分析.结果 胰腺癌患者外周血中,K-ras基因突变率为48.0％,胰腺非癌性病变组突变率为6.7％；CA19-9在胰腺癌组中阳性率为72.0％,胰腺非癌性病变中阳性率为13.0％.K-ras基因突变与CA19-9平行法联合检测(即两项指标中有一项为阳性即为阳性)诊断胰腺癌的敏感度和特异度分别为80.0％和80.0％.采用系列法联合检测(两项指标必须均为阳性)诊断胰腺癌的敏感度和特异度分别为40.0％和100％.15例健康对照者外周血中K-ras基因和CA19-9均无异常.结论 联合检测外周血K-ras基因突变和CA19-9可以为胰腺癌的诊断提供一种敏感性、特异性高的无创性检测方法.
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高分辨率熔解曲线技术及其在中药DNA分子鉴定中的应用
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是建立在熔解曲线分析的基础上,通过一类新型饱和荧光染料和更高分辨率的检测仪器,主要应用于突变扫描、基因分型和序列匹配等的一项新技术.该技术因简便、精确、快速、闭管、低成本、高通量、对样本无污染等优点而受到广泛关注.本文对高分辨率熔解曲线的原理、影响因素、优势、不足及在中药材HRM分析应用现状等进行系统总结,并对其在中药分子鉴定中的应用前景进行展望.
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HRM结合DNA条形码在苦杏仁对桃仁掺混检测中的应用
桃仁为常用中药,由于外形相似常与近缘中药材苦杏仁互混,但苦杏仁具有小毒,掺杂到桃仁中存在一定风险,需谨慎用药.为控制桃仁药材质量以及安全用药,需要建立一个可靠的检测方法来解决桃仁与伪品之间掺混的情况.本研究利用高分辨率熔解曲线技术(high resolution melting,HRM)结合ITS2序列对桃仁进行分析,结果表明HRM技术不仅可以区分正品(桃仁)与混伪品(苦杏仁),而且该技术在混合样品定量检测中具有强大的优势,苦杏仁对桃仁的掺杂检出限可以达到1％,其相关系数r=0.96,且在快速识别市场桃仁药材真伪具有一定优势.本研究证明HRM技术操作简便、灵敏度高,可用于桃仁药材的质量控制,并且有很大的潜力应用于其他药材及其混伪品的检测,是传统中药鉴定及DNA条形码技术有效补充.
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高分辨率熔解曲线技术在多基原药材升麻鉴定中的应用
高分辨率熔解曲线(HRM)分析是一种实时定量PCR技术,在核苷酸差异检测中具有快速、灵敏和准确等突出的优点,近几年来在基因突变、基因分型和遗传多样性等研究中发展迅速,但目前该技术应用于中药材鉴定的相关报道较少.本研究选取多基原药材升麻作为研究对象,广泛收集其主产区药材基原及其常见混伪品共41个样品,基于植物DNA条形码ITS2序列,通过对HRM反应体系和反应条件的优化,建立检测升麻及其混伪品的核酸荧光定量Bar-HRM方法,实现对升麻药材及其混伪品的鉴定,从而确保用药安全.该方法的特异性和灵敏性研究结果显示,升麻3个基原的各单倍型均能很好地表现出差异性,升麻及其混伪品均表现出良好单系性,能明显区分开.本研究证明HRM技术对升麻药材及其混伪品的鉴定能力强,在方法通用性和数据可视化方面具有优势,应用前景广阔.
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TLR9和VDR基因多态性与结核病易感性的相关性分析
目的 探讨TLR9(rs352139)和VDR基因(rs731236和rs2228570)单核苷酸多态性(SNP)与结核病易感性之间的相关性.方法 选取2013年1月～2015年6月期间我院确诊为初治活动性肺结核患者300例(结核组)和300例健康体检者(健康对照组),采用聚合酶链反应结合高分辨率熔解曲线对rs352139、rs731236和m2228570位点的SNP进行检测.结果 TLR9(rs352139)的AA和GG基因型比AG基因型人群患结核病的风险增加,OR值分别为1.061(0.76～1.49)和1.472(0.95～2.27);Taq(rs731236)的TT和CC基因型对比TC基因型人群患结核病的风险增加,OR值分别为1.049(0.68～1.61)和1.204(0.36～3.99);Fok(m2228570)的CC和TT基因型对比TC基因型人群患结核病的风险增加,OR值分别为1.164(0.83～1.64)和1.048(0.69～1.61),但两组间比较差异均无统计学意义(D0.05).结论 在中国沈阳地区,TLR9(rs352139)和VDR基因(m731236和m2228570)SNP可能与结核病易感性关联不大.
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胰腺癌患者外周血与肿瘤组织中KRAS基因突变的研究
目的 检测胰腺癌患者外周血与肿瘤组织KRAS基因突变率及两者的一致性,探讨外周血KRAS基因突变的临床应用价值.方法 收集2011年7月至2012年11月北京军区总医院、北京恒兴医院30例住院胰腺癌患者外周血标本,同时在北京军区总医院、北京恒兴医院、空军总医院、解放军309医院收集胰腺癌石蜡标本25例,胰腺癌新鲜组织5例.利用高分辨率熔解曲线(HRM)法分别检测30例胰腺癌患者外周血和30例肿瘤组织中的KRAS基因突变情况,分析其中13例外周血与肿瘤组织配对标本基因突变的一致性.结果 胰腺癌患者外周血中KRAS基因突变率为50%,肿瘤组织为70%,配对标本中突变一致性为62.5%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 胰腺癌患者外周血与肿瘤组织KRAS基因突变一致性较高,在无法获得组织学标本时可以用高敏感性HRM法检测外周血KRAS基因状态,为胰腺癌的临床诊疗提供帮助.
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Prohibitin rs6917C》T基因多态性与潮汕女性乳腺癌易感性的关系研究
目的 研究潮汕汉族女性人群中Prohibitin(PHB)基因rs6917 C>T单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与乳腺癌遗传易感性的关系.方法 采用病例-对照研究,于2009年7~12月收集汕大医学院附属肿瘤医院231例乳腺癌住院患者和169例正常对照女性的外周血,提取全血基因组DNA,以高分辨率熔解曲线(high resolution mehing,HRM)法检测PHB基因rs6917位点基因型,计算各种基因型的乳腺癌发生风险及其95%可信区间.结果 潮汕地区女性人群PHB rs6917存在两种基因型CC和TC,在乳腺癌组的频率分别为74.46%(C/C)、25.54%(T/C),在正常人群的频率分别为72.78%(C/C)和27.22%(T/C).经统计学分析,T/C基因型携带者与C/C基因型携带者在乳腺癌发病风险上并无显著性差异(OR=1.090,95%CI=0.695~1.709,P = 0.706).结论 未发现PHB基因rs6917位点SNP与潮汕汉族女性乳腺癌易感性具有相关性.
关键词： Prohibitin 单核苷酸多态性 乳腺癌 高分辨率熔解曲线 -
肺腺癌胸腔积液上清液和细胞块EGFR基因突变检测的临床意义
目的：比较应用高分辨率熔解曲线( HRM)方法检测肺腺癌胸腔积液上清液和细胞块表皮生长因子受体( EGFR)基因突变状态,为寻找有效的胸腔积液成分进行EGFR基因突变检测提供依据。方法收集2010年9月-2013年5月临床送检肺腺癌胸腔积液标本43例的上清液和细胞块,分别提取DNA,应用HRM方法检测其EGFR基因第18、19、20、21外显子突变情况。结果胸腔积液上清液与细胞块EGFR基因突变率差异无统计学意义( P>0．05)。 EGFR基因突变均为第19、21外显子突变,第21外显子基因突变上清液与细胞块结果完全一致。第19外显子基因突变两者略有不同。结论肺腺癌胸腔积液上清液和细胞块均可用于检测其EGFR基因突变状态,但存在假阴性的可能和肿瘤异质性,故建议EGFR检测前兼顾细胞学及HE结果。
