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可溶性人胎盘生长因子ELISA检测试剂盒的建立及性能分析
目的:研发人血清及尿液可溶性胎盘生长因子(sPLGF)的ELISA检测试剂盒并进行性能测试.方法:以抗人PLGF单克隆抗体包被微孔板,加入重组sPLGF和生物素标记的检测抗体,形成抗原抗体复合体,加入链亲合素辣根过氧化物酶和底物TMB实现比色反应;从线性范围、准确度、精密度、样品基质及样品前处理方法等指标进行性能评价,并与市售进口同类产品进行比较.结果:捕获抗体的适包被量为400ng/well,包被条件为4℃孵育16～20h,检测抗体的适工作浓度为1μg/ml,样品适反应条件为37℃孵育2h,适合的封闭液及样品稀释液组合为3％BSA-PBS和0.1％BSA-PBS;验证该试剂盒的有效检测范围为15.6～2000pg/ml,准确度为85％～115％;批次内变异系数CV≤10％,批次间变异系数CV≤15％;其检测范围、准确度、精密度、灵敏度及样品适用范围等与市售进口试剂盒基本一致.结论:本项目开发的人sPLGF检测试剂盒实现了人血清和尿液中的内源sPLGF的定量检测,其检测性能稳定、可靠,具有比进口试剂盒检测范围更广、价格更低的优势,可用于临床检测血液及尿液中的内源性sPLGF水平.
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双抗体夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原实验条件的研究
目的 建立检测旋毛虫循环抗原(circulating antigens,CAg)的双抗体夹心ELISA方法.方法 以抗旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(excretory-secretory,ES)抗原的鸡卵黄抗体IgY作为包被抗体,以抗ES抗原的小鼠单抗IgM作为检测抗体,建立监测旋毛虫CAg的双抗体夹心ELISA方法；应用棋盘滴定法,选择包被抗体、待测血清、检测抗体及酶结合物的佳稀释度,并测定方法的敏感性.结果 双抗体夹心ELISA检测旋毛虫CAg的佳条件为:IgY包被浓度为7.5 μg/ml,血清稀释度为1∶60,单抗稀释度为1∶2000,辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgM抗体稀释度为1∶2000.该方法检测旋毛虫CAg的敏感性为1 ng/ml.结论 建立的旋毛虫CAg双抗体夹心ELISA法具有较高的敏感性,有望用于旋毛虫病的早期诊断.
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金葡菌肠毒素C2的单克隆抗体制备、鉴定及初步应用
目的:制备抗金葡菌肠毒素C2(SEC2)的单克隆抗体(McAb),并建立SEC2检测方法.方法:以金葡菌培养液中纯化的SEC2为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体;并对单克隆抗体的特性进行鉴定;利用纯化后的抗体建立了夹心ELISA定量检测SEC2方法,并进行了验证和初步应用.结果:筛选出4株稳定分泌抗SEC2抗体的杂交瘤细胞株,其免疫球蛋白亚类均为IgG1,除两株单抗的SEC2识别位点相同外,其余单抗均特异性识别SEC2的不同结合位点.建立的夹心ELISA定量检测法,特异性、灵敏度、重复性均较好,检测SEC2范围为0.5～20 ng/ml,回收率在97.8%～101%,变异系数为2%～5%.结论:本研究制备的抗SEC2的单克隆抗体,可用于建立了SEC2定量检测方法,为控制金葡素制品质量和金葡菌肠毒素研究提供了较实用的方法.
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可溶性死亡受体5在化疗前后肺癌患者外周血中的检测
目的:探讨正常人群外周血清中sDR5及与肺癌患者的差异.方法:采用ELISA夹心法检测106例正常人群、79例肺癌患者与肺癌化疗以后血清中死亡受体5的含量,并运用SPSS软件对其结果进行统计学分析.结果:正常人群外周血清中sDR5平均值为(6.25±3.09) μg/L,肺癌患者的sDR5含量为(53.91±13.42) μg/ml明显高于正常人群,P<0.001.肺癌病人化疗后外周血sDR5水平为(23.99±14.23) μg/ml较治疗前明显下降,P<0.001.结论:外周血中sDR5的消退水平有可能与肿瘤病人发病、发展及预后密切相关.
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LAIR-2单克隆抗体的制备、鉴定和夹心ELISA方法的建立
为了制备LAIR-2单克隆抗体并建立夹心ELISA方法.应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗LAIR-2单克隆抗体(mAb).采用间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定LAIR-2的细胞分布.辣根过氧化物酶(HRP)标记LAIR-2 mAb,并建立检测LAIR-2的夹心ELISA方法.用重导向杀伤实验(RCA)鉴定LAIR分子参与调节杀伤功能的关系.结果成功地制备了3株特异识别LAIR-2的mAb,1株mAb(3G4)能够识别LAIR-1和LAIR-2的共同表位,但不能在重导向杀伤实验中抑制CD16诱导的杀伤功能.夹心ELISA方法检测LAIR-2的敏感性为5 ng/ml,为LAIR-2的分布及定量检测提供了方法.
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夹心ELISA检测可溶型LAIR-1方法的建立及其应用的研究
为了探讨血清可溶型白细胞相关免疫球蛋白样受体1(sLAIR-1)的水平与疾病的关系,用生物传感器鉴定了3种抗LAIR-1分子胞膜外区mAb识别的表位,并应用2种识别不同LAIR-1表位的mAb首次建立了检测sLAIR-1的夹心ELISA方法,其检测灵敏度达到1.5μg/L.以此方法检测了活化的人PBMC培养上清以及正常人和肾综合征出血热(HFRS)患者血清中sLAIR-1的水平.在经PMA、PHA、LPS和抗CD3 mAb活化的人PBMC细胞培养上清中检测到sLAIR-1.24例正常人血清sLAIR-1的平均水平为(6.2±3.3)μg/L,62例HFRS患者血清sLAIR-1的平均水平为(47.2±35.9)μg/L.证明体内和体外存在天然sLAIR-1.HFRS患者血清sLAIR-1水平明显升高.为进一步研究LAIR-1分子的免疫调节功能及其在临床免疫中的应用提供了新的手段.
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单一多克隆双抗体夹心ABC-ELISA检测M-CSF可溶性受体
用抗M-CSF受体的单克隆抗体和兔多克隆抗体及ABC复合物,建立了检测M-CSF可溶性受体(sM-CSFR的双抗体夹心ABC-FLISA.本法灵敏度高(0.1ng/ml),特异性强,重复性好,准确性高(CV＜10%),可检出肿瘤患者及部分正常人血清中可溶性sM-CSFR的含量.本法的建立也为探讨sM-CSFR的生物学功能及临床意义提供方法学基础.
关键词： 可溶性受体 巨噬细胞集落刺激因子 夹心ELISA -
Em18重组抗原特异性抗体的制备及对循环抗原检测的初探
目的 用Em18重组抗原ReEm18制备特异性抗体,建立双抗体夹心ELISA,检测患者血清中的循环抗原.方法 ReEm18经亲和纯化,免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,分别制备单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗).用获得的单抗和多抗建立双抗体夹心ELISA,检测患者血清中Em18循环抗原.结果 免疫兔血清抗ReEm18抗体效价达1∶204 800以上.经ReEm18和多房棘球蚴病(AE)患者血清及健康人血清阻断ELISA试验双重筛选融合细胞,共获得14株抑制率＞50%的特异性阳性细胞克隆.将特异性单抗和多抗自由组合进行双抗体夹心ELISA,结果以9号单抗与多抗的配对检测抗原为优,检测ReEm18的灵敏度达3 ng/m1.用建立的双夹心ELISA方法检测血清,11份AE血清中6份为阳性.结论 获得针对ReEm18的特异性单抗和多抗,建立了敏感的双抗体夹心ELISA方法,血清学初步检测结果表明AE血清中存在可检测的Em18循环抗原.
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牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测试剂盒的研制与评价
目的 研制一种牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测试剂盒,并在奶牛结核病检疫中进行初步应用和评价.方法 建立牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测方法,基于此法试制3批试剂盒,并对试剂盒的灵敏度、可重复性和保存期进行评价,其后进行初步应用,对961头奶牛采用单纯颈部皮试变态反应、商品化BOVIGAMTM试剂盒与试制的牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测试剂盒进行同步检测.结果 该试剂盒对质控样品的低检出量达到8.21 ng/mL,而且检测重复性良好,试剂盒保存期达12个月以上.在进行临床试验时,试制的试剂盒与单纯颈部皮试变态反应相比,阳性一致率为70.59％,阴性一致率为99.20％,总一致率为98.44％;与BOVIGAMTM试剂盒相比,阳性一致率为91.30％,阴性一致率为99.78％,总一致率为99.58％.其灵敏度为85.00％,特异性为100.00％.结论 成功建立牛结核γ-干扰素夹心ELISA检测方法,并研制出相应试剂盒,具有良好应用前景.
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适于HIV-1 p24抗原检测试剂的单抗制备与筛选
目的 制备抗HIV-1 p24单克隆抗体(单抗,McAb),并利用双抗体夹心ELISA法建立HIV-1 p24抗原检测试剂.方法 以基因工程原核重组抗原HIV-1 p24蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备单克隆抗体,单抗经纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测p24蛋白的佳配伍单抗以期建立HIV-1 p24抗原检测试剂.结果 成功筛选到16株稳定分泌抗HIV-1 p24单抗的杂交瘤细胞株,并从中筛选出佳单抗配伍组合"16G12+2F2b-HRP",该组合对p24蛋白的检测灵敏度为20 pg/mL,对感染性克隆pNL4-3表达的HIV病毒培养上清检测呈阳性,对100份HIV阴性人血清无非特异性反应,显示出良好的检测灵敏度和特异性.结论 本研究初步成功地建立了HIV-1 p24抗原的检测试剂,并为终建立HIV第四代诊断试剂(HIV Ag/Ab Assay)奠定了坚实的基础.
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随机肽库筛选弓形虫特异性抗原表位诱导保护性免疫的研究
目的从噬菌体随机肽库中筛选出模拟弓形虫特异性抗原表位的短肽分子,并探讨其对弓形虫的保护性效果.方法以纯化的弓形虫免疫兔血清IgG为配基,亲和筛选法富集特异性噬菌体,随机挑取噬菌体克隆用夹心ELISA法和Dot-ELISA法检测其特异性,混合4个阳性克隆免疫小鼠,1月后攻击感染,观察小鼠发病时间和死亡时间.结果经3轮筛选,特异性噬菌体得到了有效富集,第3轮洗脱噬菌体的产量为第1轮的167倍,随机挑取27个噬菌体经Dot-Bloting和夹心ELISA法检测,有24个能与弓形虫免疫兔血清及单克隆抗体特异反应.用致死量弓形虫攻击感染经阳性克隆免疫的小鼠,存活时间明显长于对照组.结论免疫筛选噬菌体随机多肽库可获得具有保护性的弓形虫抗原表位,为弓形虫疫苗研制提供了新途径.
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重组人碱性成纤细胞生长因子单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
目的 制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)单克隆抗体,鉴定其特性,建立双抗体夹心ELISA检测方法.方法 以rhbFGF为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗rhbFGF杂交瘤细胞株,制备抗rhbFGF单克隆抗体,采用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗体亚类,间接ELISA法检测抗体效,Western blot鉴定抗体特异性.HRP标记McAb并建立夹心ELISA检测方法.结果 获得2株(分别命名2D3、5F7)可分泌特异性McAb的强阳性细胞株,腹水抗体效价在10 5以上,IgG亚类均为IgGl,轻链为K链.Western blot证明2株McAb特异性良好,双抗体夹心ELISA检测rhbFGF低检测限达到2 ng/ml.结论 成功制备高效价的抗rhbFGF单克隆抗体,建立抗rhbFGF双抗体夹心ELISA定量检测方法.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 单克隆抗体 夹心ELISA -
抗大肠杆菌耐热性肠毒素ST1 McAb杂交瘤细胞系的建立及应用
目的耐热性肠毒素ST1单克隆抗体制备及在感染性腹泻诊断中的应用.方法应用基因工程菌株分泌的肠毒素制备ST1包涵体,免疫Balb/c小鼠,成功制备了3株特异性抗ST1的单克隆抗体细胞株,用其中1株McAb建立了检测ST1的双单克隆抗体夹心ELISA法.结果检测52株从临床腹泻病人粪便中分离的大肠杆菌,检出ST1阳性率为26.92%,与ST1检测的经典方法乳鼠灌胃法符合率为96.15%.结论该方法是一种简捷、灵敏和特异的检测方法,具有实际应用价值.
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重组人ALR单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用
目的制备抗重组人肝再生增强因子(ALR)的单克隆抗体(McAb).方法以基因重组人ALR二聚体(drhALR)为抗原,免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体.用常规法制备抗ALR单体(mrhALR)多抗,建立夹心ELISA法测定ALR,初步确定ALR在小鼠组织的分布;用荧光免疫方法对胎鼠各组织进行ALR检测.结果筛选出3株稳定分泌抗drhALR的单抗杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,特异性高,用于rhALR的免疫印迹及ELISA检测,可同时识别rhALR单体(mrhALR)和二聚体(drhALR);夹心ELISA法检测小鼠肝、肾、脾提取液ALR含量与鼠龄无关,各脏器的ALR含量不同,分别为肝0.36 μg/g、肾0.11 μg/g、脾0.05 μg/g;免疫荧光检测胎鼠,各器官有不同程度ALR的存在,无器官特异性.结论用drhALR为抗原制备的抗rhALR单克隆抗体,能够用于ALR的体内外免疫学检测,为rhALR及生化提取ALR的药理学研究及质量标准奠定了基础.
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马γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法的建立
目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心 ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法.方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA.结果:经过方阵滴定实验确定捕获抗体的佳浓度为1 mg/L,检测抗体的工作效价为1∶1 000.利用建立的方法对不同稀释度的重组马γ-干扰素和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测.结论:此方法检测敏感度达到1μg/L,特异性良好,为马的细胞免疫学研究提供了方法,并为建立马γ-干扰素ELISPOT检测方法奠定了基础.
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夹心ELISA法快速检测肝病患者血清中金属蛋白酶组织抑制剂-1
目的:建立一种快速检测肝病患者血清基质金属蛋白酶组织抑制剂-1( TIMP-1)的双抗体夹心ELISA,了解血清TIMP-1的水平与肝纤维化病程进展程度的关系.方法:以不同浓度的抗人TIMP-1单克隆抗体(mAb)为包被抗体,加入待测抗原以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TIMP-1 mAb作为标记抗体进行方阵滴定,建立双抗体夹心ELISA,并用于临床检测408例肝病患者血清TIMP-1的水平.结果:方阵滴定的结果表明包被抗体浓度为1 mg/L,血清稀释倍数1:100,HRP标记mAb的佳工作浓度为1:400.以此条件建立的夹心ELISA法具有良好的可重复性,中和抑制率在85%以上,稳定性良好,与国外检测TIMP-1的ELISA试剂盒进行对比试验,具有良好的相关性(r=0.988).用于临床快速检测肝硬化的检出阳性率为76.4%,明显高于慢性肝炎(40.2%)和急性肝炎(19.5%,P<0.005),并随着患者肝纤维化程度的加重而升高(P<0.001).结论:血清TIMP-1水平的变化可作为诊断肝纤维化良好指标.本法简便、快速,敏感性高、特异性强,用于肝纤维化的人血清学快速诊断.尤其适于医院及基层医疗单位应用.
关键词： 金属蛋白酶组织抑制剂-1 夹心ELISA 肝纤维化 -
血清及癌组织中sIL-2R水平与老年肺癌患者免疫功能的关系
白细胞介素-2(IL-2)具有多种生物学活性, 在机体抗肿瘤免疫中起着重要的作用[1].IL-2通过作用于表达白介素-2受体(IL-2R)的细胞而发挥其生物学功能.IL-2R的胞外段脱落形成可溶性白介素-2受体(sIL-2R), 两者与肿瘤病情的严重程度密切相关[2].我们采用双抗体夹心ELISA法和免疫组化显色法, 分别对40例老年人肺癌患者的血清及癌组织中sIL-2R的水平进行了检测, 以探讨sIL-2R水平与老年肺癌患者免疫功能的关系.
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心力衰竭患者血浆sTRAIL和sDR5的水平及培哚普利对其影响
目的: 探讨充血性心力衰竭(CHF)患者血浆可溶型TNF相关的凋亡诱导配体(sTRAIL)和死亡受体DR5水平的变化及与培哚普利对心脏保护的关系.方法: 用ELISA法检测治疗前后30例服用培哚普利的CHF患者、28例常规治疗的CHF患者及20例健康人对照血浆中sTRAIL及sDR5的水平. 结果: ①58例CHF患者血浆sTRAIL的平均含量为(1.43±0.47) μg/L, 健康人为(0.93±0.12) μg/L, 两者无显著性差异(P>0.05); sTRAIL水平与心功能损害程度亦无明显关系.CHF患者血浆sDR5的平均含量为(39.67±6.78) ng/L, 较健康人(<6 ng/L)明显升高, 且随着心功能损害程度的加重而升高.②培哚普利组与常规心衰治疗组治疗后, 血浆中sTRAIL的水平均有所降低, 但无显著性差异.治疗前后培哚普利组血浆sDR5的平均水平, 分别为(31.23±10.16) ng/L和(8.50±2.14) ng/L(P<0.05); 常规治疗组分别为(48.81±8.74) ng/L和(26.64±6.27 ) ng/L(P<0.05).培哚普利组与常规治疗组相比较, 前者降低更明显(分别下降72.7%和45.4%).③与其他病因所致CHF患者相比较, 高血压心脏病所致CHF患者血浆sDR5的水平明显升高. 结论: sDR5可能在CHF患者心肌细胞凋亡的发生、发展中起着重要作用.培哚普利可降低CHF患者血浆sDR5的水平, 在减缓心室重塑的进程, 保护和改善心功能中可能具有重要作用.
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抗人CA125单克隆抗体的制备、鉴定及化学发光体系的建立
目的 制备抗人糖抗原125(CA125)单克隆抗体(mAb),并建立化学发光免疫分析法检测体系.方法 将人CA125抗原免疫小鼠,通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株.经细胞扩大培养及纯化获得mAb,鉴定其特异性、纯度、亚型及效价,并建立双抗体夹心ELISA.分别对包被缓冲液、包被浓度和加样模式进行优化和选择后,建立化学发光免疫分析法检测体系,并对其进行评估和血样的测定.结果 获得3株抗人CA125的杂交瘤细胞株(30-1-4、31-1-5、43-1-6),不与CA199、CA50、CA724交叉,效价在1∶108以上,用30-1-4和31-1-5建立的化学发光免疫分析法经优化后,检测范围为0～1 000 U/mL,低检测限为0.72 U/mL,与罗氏试剂检测结果的相关系数大于0.90.结论 成功制备了抗人CA125 mAb,建立并优化了人CA125的化学发光免疫分析法检测体系,为CA125检测及卵巢癌的诊断奠定了基础.
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抗HBsAg表位单克隆抗体的制备及HBV血清型夹心ELISA的建立
目的 制备抗乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)表位单克隆抗体(mAb),建立HBV血清型夹心ELISA检测方法.方法 将HBsAg亚型蛋白分别免疫小鼠,通过细胞融合、高通量筛选ELISA (HTS-ELISA)筛选后得到杂交瘤细胞株并在无血清培养基中扩大培养.采用蛋白A对抗体进行纯化并测定抗体亲和力、亚型、特异性,后建立双抗体夹心ELISA.结果 HBsAg的亚型蛋白ad、adr及ayw分别免疫小鼠后,其血清效价达到1∶105.细胞融合及HTS-ELISA筛选后获得4株杂交瘤细胞株.经过纯化后得到的mAb分别命名为#2-4,#18-3,#7-7,#56-5,亲和力都在1×109 L/mol以上.间接ELISA结果显示,#2-4,#18-3,#7-7,#56-5分别特异性地与HBsAg的“d,y,r,w”表位结合.用抗HBsAg“a”表位的mAb#3-11分别与这4株抗体组合,进行夹心ELISA检测.结果显示,不同的ELISA组合能特异性地检测HBsAg的“d,y,r,w”表位.结论 成功制备了亲和力高、特异性好的抗HBsAg 4个表位的mAb,建立了检测HBV血清型的双抗体夹心ELISA.
