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微小RNA-1慢病毒载体介导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究
目的 通过微小RNA-1(microRNA-1,miR-1)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC),探讨miR-1对MSC向心肌细胞分化的影响.方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠MSC并进行流式细胞学鉴定;构建表达miR-1慢病毒载体;将miR-1慢病毒载体转染大鼠MSC(MSCmiR-1)连续培养15 d,光镜下观察转染后细胞形态,分别于0、4、6、15 d qRT-PCR检测miR-1、心肌相关基因锌指结构蛋白(GATA-4)、肌钙蛋白I(cTnI)、α肌动蛋白(α-actin)的表达;免疫荧光观察cTnI的表达;Western blot检测α-actin的表达.结果 原代大鼠MSC呈长梭形、漩涡状生长,流式细胞学检测显示,98%以上细胞表达CD44和CD29,不足1%细胞表达CD45;成功构建miR-1重组慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/μl;转导miR-1后,MSCmiR-1高表达心肌特异性相关基因GATA-4、α-actin、cTnI,并随时间逐渐增强,转染4 d免疫荧光检测可见cTnI在部分MSCmiR-1中表达,于15 d时表达强,Western blot进一步证实了α-actin在MSCmiR-1中表达.结论 转导miR-1至大鼠MSC中可促使其向心肌样细胞的分化.
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慢病毒介导的P38丝裂原活化蛋白激酶短发夹环改善醛固酮过负荷大鼠心肌梗死后的心脏功能
目的 探讨慢病毒介导的P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)短发夹环RNA(shRNA)对醛固酮过负荷大鼠心肌梗死(心梗)后心功能的影响并探讨其机制. 方法 制作醛固酮过负荷大鼠心梗模型,构建慢病毒P38MAPK shRNA(PGLV-shRNA)测序鉴定并经尾静脉注射,超声评价心功能,检测心肌细胞凋亡、P38MAPK mRNA、蛋白及Caspase-3蛋白的表达. 结果 假手术组、PGLV空载组和PGLV-SH RNA组细胞凋亡指数分别为(15.20±2.18)％、(31.26±4.45)％和(22.35±3.59)％；醛固酮过负荷大鼠心梗后心脏收缩功能显著降低,伴随心肌细胞凋亡增加、P38MAPK mRNA、蛋白及caspase-3蛋白表达上调(P＜0.01).PGLV-shRNA明显改善心梗后的心脏功能,减少心肌细胞凋亡P38MAPK mRNA、蛋白及caspase-3表达(P＜0.05). 结论 醛固酮过负荷大鼠心梗后心脏功能降低与P38MAPK信号通路介导的心肌细胞凋亡相关,PGLV-shRNA抑制细胞凋亡,改善心梗后的心脏功能.
关键词： p38丝裂原活化蛋白激酶 慢病毒属 心肌梗死 -
过表达叉头状转录因子O1对高糖下足细胞氧化应激的影响及机制
目的 研究过表达叉头状转录因子O1(FoxO1)对高糖条件下小鼠足细胞及线粒体功能的影响及机制.方法 分别采用过表达FoxO1的慢病毒(LV-CA-FoxO1)和空病毒(LV-NC)感染条件永生性小鼠肾足细胞,在不同糖浓度(正常糖5.5 mmol/L、高糖25.0 mmol/L)下培养72 h.实验分为正常糖组、高糖组、FoxO1组(高糖+LV-CA-FoxO1)和NC组(高糖+LV-NC)共4组,分别检测各组细胞FoxO1表达情况、线粒体及细胞功能指标.多组间比较采用方差分析,组内比较采用SNK法.结果(1)与高糖组比较,FoxO1组FoxO1转录活性增加[(0.94±0.06)比(2.72±0.27),q=3.77,P<0.05];活性氧簇和丙二醛量减少(q=9.22、2.44,均P<0.05),线粒体膜电位上升,线粒体结构损伤减轻;(2)FoxO1组较高糖组足细胞蛋白nephrin、podocin和podocalyxin表达增加(q=2.18、5.87、5.65,均P<0.05),单层屏障功能改善,凋亡率下降(q=6.96、8.99,均P<0.05);(3)FoxO1组较高糖组中PTEN诱导激酶1(PINK1)、parkin mRNA水平上升,线粒体动力相关蛋白1 mRNA下降(q=1.46、7.50、1.89,均P<0.05).与高糖组比较,FoxO1组PINK1蛋白表达水平上升(q=2.36,P<0.05).NC组与高糖组各项指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 过表达FoxO1可减轻高糖诱导的小鼠足细胞线粒体及细胞功能损伤,可能通过激活PINK1/parkin途径实现.
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RNA干扰靶向敲减ObR基因对MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长的影响
目的 探讨瘤内注射慢病毒介导的瘦素受体的特异性ObR- siRNA对MCF-7人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法 建立荷MCF-7人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型,共30只,随机分为3组:ObR-siRNA慢病毒干预组、NC- siRNA阴性慢病毒对照组和空白对照组,同时在肿瘤部位周围皮下注射重组人瘦素.隔日测量并记录移植瘤的大小,Real-time PCR和Western blotting方法检测ObR的mRNA和蛋白水平的表达,测量肿瘤体积,计算肿瘤抑制率.结果 成功建立了具有高瘦素微环境的敲减ObR基因的荷MCF-7人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型.ObR- siRNA慢病毒干预组裸鼠移植瘤的体积与NC- siRNA阴性慢病毒对照组和空白对照组差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01).ObR- siRNA慢病毒干预组中的ObR的mRNA和蛋白水平的表达明显降低,相对NC- siRNA阴性慢病毒对照组和空白对照组差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01),其抑瘤率为88％.结论 利用慢病毒载体成功将ObR-siRNA导入移植瘤内,且能显著抑制MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长,提示瘦素受体有可能成为乳腺癌基因治疗的靶点.
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慢病毒介导SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型建立
背景:沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)基因是一个与衰老关系密切的基因,可以通过调节PI3K/AKT、NF-κB等信号通路影响到组织及机体的衰老过程,并参与骨科相关疾病的发生发展.建立慢病毒介导的SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型,可以为研究SIRT1基因相关的骨科系统疾病如骨关节炎、骨质疏松症等提供实验基础.目的:构建携带小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒载体,将其转染ATDC5细胞系,建立SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型.方法:根据RNAi序列设计原则设计并合成SIRT1基因的RNAi靶点序列,连接GV248(框架结构:hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)载体,转化后经阳性克隆测序及PCR鉴定,质粒抽提后导入293T细胞,包装慢病毒,取上清检测滴度.将含有小鼠SIRT1基因RNAi的病毒颗粒转染ATDC5细胞系,并于荧光显微镜下进行观察,行RT-PCR检测ATDC5细胞中SIRT1 mRNA的表达情况.结果:经测序、PCR检测可知,SIRT1基因的RNAi靶点序列与GV248载体连接成功,并包装成高滴度的慢病毒.携带小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒感染ATDC5细胞后,荧光显微镜下观察显示感染率较高,RT-PCR检测发现,携带SIRT1基因的慢病毒感染组SIRT1基因mRNA的相对表达量为0.386±0.117,与阴性对照病毒感染组相比有统计学差异(P<0.05),敲减效率为61.4%.结论:成功建立SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型,为研究SIRT1基因相关骨科系统疾病提供实验基础.
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体外利用慢病毒介导BMP-2基因诱导兔滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化
目的 使用慢病毒介导兔BMP-2基因转染兔滑膜间充质干细胞(SMSCs),检测其安全性,并在体外定向诱导至软骨细胞.方法 通过构建包含BMP-2基因的慢病毒载体,转染SMSCs后行安全性分析;各项检测和MicroRNA分析判断转染后的SMSCs是否进入软骨细胞分化谱系.结果 贴块法获得的SMSCs在经分离纯化后,表现出间充质干细胞应有的结构和表面标志物,具有多向分化潜能.增殖动力学、核型分析、致瘤型分析等证实被慢病毒转染的SMSCs安全.Western blot、免疫荧光等证实且能稳定表达BMP-2蛋白.14 d后,免疫组化、MicroRNA检测等证实在不需外加外源性BMP-2的体外环境下SMSCs可自发向软骨细胞分化.结论 经重组慢病毒载体感染的兔SMSCs足够安全,能稳定表达BMP-2,体外能自发向软骨细胞分化.
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人骨形态蛋白-2可调控系统在大鼠骨髓间充质干细胞的表达
目的 构建携带四环素真核诱导表达系统(Tet-on)调控的人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞.方法 设计目的基因hBMP-2引物,将扩增纯化的目的基因hBMP-2定向克隆至携带Tet-on的慢病毒GV347载体上并测序鉴定产物.hBMP-2-GV347质粒、空载的GV347质粒分别与辅助质粒共感染293T细胞以收获慢病毒浓缩液.用hBMP-2-GV347慢病毒转染大鼠BMSCs,得到hBMP-2阳性表达细胞,探索转染佳感染复数(MOI).用CCK8法比较BMSCs转染前后的增殖活性;强力霉素(DOX)诱导打开Tet-on,real-time PCR、Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况.结果 PCR后得到目的基因hBMP-2,定向克隆至携带Tet-on系统调控的GV347质粒上,经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的hBMP-2-GV347质粒.hBMP-2-GV347质粒与空载GV347质粒分别感染293T细胞后获得hBMP-2-GV347慢病毒浓缩液.在DOX诱导下,hBMP-2-GV347慢病毒载体在293 T细胞内表达BMP-2蛋白.hBMP-2-GV347慢病毒载体转染佳MOI值为9,且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强,并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA.结论 本研究成功构建携带Tet-on系统调控hBMP-2慢病毒表达载体,转染BMSCs后在DOX调控下可持续高效表达BMP-2蛋白.
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LIM 矿化蛋白1慢病毒载体转染后大鼠骨髓基质干细胞的分化
目的：探讨慢病毒转染大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）过表达LIM矿化蛋白1（LMP－1）对BMSCs分化能力的影响。方法构建LMP－1基因慢病毒载体，转染原代培养的大鼠MSCs，荧光显微镜下观察转染效果，MTT法检测转染后细胞增殖，常规方法诱导过表达LMP－1的BMSCs成骨和成软骨分化，以免疫组织化学染色观察成骨诱导后细胞分泌骨钙素的情况以及用阿利新蓝染色鉴定成软骨诱导后细胞分泌氨基多糖的情况。结果感染复数（ MOI）值为12时即可获得良好的转染效果，细胞转染后增殖正常，成骨诱导后，骨钙素染色阳性；成软骨诱导后，阿利新蓝染色阳性。结论lv－lmp－1可以有效转染大鼠BMSCs，转染后细胞的多向分化能力没有受到影响。
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慢病毒介导CCL5-siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨CCL5-siRNA对高转移性人乳腺癌细胞生物学行为的影响.方法 合成特异性CCL5-siRNA并克隆入慢病毒表达载体pGCSIL-GFP,将重组CCL5-siRNA慢病毒感染高转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231设为KD组,另设阴性对照组和未感染组;分别采用实时定量聚合酶链反应和Western blot方法检测CCL5-siRNA对CCL5表达的作用;用噻唑蓝比色法、流式细胞术、克隆形成试验和Boyden小窒穿透试验观察细胞的增殖、周期、体外聚集和侵袭力的改变.结果 CCL5-siRNA慢病毒可显著降低MDA-MB-231细胞CCL5的表达,改变细胞形成克隆和运动侵袭的能力,但对细胞增殖的影响不明显.与阴性对照组(1.00±0.07)和未感染组(0.88±0.15)比较,KD组细胞CCL5 mRNA的表达下降为(0.18±0.03),P<0.01.在上样量相同的条件下,与阴性对照组(1.82±0.18)比较,KD组CCL5蛋白表达降低为(0.33±0.13),P<0.01.细胞克隆计数:与阴性对照组(0.97±0.09)和未感染组(1.04±0.07)比较,KD组细胞的克隆数降为(0.33±0.10),P<0.05;穿膜细胞计数:KD组(38±15)明显少于阴性对照组(77±11)和末感染组(69±9),P<0.05.嚷唑蓝比色实验和流式细胞分析提示:KD组细胞的增殖情况与阴性对照组、未感染组相比无明显差别.三组PI值分别为0.48±0.02、0.44±0.05及0.47±0.02(P>0.05).结论 慢病毒介导的CCL5-siRNA可显著抑制高转移性人乳腺癌细胞的克隆形成和运动侵袭能力,但对其增殖活性无明显影响.
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CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果
目的 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系(HaCaT),筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果.方法 用CaCl2法将已构建好的3种pHSER-CCL20-shRNA-GFP载体(pHCG-1和pHCG-2为CC120基因特异性,pHCG-3为CCL20基因错配)转染293FT包装出慢病毒颗粒,流式细胞术测定其病毒滴度.用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT,荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测CC120基因mRNA和蛋白的表达水平,以判断其特异性干扰效果.结果 三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7.08×105转导单位(TU)/ml、1.88×105TU/ml和2.08×105TU/ml;感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周,获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆(HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4)及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆(HaCaT-5和HaCaT-6).经荧光定量PCR和ELISA法检测显示,4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果,不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达(其抑制率分别为81.0%、89.0%、81.3%、77.2%),而且明显地减少CCL20蛋白分泌(其抑制率分别为70.0%、86.1%、88.1%、90.7%).结论 采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆,将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞.
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人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-Cx43的构建及鉴定
目的构建人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-Cx43,为研究连接蛋白Cx43在心肌细胞间通讯、心脏胚胎发育及心肌细胞分化中的作用机制提供物质基础.方法从质粒p18-T上用限制性内切酶BamH1、Xho1切下Cx43 cDNA片断,进行琼脂糖电泳,割胶回收纯化;限制性内切酶BamH1、Xho1酶切质粒pENTR11,将线形化的载体与回收的Cx43 cDNA片断用T4 DNA连接酶连接,测序后通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中.结果凝胶电泳和测序结果均证明已将人类Cx43 cDNA克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中.结论成功构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-Cx43.
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慢病毒转染自杀基因后联合更音洛韦治疗卵巢上皮性癌的实验研究
目的探讨以抗Ⅰ型粘蛋白单链抗体(anti-MUC1)为靶向的慢病毒高效转染自杀基因后联合更昔洛韦(GCV)对Ⅰ型粘蛋白阳性(MUC1+)卵巢上皮性癌细胞的靶向性基因治疗.方法包装以anti-MUC1为靶向的慢病毒,介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染卵巢上皮性癌细胞株SKOV3(MUC1+)及正常成纤维细胞GF(MUC1-),荧光显微镜下观察转染效果.聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术鉴定HSV-tk基因在靶细胞(SKOV3及GF)中的整合转录结果.光学显微镜观察GCV作用后细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定GCV的体外杀伤效应.结果荧光显微镜下观察到以anti-MUC1为靶向的慢病毒可有效转染SKOV3细胞,PCR、RT-PCR均证明HSV-tk基因已在靶细胞SKOV3中整合且转录表达;而在GF细胞中未见HSV-tk基因的整合及转录表达.光学显微镜下观察到HSV-tk基因转录后的细胞在GCV作用后出现明显形态变化;MTT法显示GCV对转染HSV-tk基因后的SKOV3细胞有显著杀伤作用,其半数抑制浓度为0.10 mg/L.结论以anti-MUC1为靶向的慢病毒可将HSV-tk基因高效、靶向性转染MUC1+卵巢上皮性癌细胞,联合应用GCV可高效、靶向性杀伤MUC1+卵巢上皮性癌细胞.
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重组慢病毒介导的OPCML基因的体外转导及其对卵巢上皮性癌细胞的抑制作用
目的探讨重组慢病毒介导的体外转导OPCML基因的可行性及其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的抑制作用.方法采用PCR技术,用基因特异性引物将OPCML基因的cDNA从CD1小鼠脑组织中扩增,并将OPCML基因克隆到慢病毒载体表达质粒pWPI-GFP上,构建慢病毒载体表达质粒pWPI-OPCML;将pWPI-OPCML或pWPI-GFP(空载体对照)质粒和包装质粒pCMVdR8.74、pMDG共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OPCML和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒WPI-OPCML或仅携带GFP基因的重组慢病毒WPI-GFP;用重组慢病毒WPI-OPCML和WPI-GFP分别转导靶细胞,即人卵巢癌细胞系A2780、OCC1细胞和小鼠正常卵巢上皮细胞系CD1细胞,以未转染任何基因者为空白对照.通过细胞增殖实验、细胞聚合力实验、细胞周期分析和体内成瘤实验观察OPCML基因对卵巢癌细胞的抑制作用.结果(1)OPCML基因能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞,转导效率几乎达100%,并稳定表达;蛋白印迹法检测显示,靶细胞中OPCML和GFP蛋白均有表达.(2)细胞增殖实验显示,A2780细胞中,转导OPCML基因72 h后的A2780/OPCML细胞为(7.6±1.0)×105个,明显少于未转导基因的A2780细胞或仅转导空载体的A2780/pWPI细胞[分别为(20.0±2.6)×105和(18.1±1.7)×105个;P＜0.01];但OCC1和CD1细胞中,OPCML基因对细胞的增殖无明显的影响(P＞0.05).(3)细胞周期分析显示,OPCML基因对A2780细胞的细胞周期有明显的阻滞作用(转导前、后G0～G1期细胞分别为67%、75%;P＜0.05),但对OCC1、CD1细胞则无明显阻滞作用(P＞0.05).(4)细胞聚合力实验显示,与空载体对照相比,OPCML基因能明显增强细胞的黏附力(P＜0.05).(5)移植瘤实验显示,将A2780/OPCML细胞注射到裸鼠皮下,4只裸鼠中仅1只裸鼠有肿瘤生长,其肿瘤重量为10 mg,显著低于注射A2780、A2780/pWPI细胞的裸鼠[各4只裸鼠均有肿瘤生长,其肿瘤重量分别为(280±53)及(677±323)mg;P＜0.01].免疫组化法检测显示,肿瘤组织中OPCML蛋白有表达.结论用重组的慢病毒载体作为转基因的工具,具有高效性,同时能使目的基因达到持续稳定的表达.OPCML基因能够增加A2780细胞的黏附能力,抑制A2780细胞的增殖和体内成瘤,提示OPCML基因可能是一个新的抑癌基因.
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应用干扰RNA慢病毒技术抑制人脑胶质瘤细胞中红细胞生成素受体mRNA的表达
目的 探讨重组红细胞生成素受体(EPOR)干扰RNA慢病毒抑制人脑胶质瘤细胞中EPORmRNA的表达情况.方法 选择人脑胶质瘤U251细胞株和人胚肾293T细胞株为研究对象.利用RNA干扰技术构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,进行病毒包装、病毒收集、病毒滴度检测后,感染人脑胶质瘤U251细胞,选择佳MOI值;采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测U251细胞和感染重组EPOR干扰RNA慢病毒的U251细胞EPOR mRNA相对表达量,并计算重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞EPOR mRNA表达的干扰效率.结果 ①本研究成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,并测定其病毒滴度为1×1014 TU/L.②MOI值为100的重组EPOR干扰RNA慢病毒感染U251细胞的荧光蛋白表达量高,MOI值为1的荧光蛋白表达量低.③重组EPOR干扰RNA慢病毒对于U251细胞的干扰效率为69％,并使EPOR mRNA表达明显受到抑制.结论 成功构建重组EPOR干扰RNA慢病毒表达载体,使U251细胞的EPOR mRNA相对表达量明显降低,为后续EPOR转录水平变化的相关研究奠定实验基础.
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慢病毒介导CXCR4 RNA干扰对胃癌细胞株SGC7901抑制作用的研究
目的:探讨介导CXCR4 RNA干扰的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒对SGC7901细胞生长、迁移和侵袭的抑制效应.方法:采用课题组前期构建的介导CXCR4 RNA干扰的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒转染SGC7901细胞,Q-PCR及蛋白质印迹法检测CXCR4 RNA和蛋白相对含量,MTS评价细胞增殖效应,Transwell小室评价CXCR4 RNA干扰对SGC7901细胞迁移和浸润能力的抑制作用.结果:Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒转染SGC7901细胞可见绿色荧光.Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组CXCR4 RNA和蛋白表达量分别为0.19±0.05和0.28,均低于阴性对照NC组的1.00±0.05和0.99(P=0.000 0)和正常SGC7901细胞组的1.09±0.09和0.97,P=0.001 8.Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组MTS A值为0.76±0.02,低于NC组(0.85±0.01,P=0.012 1)和SGC7901细胞组(0.86±0.01,P=0.008 3).迁移实验显示,Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组细胞数为61.50±7.50,低于NC组(132.00±17.86,P=0.000)和SGC7901细胞组(200.50±23.19,P=0.000).侵袭实验证实,Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒组细胞数为0,低于NC组(189.00±61.15,P=0.000)和SGC7901细胞组(266.25±50.26,P=0.000).结论:重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒介导CX-CR4 RNA干扰可抑制SGC7901细胞CXCR4 RNA和蛋白表达,抑制细胞生长,降低肿瘤细胞迁移和浸润能力.
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双自杀基因CD和TK对K562细胞体内外杀伤作用的实验研究
目的:探讨双自杀基因CD和TK对K562细胞的体内外抑制作用及前体药物对肿瘤的杀伤作用.方法:将目的基因转染入K562细胞,MTT法观察细胞在体内外的增殖状况及5-FC/GCV对转染细胞的杀伤作用,电子显微镜观察其超微结构变化.将K562/CDgly TK和K562细胞接种于裸鼠皮下,观察各种肿瘤细胞在体内的成瘤情况及对前体药物治疗的敏感性.结果:单独使用GCV或5-FC对K562及K562/CDgly TK细胞产生明显的杀伤作用,联合应用该2种药物对肿瘤细胞的杀伤作用更强.将K562细胞和K562/CDglyTK细胞接种于小鼠皮下后小鼠成瘤率为100%,GCV或5-FC可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成,联合应用GCV和5-FC治疗K562/CDglyTK细胞在小鼠体内形成的肿瘤,较单独应用GCV和5-FC及对照组小鼠形成的肿瘤体积明显缩小,生存期也明显延长.结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有明显的抑制作用,可增加前体药物GCV和5 FC对瘤细胞的杀伤率.
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FUS1基因慢病毒载体的构建
目的:构建FUS1基因慢病毒载体,包装病毒,体外高效感染细胞.方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入慢病毒载体pSL6-IRES-EGFP中,经PCR、酶切和测序鉴定后,与包装质粒共转染293T细胞,制备慢病毒.将病毒转染BEL7404和DLD-1细胞,观察病毒转染效果.结果:经过PCR测序鉴定,克隆了pSL6-FUS1-IRES-EGFP重组子;所包装的病毒对细胞的感染效率＞90%.结论:成功地克隆FUS1基因于慢病毒载体,制备了高效感染细胞的慢病毒.
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构建携带大鼠脑红蛋白基因慢病毒载体及其目的基因高效表达
目的 构建携带大鼠脑红蛋白(rat neuroglobin,rNGB)基因的慢病毒真核表达载体pLenti6/V5-rNGB,转染293细胞,观察外源性NGB在293细胞中的表达情况.方法 应用基因重组技术,从大鼠脑组织中获得rNGB基因片段,重组到pLenti6/V5慢病毒真核表达载体上.pLenti6/V5-rNGB经病毒包装,转染至293细胞,而后行rNGB Western blot和免疫细胞化学检测.结果 PCR扩增序列为456bpNGB基因,用Xho-Ⅰ和BamH-Ⅰ进行双酶切显示NGB序列已插入pLenti6/V5慢病毒表达载体,DNA序列鉴定进一步证实插入基因片段的正确性;293细胞转染pLenti6/V5-rNGB后荧光显微镜下发出绿色荧光,证实慢病毒表达载体转入包装细胞;进一步采取Western blot方法和免疫组化方法证实rNGB在包装细胞内有效表达,而pLEGFP-NI转染的细胞只检测到NGB蛋白微弱表达,两组比较有统计学差异(相对表达量分别为25.32±1.05、0,t=-39.63,P<0.01).结论 构建的pLenti6/V5-rNGB,经病毒包装转染至293细胞,rNGB和EGFP基因在细胞内有效表达,为pLenti6/V5-rNGB治疗相关疾病的实验研究奠定了基础.
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慢病毒介导artemin基因修饰的骨髓间充质干细胞对帕金森病大鼠的治疗作用
目的 探讨慢病毒介导的artemin(ARTN)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)对帕金森病模型大鼠潜在性治疗作用及对脑内相关蛋白表达的影响.方法 分离培养大鼠MSCs,将携带ARTN的慢病毒载体转染MSCs;6-羟多巴胺(6-OHDA)制备帕金森病大鼠模型,按随机数字表法随机分为假手术(Sham)组、帕金森病组、移植MSCs(MSCs)组、移植空病毒转染的MSCs(LV-MSCs)组、移植慢病毒介导的ARTN基因修饰的MSCs (LV-ARTN-MSCs)组,对帕金森病大鼠左侧纹状体进行细胞移植;术后2、4、6、8周,腹腔注射阿扑吗啡,进行行为学检测;采用Western印迹及免疫荧光法检测各组大鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)表达变化,移植ARTN修饰的MSCs在大鼠脑组织内表达;高效液相色谱仪检测各组大鼠纹状体内多巴胺、二羟基苯乙酸、高香草酸含量.结果 LV-ARTN-MSCs组在阿扑吗啡诱发下30 min内旋转圈数(179.33±18.74)明显低于帕金森病组、MSCs组和LV-MSCs组(235.83±18.95、203.67±11.50和206.33±11.86;q=8.828,P＜0.01;q=3.802,P＜0.05;q=4.219,P＜0.05).LV-ARTN-MSCs组大鼠黑质TH阳性细胞百分比(64.05％±5.49％)显著高于帕金森病组(34.18％±3.35％)、MSCs组(52.59％±4.48％)和LV-MSCs组(50.57％±4.41％;q=13.280、5.135、6.028,均P＜0.01),黑质TH蛋白表达也明显提高,同时慢病毒介导ARTN修饰的MSCs可以在帕金森病大鼠脑内存活至少6周,主要集中在移植侧的纹状体区.细胞移植8周后,MSCs组(2.34±0.54)、LV-MSCs组(2.28±0.45)、LV-ARTN-MSCs组(6.54±0.51)与帕金森病组(0.87±0.07)大鼠相比,纹状体多巴胺表达明显提高(q =5.233,P＜0.05;q=5.020,P＜0.01;q=20.190,P＜0.01),以LV-ARTN-MSCs组明显.结论 纹状体移植慢病毒介导ARTN基因修饰的MSCs对帕金森病模型大鼠有一定的治疗作用.
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脑源性神经营养因子基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究
目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞(MSCs)移植治疗大鼠脑出血的疗效.方法 分离培养大鼠MSCs；将带有BDNF的慢病毒载体转染MSCs;RT-PCR、蛋白质印迹检测转基因MSCs BDNF基因及蛋白水平表达.制备大鼠脑出血模型,采用抽签法随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、MSCs组、空病毒转染骨髓问质干细胞(MSCs-EGFP)组、脑源性神经营养因子基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞(MSCs-EGFP-BDNF)组,每组15只.72 h后细胞移植,记录各组细胞移植后7、14、21 d神经功能缺损改善程度；免疫荧光双标检测MSCs脑内迁移和分化情况.结果 MSCs-EGFP-BDNF组BDNF基因及蛋白水平表达明显高于MSCs组及MSCs-EGFP组；与PBS组(7 d:2.0±0.4,14 d:1.7 ±0.2,21 d:1.3±0.2)相比,MSCs组(7 d:1.6±0.2,14 d:1.2 ±0.3,21 d:0.8±0.2)、MSCs-EGFP组(7 d:1.6±0.3,14 d:1.1 ±0.2,21 d:0.8 ±0.3)及MSCs-EGFP-BDNF组(7 d:1.2±0.3,14 d:0.6±0.1,21 d:0.2 ±0.2)大鼠神经功能评分均有不同程度改善(F=6.667、18.417、20.882,均P＜0.05),其中MSCs-EGFP-BDNF组改善为显著；免疫荧光双标显示MSCs-EGFP-BDNF组胶原纤维酸性蛋白、神经元特异性核蛋白、环核苷酸磷酸二酯酶阳性率明显高于MSCs组及MSCs-EGFP组,而MSCs组与MSCs-EGFP组比较差异无统计学意义.结论 BDNF基因重组慢病毒修饰的MSCs基因及蛋白水平表达均增高；修饰的MSCs移植后可迁移至脑出血灶周围存活并分化表达神经细胞标志物,促进脑出血后神经功能修复.
