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浓缩乳清蛋白粉及其制品中梭状芽胞杆菌的分离及鉴定
目的 采用多种方法对新西兰进口浓缩乳清蛋白粉及其制品、市售婴幼儿配方粉样品中分离的梭状芽胞杆菌进行鉴定.方法 根据分离菌株的生长特性、革兰氏染色、生化反应、普通显微镜和电子显微镜下形态特征等表型特征,结合16S rRNA基因克隆测序及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等结果,对分离菌株进行综合鉴定.结果 78份样品中有16份(20.5％)被梭状芽胞杆菌污染,其中2份为浓缩乳清蛋白粉及其制品,14份为婴幼儿配方粉样品.共分离到梭状芽胞杆菌17株,包括生胞梭菌12株、拜氏梭菌2株,丁酸梭菌2株和第三梭菌1株.结论 新西兰进口浓缩乳清蛋白粉及其制品中厌氧微生物污染严重,经鉴定污染的主要微生物为生胞梭菌.
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广西市售婴儿食品中克罗诺菌分离株基因特征及进化分类鉴定
目的 分析广西市售婴儿食品中的克罗诺菌分离株的种类、表型和基因特性.方法 将保存的试验菌株进行复苏,通过API 20E生化条和ompA基因扩增检测进行初步鉴定,扩增16S rRNA基因后进行测序,将获得的全16S rRNA基因序列在GeneBank数据库上比对,构建进化树,确认是否为克罗诺菌.将试验菌接种于显色平板观察其表型和黄色素的产生情况,通过手工生化进行分型,确定其种属.结果 9株分离菌确定为克罗诺菌,有5种生化型,属于4个克罗诺种.检出Cronobacter sakazakii 6株菌,C.malonaticus、C.muytjensii和C.dublinensis各有1株;7株菌符合API 20E鉴定结果,9株分离菌均可检测到ompA基因.结论 广西市售婴儿食品中克罗诺菌的污染以C.sakazakii为主,生化表型、种属及基因型具有多样性;鉴定时仅以单一的生化或其他表型作为判别依据存在很大的局限,需辅以分子生物学手段加以鉴别.
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非脱羧勒克菌YT-1107生理生化特性研究及16S rRNA序列分析
目的 菌株YT-1107是一株从污染食物中分离得到的非脱羧勒克菌,对其进行生理生化特性研究及16S rRNA序列分析确定其归属.方法 根据流行病学调查及临床表现,选择疑似病原菌,用ATB微生物自动鉴定系统对采集的样品进行病原菌分离与鉴定.对菌株的16S rRNA基因测序结果进行同源性分析,采用MEGA4.0软件的Neighbor-Joining方法构建系统发育树.结果 对该菌株生理生化特征的研究及16S rRNA序列分析表明,该菌株是革兰阴性菌,属于Enterobacter asburiae.结论 通过16S rRNA基因序列的同源性比对,系统进化树的构建,初步认定菌株YT-1107与Enterobacter asburiae LF7a为同一物种.
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一株产H2S单核细胞增生李斯特菌的鉴定
单核细胞增生李斯特菌(Lm)是一种重要的食源性致病菌和人畜共患病致病菌.国内外的检验方法中均把产H2S的可疑Lm判为非Lm.
关键词： 单核细胞增生李斯特菌 毒力基因 16S rRNA 血清型 -
《中国药典》中蕲蛇饮片分子鉴定方法的研究和探讨
目的:运用多种分子鉴定方法,从技术要求和标准编写方面对蕲蛇饮片现行质量标准提出建议.方法:本研究选取蕲蛇所在蝰科Viperidae蝮亚科Crotalinae的7个近缘物种和9种常见的蕲蛇伪品物种作为研究对象,采用DNA条形码技术扩增16S rRNA序列,运用电泳检视法,根据扩增条带的有无评价模板DNA的质量;16S rRNA序列扩增产物通过双向测序,运用BioEdit软件拼接,双端对齐后剪切比对,利用MEGA 5.1软件构建邻接(NJ)系统发育树;采用蕲蛇饮片现行标准方法进行同步鉴别.结果:16SrRNA序列的电泳检视结果可有效评价蕲蛇样品的模板DNA质量,避免由于模板DNA质量不佳导致的假阴性结果的可能性;基于16S rRNA条形码序列建立的NJ树可以鉴别蕲蛇饮片及其混淆品;蕲蛇饮片现行标准方法专属性良好.结论:DNA条形码方法、现行标准方法以及NJ树三者相互结合,从不同角度对蕲蛇饮片进行真伪鉴别,有效弥补蕲蛇饮片现行标准方法的不足,为其他中药品种的分子鉴定技术的质量标准制定提供了参考.
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糖耐康对T2DM大鼠ZDF肠道菌群结构的影响
目的:研究自发性2型糖尿病(T2DM)大鼠ZDF(Zucker diabetic fatty) (fa/fa)与ZDF(fa/+)及经糖耐康干预后,ZDF(fa/fa)肠道共生细菌菌群结构的变化.方法:将6只雄性ZDF(fa/+)大鼠设为正常组,雄性ZDF(fa/fa)大鼠18只(不同日随机血糖均值≥11.1 mmol· L-1)设为T2DM成模组.根据体重及随机血糖(RBG)随机分为3组,分别为模型组(生理盐水10 mL·kg-1),糖耐康高、低剂量(糖耐康3.24,0.81 g·kg-1)组,每组6只.给药6周后取材,腹主动脉取血检测大鼠空腹血糖(FPG)及空腹血清胰岛素(FINS);收集大鼠肠道内粪便,行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),通过扩增子焦磷酸测序分析16S rRNA V4区菌群的改变.结果:与模型组比较,糖耐康高、低剂量组大鼠FPG,FINS有显著改善(P＜0.01).各组大鼠在菌群丰度多样性及结构组成上有显著差异.在科及以下水平上,与正常组比较,模型组乳酸杆菌明显升高(P＜0.05);与模型组比较,糖耐康高、低剂量组乳酸杆菌丰度有所下降,但无统计学差异,普雷沃氏菌丰度显著升高(P＜0.01),且普雷沃氏菌属与ZDF大鼠FINS呈正相关.结论:ZDF(fa/fa)与ZDF(fa/+)大鼠在肠道菌群结构上有很大差异,糖耐康对ZDF大鼠血糖的改善作用可能是通过影响ZDF大鼠肠道中乳酸杆菌、普雷沃氏菌的丰度实现.
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寒凝血瘀证大鼠的肠道菌群变化与粪便代谢特征分析
目的:探讨寒凝血瘀状态下大鼠肠道菌群多样性及粪便中内源性代谢物的变化,并考察与寒凝血瘀证密切相关的肠道菌群、代谢物、代谢通路.方法:采用冰水浴诱导的大鼠寒凝血瘀证模型,利用16S rRNA基因测序技术联合UPLC-TOF-MS的粪便代谢组学技术,将扰动的肠道菌群与内源性生物标记物进行关联分析.结果:基于Illumina MiSeq平台,发现与空白组大鼠相比,寒凝血瘀证模型组大鼠中Firmicutes显著上调(P＜0.05),Bacteroidetes显著下调(P＜0.01),显著差异的属有23个.确定了7个与寒凝血瘀证相关的粪便代谢物,涉及到的3个相关性强的代谢通路,分别为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,泛酸和辅酶A生物合成,组氨酸代谢.另外,肠道菌群的属与粪便代谢物有强相关性.结论:16S rRNA的高通量基因测序技术与代谢组学技术的联用可用于评价寒凝血瘀证的病理机制.
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中药饮片耐热菌微生物类群的分析
探索污染中药饮片的耐热菌微生物组成和多样性特征.以9个品种中药饮片为研究对象,采用MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱技术和Illumina Miseq的16S rRNA宏基因组高通量测序技术对样品的耐热菌微生物群落进行分析.茎类饮片(鸡血藤、通草、小通草)的污染菌检出率高,种类多;而果实类饮片(南五味子)检出率低,污染菌种类少;根类饮片中,广山药和熟地黄的污染菌检出率和种类偏低.耐热菌微生物类群以芽胞杆菌科和类芽孢杆菌科为主;其中检出率高的菌属为芽孢杆菌属,还包括短小芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、土壤芽胞杆菌属,高通量测序注释的其他菌属为肠杆菌属、短波单胞菌属、明串珠菌属、甲基杆菌属、脱氯单胞菌、泛菌属、克雷伯菌属和欧文氏菌属等.中药饮片的耐热菌微生物群落潜在危害因子,应完善其微生物限度标准,严格控制产品中的致病菌,加强中药饮片在生产和流通环节的监督管理.
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慢性萎缩性胃炎患者腻苔优势菌群组成及E-黏附因子和细胞间黏附因子-1的水平
目的 分析慢性萎缩性胃炎患者腻苔优势菌群类型及下游黏附因子的变化情况.方法 实验分为3组:慢性萎缩性胃炎患者腻苔组(30例)、慢性萎缩性胃炎患者非腻苔组(30例)和健康对照苔组(30名,均为薄白苔).采用巴氏染色法观察舌苔脱落细胞形态学特征;采用16S rRNA基因测序技术对舌苔的菌群进行研究;运用ELISA对各组舌苔进行E-黏附因子和细胞间黏附因子-1(ICAM-1)检测.结果 (1)舌苔脱落细胞形态特征:腻苔组的细胞形态较小,胞浆呈橘红色,细胞核较模糊或已消失;非腻苔组中细胞多呈圆形或椭圆形,胞浆呈橘红色,细胞核大多固缩;(2)舌苔微生物菌群:属分类水平上相对丰度较高的物种依次是链球菌属、奈瑟氏菌属、普氏菌-7属、韦荣球菌属、莫氏杆菌属、纤毛菌属.健康对照组的链球菌属含量高于其他两组(P＜0.01);奈瑟氏菌属3组之间没有明显差异;普氏菌-7属腻苔组较其他两组明显下降(P＜0.01);韦荣球菌属非腻苔组较其他两组明显增加(P＜0.05);莫氏杆菌属在腻苔组明显较其他两组增加(P＜0.01);(3)舌苔液中E-黏附因子和细胞间黏附因子-1表达腻苔组较其他两组明显增加(P ＜0.05,P＜0.01).结论 慢性萎缩性胃炎患者不同类型舌苔中的微生物优势菌属大致相同,但腻苔组患者舌苔中微生物的优势菌属(链球菌属、普氏菌-7属和莫氏杆菌属)含量发生变化,下游的E-黏附因子和细胞间黏附因子-1在腻苔组患者中高表达,说明这些物质可能与腻苔的形成有密切关系.
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细菌性阴道病患者阴道茵群特征的非培养分析
细菌性阴道病( bacterial vaginosis,BV)是一种阴道菌群失调所致的常见病,许多阴道菌群为厌氧菌,培养条件要求苛刻,很难纯培养和分离鉴定.本研究旨在通过非培养方法,明确BV患者阴道菌群特征.根据Amsel标准和Nugent评分筛选BV患者和健康育龄期妇女各30例,提取细菌基因组DNA,构建细菌16SrRNA基因文库.同时,应用特异性PCR方法扩增标本中的阴道加德纳菌、阴道阿托波菌、乳酸杆菌等8种阴道常见细菌,比较两组间各菌种的检出率.结果显示:BV患者阴道分泌物涂片以革兰染色不定或阴性的小球杆菌为主,并形成特征性的线索细胞.特异性PCR显示,BV患者阴道加德纳菌、阴道阿托波菌、普雷沃氏菌属、纤毛菌属、巨球菌属和羞怯动弯杆菌的检出率显著高于健康人群,而卷曲乳酸杆菌检出率显著低于健康人群,差异有统计学意义.文库构建显示BV患者菌群构成呈多样化,个体差异明显,共检出34种细菌,克隆子百分比排列在前5位是:Gardnerella vaginalis( 23.0％),Prevotella species( 18.57％),Megasphaera species( 14.3％),Leptotrichia species( 10.57％),Atopobium vaginae(6.4％).与之相比,健康人群阴道菌群构成单一,以卷曲乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌为主.结论:BV患者阴道菌群表现为乳酸杆菌显著减少甚至缺失,而以阴道加德纳菌、阴道阿托波菌、普雷沃氏菌属、纤毛菌属和巨球菌属占优势,同时多种其他厌氧致病菌共存的病态表现.而健康育龄期妇女阴道分泌物菌群表现为以乳酸杆菌占绝对优势、尤以卷曲乳酸杆菌为主、同时多种细菌共同存在的一种稳态.
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用16S rRNA基因序列分析从西藏的微小牛蜱中检出的埃立克体
用埃立克体属特异性套式PCR和DNA序列测定从西藏微小牛蜱检出边缘无形体和埃立克体;用半套式PCR扩得该埃立克体的16S rRNA基因,并测定了它的序列;将该埃立克体的16S rRNA基因序列与其它埃立克体的16S rRNA基因序列进行对比分析,结果证明它的16S rRNA基因与埃立克体属的犬埃立克体群16S rRNA基因相似水平高(97%～98%);用16S rRNA基因序列做系统发育分析,结果显示该采自西藏的微小牛蜱的埃立克体可能是与查菲埃立克体密切相关的一种新埃立克体.
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母婴感染单增李斯特菌16S rRNA检测及RAPD指纹图谱研究
目的 研究母婴感染的单增李斯特菌分子生物学特性,并对其进行同源性分析,为流行病学调查提供参考.方法 取母婴的血液等临床标本,做常规细菌培养及染包检查,使用VITEK2 Compact全自动微生物分析仪进行鉴定,采用K-B纸片扩散法做药敏试验.提取分离菌的基因组DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA片段,同收后测序,与GenBank中收录菌株的16S rRNA基因序列进行BLAST序列同源性比对.从200条随机引物中筛选10条随机引物(P1-P10),采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对分离菌DNA进行电泳图谱的同源性分析.结果 分离菌经常规鉴定为威氏李斯特菌.药敏试验显示分离菌氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、青霉素、红霉素、万古霉素、复方新诺明、利福平、左氧氟沙星、庆大霉素、环丙沙星均敏感,对头孢曲松与头孢他啶均耐药.PCR扩增分离菌16S rRNA全序列为1 471 bp,经BLAST序列比对,与F2365菌株的同源性达99.4％,确定为单增李斯特菌.RAPD指纹图谱表明10条随机引物中有5条引物扩增的电泳图谱带型一致.结论 16S rRNA序列分析技术及RAPD指纹图谱分析表明母婴感染的单增李斯特菌株间同源,对母婴感染的预防与诊治有重要意义.
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新型洛菲不动杆菌的分离与鉴定
目的 对从呼吸道感染的分泌物中分离的1株革兰阴性球杆样细菌进行研究,探讨其种系发生及分类学特征.方法 利用形态、生理、生化特性等表型性状进行初步鉴定,通过细菌16S rRNA基因测序及基因比对明确其种系来源.结果 分离菌为革兰阴性球杆状菌,生化反应不活泼,对环丙沙星耐药；BLAST序列比对显示该分离菌与洛菲不动杆菌的相似度为99.2％,与洛菲不动杆菌标准株不同的是在底物利用试验上有8项结果存在差异.结论 根据表型性状和种系发生结果证实该菌为洛菲不动杆菌,鉴于该菌株与模式株在生化特性方面存在一定差异,初步考虑该菌株为洛菲不动杆菌的新亚型.
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老年肺感染患者痰液中类香菌新种的分离与鉴定
目的 对分离自呼吸道感染患者痰液的1株革兰阴性杆状细菌进行鉴定,探讨其种系发生及分类学特征.方法 分别从形态、生理、生化特性等表型性状对分离菌做出初步鉴定,并通过细菌16S rRNA基因测序及序列比对明确其种系来源. 结果 分离菌株为革兰阴性小杆菌,生化反应极不活泼,对多数常用抗生素和化学疗剂不敏感；Blast序列比对显示该分离菌和海洋类香菌的相似度为96.2％. 结论 根据表型性状和种系分析发生结果证实该菌株为类香菌属的一个新菌种.
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首次从前列腺液中分离到坎皮纳斯类芽胞杆菌
目的 对分离自慢性前列腺炎患者前列腺液中的一株棒状样细菌进行多相分类学研究,确定其系统发生位置及分类学特征. 方法 利用形态、生理和生化特性等表型性状初步鉴定细菌,通过基因测序及比对明确其种系来源.结果 分离、培养出革兰阳性棒状样杆菌,可形成芽胞；生化反应不活泼；BLAST序列比对显示,该分离株与坎皮纳斯类芽胞杆菌(Paenibacillus campinasensis)菌株324T的16S rDNA序列相似度为99.4％,仅存在9个核苷酸差异. 结论 从表型性状和种系发生结果可证实该菌为坎皮纳斯类芽胞杆菌.鉴于其与模式株在生化特征方面存在显著差异,初步考虑该菌株是坎皮纳斯类芽胞杆菌的新亚型.
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应用16S rRNA基因序列分析技术鉴定临床非典型细菌的研究
目的 将16S rRNA基因序列分析技术应用于传统方法鉴定可靠率低或无法鉴定细菌的分类鉴定,以提高临床诊断的准确性. 方法 以本院微生物实验室保存的5株标准菌株验证实验方法的准确性后,收集实验室常规方法不能鉴定或鉴定可靠性低的临床分离菌15株(包括革兰阳性球菌,革兰阳性杆菌及革兰阴性杆菌),提取DNA模板,以通用引物PCR扩增16S rRNA目的片段后测序,将测序结果在GenBank数据库中比对分析以确定菌种. 结果 15株实验细菌中有14株(占93.3％)鉴定到种,包括鼻疽诺卡菌,大肠埃希菌,阿尔莱特葡萄球菌,脆弱拟杆菌,弗氏柠檬酸杆菌,短小芽孢杆菌,河流漫游球菌,极小短小杆菌,伴放线凝聚杆菌,毗邻颗粒球菌;1株菌鉴定到属(占6.7％),归属于短状杆菌属. 结论 16S rRNA基因序列分析技术具有准确、快速和方法简便的特点,适用于对临床非典型菌、少见菌以及新型细菌的鉴定,可作为细菌常规鉴定手段的必要补充.
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人感染藤黄短小杆菌的分离与鉴定
目的 研究从患儿颌下淋巴结穿刺脓液中分离的纯G+棒状样杆菌的生物学地位.方法 常规方法分离培养细菌,并做生化反应.提取细菌DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳回收目的基因并测序.结果 分离菌的一般生物学特性与生化反应与藤黄短小杆菌基本相同,16S rRNA基因长1 387 bp,与藤黄短小杆菌16S rRNA 基因相似度达99.7%.结论 通过生化反应和16S rRNA基因的序列测定确定此菌为藤黄短小杆菌,初步认为是藤黄短小杆菌的新亚型.
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新疆石河子地区绵羊嗜吞噬细胞无形体的检测和16S rRNA序列分析
目的 调查新疆石河子地区绵羊嗜吞噬细胞无形体感染状况以及分析其病原16S rRNA序列特征.方法 在石河子地区采集羊血,提取DNA,巢式PCR扩增16S rRNA基因并与GenBank中相应基因序列进行比对分析.结果 在109份羊血样本中,检测出阳性样本37份,阳性率为33.94％,检测出的16S rRNA(524 bp)基因序列与部分GenBank中嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列同源性达99％.结论 新疆石河子地区绵羊中存在嗜吞噬细胞无形体的感染.
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反相高效液相色谱法和16S rRNA 序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的比较研究
目的 比较反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和 16S rRNA序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的异同.方法 将<伯杰细菌鉴定手册>中载入的 49 种分枝杆菌模式株接种于改良罗氏培养基上,置于适温度下孵育.挑取生长良好且无污染的培养物,一部分经皂化和酸化提取分枝菌酸并衍生后,采用反相高效液相色谱法进行分枝菌酸指纹图谱构建;另一部分经裂解和 PCR 扩增,获得 DNA,纯化后,采用核酸分析仪进行 16S rRNA 序列测定.结果 49 种分枝杆菌模式株中,采用 RP-HPLC 分析时,单簇峰的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和胃分枝杆菌,双簇峰的爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌,三簇峰的南非分枝杆菌和母牛分枝杆菌共 7 种因各组内相对保留时间和相对峰高比值相近而难以进行鉴别;采用 16S rRNA 序列分析法分析时,产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、龟亚分枝杆菌和龟脓分枝杆菌以及结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌)共 12 种因各组内基因序列相似性百分比为 100% 而难以进行鉴别.通过两种分型鉴别方法的比较,可见除结核分枝杆菌和牛分枝杆菌外,两种分型方法相互补充,可将 49 种分枝杆菌模式株中的 47 种进行明确鉴别.结论 分枝菌酸 RP-HPLC 和 16S rRNA 序列分析法均为分枝杆菌的分型鉴定提供了准确和有效的技术方法.两种方法相互借鉴能准确地将大多数分枝杆菌鉴定到种.
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从一例多细菌协同性坏疽的标本中分离到罕见芽孢杆菌
目的 确定从一例多细菌协同性坏疽患者临床标本中分离的、使用常规方法不能够鉴定的YP菌株的分类学位置.方法 使用16S rRNA序列分析和同源性检索方法,及细菌的形态学和生化反应鉴定方法.结果 YP菌株为革兰氏阳性杆菌,可在厌氧和有氧条件下生长,在LB琼脂上有氧条件下培养48h后产生端生芽孢.触酶阳性,无动力,硝酸盐还原.在PYG肉汤中的代谢产物主要为乙酸、乳酸以及少量的琥珀酸和异戊酸.G+C mol%为33.16S rRNA 序列分析和同源性检索发现YP 和芽孢杆菌一些种的同源性较高,可达96%.但和已经发表的芽孢杆菌属的细菌种有明显区别.结论 YP菌株在分类学上应该属于芽孢杆菌属,但是和芽孢杆菌属已经发表的种都不相同,可能是一个新种.
