首页 > 文献资料
-
串珠素shRNA慢病毒颗粒转染对小鼠胚胎成纤维细胞增殖能力的影响
目的 通过研究串珠素shRNA慢病毒转染对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)增殖能力的影响,探讨其在抑制硬膜外瘢痕形成中的作用和机制.方法培养小鼠NIH3T3,并分为3组:未转染的NIH3T3组(对照组)、GFP慢病毒颗粒转染组(GFP组)和串珠素shRNA慢病毒颗粒转染组(shRNA组).GFP组和shRNA组转染1周后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,从而判断慢病毒载体转染目的细胞所需的合适MOI值及GFP表达时间.确定慢病毒载体转染目的细胞合适的MOI值后,以此条件进行目的基因转染.用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞.分别以逆转录聚合酶链反应[RT-PCR)、Western blot及噻唑蓝(MTT)法来检测转染后细胞mRNA、蛋白质表达及细胞增殖水平的差异. 结果 RT-PCR检测表明,串珠素RNA在对照组与GFP组高表达,在shRNA组低表达,shRNA组分别与对照组和GFP组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测表明,串珠素蛋白质水平在对照组与GFP组高表达,在shRNA组低表达,shRNA组分别于对照组和GFP组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).1～2d各组吸光度值之间差异无统计学意义(P＞0.05).3～6d对照组与GFP组细胞增殖接近正常,shRNA组细胞增殖能力减弱,对照组与GFP组增殖能力明显高于,shRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 串珠素shRNA慢病毒转染可以有效抑制NIH3T3的增殖能力.
-
基于慢病毒的SHARP-2特异的RNA干扰延长肾移植受者大鼠存活时间
目的 研究SHARP-2(rat enhancer of split-and hairy-related protein-2)特异性基因沉默后对白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)基因表达及肾移植受者大鼠存活时间的影响.方法 采用基因重组、转染、共转染等分子生物学方法将针对SHARP-2的短发夹式RNA干扰序列导入到第3代自失活慢病毒载体ViraPower packaging mix,以构建重组慢病毒;有限稀释法确定病毒滴度;实时定量PCR法研究基因表达变化;原位大鼠肾移植模型研究SHARP-2基因沉默后受者存活间变化.结果 在正常大鼠肾脏细胞中,重组慢病毒LV-SHARP-2iC对SHARP-2的基因沉默效率达84%.在复感染指数(MOI)=20时,用spinoculation 法可使57%的T细胞受转染.在活化T细胞中,SHARP-2基因沉默后对IL-2和IFN-γ的基因表达抑制率分别达61.3%和68.7%.和空白对照以及随意序列对照组相比,5×10<'7>TU SHARP-2特异的RNA干扰重组慢病毒LV-SHARP-2iC灌汴供肾后,肾移植受者大鼠的中位存活时间延长4～5 d.移植肾局部组织分析发现SHARP-2基因沉默效果达61%,IL一2和IFN-γ的基因表达则分别下降了47.3%和58.2%.结论 成功构建了以第3代自失活慢病毒为载体的、针对SHARP-2基因的短发夹式RNA干扰重组病毒LV-SHARP-2iC,该体系能使SHARP-2基因表达有效沉默,进而抑制活化T细胞中与排斥相关的IL-2和IFN-γ的基因表达,在肾移植模型中延长受者大鼠存活时间.
-
BDNF对BMSCs向脑出血灶周围组织迁移的保护作用
目的 观察脑源性神经营养因子(BDNE)基因重组慢病毒转染骨髓间质干细胞(BMSCs)后,被移植入大鼠侧脑室内,向对侧脑出血灶周围组织的迁移情况. 方法 将60只脑出血模型大鼠按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、骨髓间质干细胞(BMSCs)组、骨髓间质干细胞-绿色荧光蛋白组(BMSCs-EGFP)、脑源性神经营养因子(BMSCs-EGFP-BDNF)组,每组15只.分别向侧脑室注射PBS,BMSCs,慢病毒(LV)转染的EGFP,LV转染的BDNF-EGFP,在术后7d、14d、21d采用Westen blotting检测各组BDNF在BMSCs中的蛋白表达,免疫荧光检测Brdu标记的BMSCs,EGFP及BDNF. 结果 Western blotting检测BMSCs-EGFP-BDNF组BDNF蛋白表达明显多于BMSCs组及BMSCs-EGFP组(P＜0.05);细胞爬片BMSCs-EGFP-BDNF组BDNF荧光表达明显高于BMSCs组及BMSCs-EGFP组;脑组织切片免疫荧光单标显示BMSCs-EGFP-BDNF组迁移至脑出血灶周围组织的BMSCs阳性细胞数明显多于BMSCs组及BMSCs-EGFP组(P＜0.05),BMSCs组与BMSCs-EGFP组除7d外,其余比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 基因重组慢病毒修饰的BMSCs中BDNF表达增高,提示BDNF对BMSCs向脑出血灶周围组织迁移具有保护作用.
-
人前列腺癌PC-3细胞的荧光标记及其脊椎转移动物模型的建立
目的 对人前列腺癌PC-3细胞进行绿色荧光蛋白(GFP)标记,并建立其在动物活体荧光成像系统下直接观察肿瘤生长及转移的前列腺癌脊柱转移模型.方法 常规肿瘤细胞培养、传代,在细胞状态佳时以不同病毒感染复数实行GFP慢病毒对PC-3的感染,7d后在荧光显微镜下观察GFP在PC-3的表达情况.选取感染GFP阳性表达率高的孔继续扩大培养,然后采用悬液注射于小鼠的下腔静脉,动物活体荧光成像系统下直接观察肿瘤生长及转移,3个月后处死荷瘤鼠,常规石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色观察.结果 经绿色荧光蛋白标记后人前列腺癌PC-3细胞在荧光显微镜下发出绿光,并可在体内、外持续稳定表达；下腔静脉注射1.5×106转染后的前列腺癌细胞后1周即可在活体荧光成像系统下观察到腰背部有绿色荧光显像,4周时可见表达绿色荧光的肿瘤增大,肿瘤骨转移率为19％(3/16)；3个月后解剖裸鼠可见有3只裸鼠腰椎有肿瘤浸润,与动物活体荧光成像系统结果一致,转移率约为19％ (3/16).结论 GFP慢病毒能够高效标记人前列腺癌PC-3细胞且不影响其生物学特性,并能够持久稳定表达；用绿色荧光蛋白标记的人前列腺癌PC-3细胞成功地建立了裸鼠脊柱骨转移模型,为进一步研究前列腺癌骨转移提供了一种简便、可行的新方法.
-
超级白细胞介素-6重组慢病毒的构建及其对肝细胞的促增殖作用
目的 观察超级白细胞介素-6重组慢病毒对人正常肝细胞L-02的促增殖作用.方法 利用慢病毒表达质粒及其包装系统构建超级白细胞介素-6重组慢病毒(FIV-Hyper-IL-6)、IL-6重组慢病毒(FIV-IL-6)和空慢病毒载体(FIV),用嘌呤霉素筛选的方法测定其病毒滴度.将人肝细胞L-02分为4组:FIV-Hyper-IL-6组、FIV-IL-6组、FIV组及未感染组,各组分别感染其相应的重组慢病毒,采用四甲基偶氮唑盐法检测其对L-02细胞生长状态的影响;并用RT-PCR法检测重组慢病毒感染L-02细胞后产生的急性时相蛋白一结合珠蛋白mRNA表达量的变化.应用方差分析进行统计学分析.结果 构建出的各重组慢病毒能成功感染靶细胞,嘌呤霉素筛选法测得的各重组慢病毒的病毒滴度均为107pfu/ml.病毒颗粒感染L-02细胞后48h,细胞的促增殖作用(A值)FIV-Hyper-IL-6组为0.6267±0.0256,FIV-IL-6组、FIV组及未感染组分别为0.5563±0.0112、0.5040±0.0078、0.4790±0.0201,F=41.09,P值均<0.01,且随着时间的延长,对细胞的促增殖作用有所增加,并于感染后72h达到高,为0.8000±0.0166.FIV-Hyper-IL-6组细胞结合珠蛋白mRNA吸光度值为0.7030±0.0106,FIV-IL-6组、FIV组及未感染组分别为0.3355±0.0093、0.1143±0.0153、0.1145±0.0076,q=57.5007,P值均<0.01.结论 构建的Hyper-IL-6重组慢病毒能够显著刺激L-02细胞表达结合珠蛋白,对L-02细胞有较强的促增殖作用.
-
水通道蛋白9对人肝癌细胞系HepG2增殖、凋亡和侵袭迁移的影响
目的 探讨水通道蛋白9(AQP9)对人肝癌细胞系HepG2增殖、凋亡和侵袭迁移的影响.方法 构建靶向AQP9基因的慢病毒过表达载体,转染HepG2细胞并用嘌呤霉素筛选出稳定细胞株,用激光共聚焦验证转染效率,用qRT-PCR及Western blot检测AQP9表达情况.实验分组:“CC组”为无慢病毒转染的HepG2细胞、“PWPI组”为空载体慢病毒转染的HepG2细胞,“过表达AQP9组”为含过表达AQP9基因慢病毒载体转染的HepG2细胞.利用平板克隆、划痕愈合实验、Transwell小室侵袭实验以及流式细胞仪分别检测AQP9对HepG2增殖、迁移、侵袭、凋亡以及周期的影响.多组间数据比较采用单因素方差分析,两组间数据比较采用独立样本t检验. 结果 激光共聚焦结果显示,HepG2转染AQP9后细胞膜高表达绿色荧光蛋白,qRT-PCR及Western blot检测AQP9的mRNA和蛋白质表达较其他2组均上升,差异均有统计学意义(P值均＜0.01).平板克隆结果显示,CC组、PWPI组和过表达AQP9组克隆形成率分别为23.53％±2.10％、23.00％±2.022％、16.93％±3.19％,组间比较,差异有统计学意义(F=6.46,P=0.032).流式测凋亡结果显示,CC组、PWPI组和过表达AQP9组总凋亡率分别为19.70％±2.49％、24.37％±2.38％、44.96％±3.53％,组间比较,差异有统计学意义(F=66.88,P＜0.01),与PWPI组和CC组比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.01);流式测周期结果显示,CC组、PWPI组和过表达AQP9组细胞停留在S期和G1期的细胞百分比分别为34.39％±4.33％和54.58％±0.89％;35.65％±1.39％和53.08％±2.06％;15.25％±1.81％和66.58％±0.99％,组间比较,差异均有统计学意义(F值分别为49.25和82.09,P值均＜0.01).划痕愈合实验结果显示,过表达AQP9组细胞24h的迁移率为6.38％±1.70％,与PWPI组16.74％±1.40％比较,差异有统计学意义(t=8.133,P=0.01).Transwell实验结果显示,过表达AQP9组24h穿过细胞数为(17±8)个,与PWPI组(95±11)个和CC组(109±9)个比较,差异均有统计学意义(P值均＜ 0.05). 结论 AQP9能够抑制HepG2细胞迁移和侵袭能力,诱导细胞发生凋亡并通过产生G1/S期阻滞抑制细胞增殖.
-
RNA 干扰 DC-SIGN 表达对树突状细胞成熟及功能的影响
目的 研究慢病毒介导RNA干扰树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin,DC-SIGN)分子表达及干扰后对树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟度及功能的影响. 方法 分离健康人外周血单核细胞,用GM-CSF和IL-4刺激诱导DCs.培养第4天分3组:RNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,按实验设计加入病毒共孵育12 h后换液,继续培养60 h后用荧光显微镜观察转染效率及荧光强度,培养第6天加LPS刺激成熟.第7天收集细胞用RT-PCR检测DC-SIGN mRNA水平,Western blot检测DCs总DC-SIGN蛋白表达水平,流式细胞仪检测DCs表面DC-SIGN水平,ELISA检测DCs培养上清液中IL-12、IL-10水平,混合淋巴细胞反应检测DCs对CD4+ T淋巴细胞刺激增殖能力的影响. 结果①荧光显微镜显示感染复数(MOI)为20时,DCs感染病毒的效率达85%.②RT-PCR证实RNA干扰后DC-SIGN mRNA表达水平(0.252 5±0.139 6)显著低于另2组(0.572 2±0.190 9、0.548 7±0.119 3),差异有统计学意义(F=8.142,P<0.05).③Western blot检测干扰组DCs内总DC-SIGN 水平(0.323 7±0.057 0)显著低于另2组(0.590±0.014、0.578 ±0.023),差异有统计学意义(F=51.376,P<0.05).④流式细胞仪检测干扰组DCs表面表达DC-SIGN水平[(43.10±10.12)%]显著低于另2组[(73.05±8.11)%、(74.49±5.56)%],差异有统计学意义(F=14.19,P<0.05).⑤各组间成熟标志物HLA-DR及CD86差异无统计学意义(P>0.05).⑥ELISA结果显示各组DCs培养上清液中IL-10、IL-12水平差异无统计学意义(P>0.05).⑦混合淋巴细胞反应结果显示各组DCs诱导CD4+T淋巴细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05). 结论 慢病毒介导的RNA干扰能有效抑制DCs表面DC-SIGN分子表达,抑制DC-SIGN表达对DCs成熟度及DCs功能无影响.
-
甲酰肽受体shRNA稳定转染U87细胞系的构建
目的 构建靶向甲酰肽受体(FPR)基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定转染的U87细胞系.方法 设计并合成FPR基因特异性的shRNA序列,构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体,通过脂质体转染293T细胞包装成FPR慢病毒颗粒,感染U87细胞.荧光显微镜观察转染效果,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测FPR干扰效率.结果 成功构建FPR基因shRNA慢病毒表达载体.稳定转染U87细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白.实时荧光定量PCR及Western blot证实PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体具有良好的干扰效果.结论 成功构建FPR shRNA稳定转染的U87细胞系.
-
PDGF-B慢病毒载体的构建及其对SGC7901胃癌细胞侵袭能力的影响
目的：构建血小板源性生长因子B（PDGF-B）慢病毒载体，建立PDGF-B稳定过表达的 SGC7901胃癌细胞株并观察PDGF-B对 SGC7901胃癌细胞侵袭能力的影响。方法采用四质粒系统构建 PDGF-B慢病毒载体，转染293T细胞包装获得高滴度病毒颗粒；以病毒颗粒转染SGC7901细胞，通过荧光显微镜观察转染效果，并用免疫印迹法检测PDGF-B的蛋白表达；用Tr-answell试验观察 SGC7901细胞侵袭能力的变化。结果通过PCR及酶切鉴定成功构建 PDGF-B载体；包装并得到高滴度的病毒颗粒；成功转染 SGC7901细胞后，免疫印迹法检测到 PDGF-B蛋白表达明显升高；Transwell试验证明 PDGF-B过表达增强SGC7901细胞侵袭能力。结论成功构建并包装获得PDGF-B慢病毒颗粒，建立 PDGF-B稳定过表达 SGC7901胃癌细胞株，证明PDGF-B过表达可增强胃癌细胞侵袭转移能力。
-
两种重编程系统诱导人牙源性多潜能干细胞的对比研究
目的：对比研究两种人牙源性多潜能干细胞重编程体系的特点。方法分别利用 STEMCCA 慢病毒／饲养层和仙台病毒／基质胶两种重编程系统，将人根尖乳头干细胞重编程为 iPS 细胞，比较两种方法的诱导效率、诱导工作量、iPS 细胞非整倍体核型比例、外源性基因消除难易程度等情况。结果 STEMCCA 重编程体系需要制备饲养层细胞 MEF，重编程效率约为0．1％，后期经 Cre-Loxp 酶切技术可得到无外源性转录基因的 iPS 细胞。仙台病毒重编程体系为无饲养层培养，基质胶制备方便、标准统一，重编程效率约为0．7％，明显高于 STEMCCA 系统（P ＜0．05），外源性病毒和转录基因经自然传代后逐渐消除。结论与 STEMCCA 系统相比，仙台病毒／基质胶体系更适于人牙源性 iPS 细胞的诱导。
-
慢病毒载体靶向介导p66shc基因沉默
目的：构建p66shc基因重组慢病毒表达载体，并将之转染至293T细胞，通过RNA干扰致使p66shc基因沉默，为进一步研究p66shc基因功能奠定基础。方法筛选3个RNA靶点，命名为p66shc‐shc1、p66shc‐shc2、p66shc‐shc3，与双酶切后的pLenR‐绿色荧光蛋白（GPH）（含有GFP表达）连接，转化入感受态的DH5α细胞，挑取阳性克隆测序正确后，与pRsv‐REV、pM‐Dlg‐pRRE、pMD2G一起转染293T细胞，于倒置荧光显微镜下检测GFP的表达，证实病毒包装成功。使用荧光定量PCR及Westernblot技术检测p66shc在基因及蛋白水平的表达，选取有效沉默p66shc基因的p66shc‐shc1靶点，为后续试验做准备。结果成功构建表达p66shc的shRNA慢病毒载体并转染至真核生物细胞内，通过荧光定量PCR及Westernblot技术检测其通过RNA干扰导致细胞内p66shc基因沉默。结论靶向表达p66shc的shRNA慢病毒载体，转染入真核生物细胞内可通过RNA干扰在分子及蛋白水平导致p66shc基因沉默。
-
重组慢病毒沉默 rictor 基因对 mTORC2/SGK1信号通路及肺泡上皮钠离子通道的调控作用?
目的：构建针对 mTORC2特异组成蛋白中 rictor 基因的重组慢病毒沉默载体,研究其对 mTORC2/SGK1信号通路的调控机制及其对肺泡上皮细胞钠离子通道的影响,并探讨其在急性呼吸窘迫综合征及急性肺损伤中的作用。方法构建目的基因的 rictor 干扰质粒及空载质粒并与慢病毒包装体系共转染293T 细胞,收集病毒上清液,经离心、浓缩及纯化获取重组慢病毒。测定病毒滴度,感染 A549细胞并筛选细胞稳定株,RT-PCR 验证目的基因 rictor 沉默情况。采用 PCR 和 western blot 检测该通路中各信号指标表达情况。结果成功构建沉默 rictor 基因的重组慢病毒并感染 A549细胞和获得细胞稳定株。与空白组及对照组相比,shRNA-rictor 组中 rictor 和下游 SGK1、α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC mRNA 水平均有明显下降(P <0.05)。同时, shRNA-rictor 组中 rictor 和下游 SGK1、P-SGK、α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC 的蛋白水平较前两组均有明显下降(P <0.05)。结论沉默 rictor 基因对 mTORC2/SGK1信号通路有明显的调控作用,同时从基因和蛋白水平影响肺泡上皮细胞α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC 的表达。mTORC2/SGK1可能是调控肺泡上皮细胞对肺泡液的清除能力,同时影响肺水肿形成的重要信号通路。
-
PINCH-1基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建人PINCH-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并转染人骨髓基质细胞初鉴定转染效果.方法 利用RNAi设计软件,设计合成针对人PINCH-1基因的特异性siRNA序列,利用酶切反应合成包含特异性shRNA序列的pGCSIL-GFP慢病毒载体GC-shBC047440,通过GC-shBC047440与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.获取的病毒上清筛选适感染复数(MOI值),并感染骨髓基质细胞,RT-PCR和Western blot检测重组慢病毒对骨髓基质细胞PINCH-1蛋白和RNA表达的影响.结果 酶切鉴定证实成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒干扰载体GC-shBC047440,载体感染人骨髓基质细胞后PINCH-1 RNA表达较未感染组和空载体对照组显著下降.结论 成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒载体,该载体能有效沉默PINCH-1基因的表达.
-
大鼠CGRP基因重组慢病毒载体的构建及滴度测定
目的：构建含大鼠降钙素相关基因肽（CGRP）基因的慢病毒表达载体，为后续转染目的细胞并研究 CGRP 的功能奠定基础。方法通过基因工程技术将 CGRP 基因克隆到穿梭质粒中，构建 Puc57-CGRP 质粒，用双酶切法构建慢病毒表达载体（pLenO-DCE-CGRP），将该质粒载体与4种辅助包装质粒共转染293T 细胞，转染的293T 细胞继续培养48 h 后，收集其上清液，浓缩得到高滴度的慢病毒液，然后采用倍比稀释法和流式细胞术检测病毒滴度，并通过实时定量聚合酶链反应（PCR）检测293T细胞中 CGRP 基因的表达。结果成功构建了 pLenO-DCE-CGRP 的重组慢病毒载体，滴度为5．1×108 TU /mL 。结论成功构建了含 CGRP 基因高滴度的慢病毒载体，为后续转染间充质干细胞（MSC）并研究 CGRP 的功能奠定了基础。
-
Hsa-microRNA-138慢病毒表达载体的构建与鉴定
目的:构建hsa-microRNA-138慢病毒表达载体.方法:PCR扩增pri-miR-138-2前体序列,克隆至plenti-GFP慢病毒表达载体,双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测 ;构建成功后感染人胰腺癌细胞PANC-1,48 h后Real-time Q-PCR检测miR-138的表达.结果:酶切、测序鉴定证明插入序列正确,测定病毒滴度为1×109TU/ml,病毒感染48 h后的PANC-1胰腺癌细胞观察可见绿色荧光,Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-138表达量较未感染细胞显著增高.结论:建立了高效稳定表达hsa-miR-138的慢病毒转染系统.
-
敲低Runt相关转录因子2(Runx2)表达抑制结肠癌细胞生长和迁移
目的 构建稳定低表达Runt相关转录因子2(Runx2)的HCT-8结肠癌细胞,检测对结肠癌细胞生长和迁移等生物学行为的影响.方法 首先采用Western blot法检测Runx2在不同结肠癌细胞系中表达,确定HCT-8结肠癌细胞高表达Runx2;将含有Runx2的慢病毒短发卡RNA(shRNA)的干扰载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚肾HEK293FT细胞后,收集病毒上清,感染HCT-8结肠癌细胞.经嘌呤霉素筛选后,获得慢病毒介导的Runx2 shRNA的稳定表达细胞,利用实时定量PCR和Western blot法检测Runx2的shRNA的干涉效果;用CCK-8法检测细胞增殖活性、平板克隆形成实验检测癌细胞生长、TranswellTM侵袭实验和划痕愈合实验检测Runx2 shRNA转染对癌细胞侵袭和迁移的影响.结果 建立了稳定敲低Runx2水平的HCT-8结肠癌细胞;敲低HCT-8细胞Runx2表达水平后,癌细胞的生长、侵袭和迁移受到明显抑制.结论 敲低Runx2抑制结肠癌细胞的生长、侵袭和迁移.
关键词： Runt相关转录因子2(RUNX2) 慢病毒属 侵袭转移 结肠癌 -
Osteopontin特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及其在U251胶质瘤细胞中OPN的表达
目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人胶质瘤细胞U251骨桥蛋白(osteopon-tin,OPN)表达的影响,为后续的以OPN基因为靶点的神经胶质瘤基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出2条针对OPN基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建2个重组慢病毒表达载体LV-OPNshRNAl,LV-OPNshRNA2;将连接产物转化到DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-OPNshRNA,pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的2种重组慢病毒分别感染U251细胞,实时定量PCR和Western印迹检测U251细胞OPN mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:2个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×1010TU/L和5×1010TU/L.感染U251细胞后,OPN基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降.结论:成功构建针对OPN基因的2个慢病毒载体OPN shRNA,体外感染U251细胞后可有效抑制OPN基因和蛋白的表达.
-
间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定
目的:针对间皮素(MSLN)构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装,探讨MSLN功能.方法:根据MSLN基因信息,用慢病毒质粒载体pRNAT-U6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒,转染OVCAR-3细胞后,检测RNA干扰效率,选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装,并检测病毒滴度,用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的影响.结果:测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确.脂质体转染重组慢病毒质粒pRNAT-siRNA3的RNA干扰效率高,为67.5%.鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度为1×108ifu/mL.pRNAT-siRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%,pRNAT-siRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为(15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组(30.0±5.8)%,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:pRNAT-siR-NA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR-3细胞MSLN表达以及粘附能力.MSLN RNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步研究MSLN功能和用慢病毒进行基因治疗建立了一个良好的平台.
-
慢病毒介导的Math1基因感染神经干细胞研究
目的:探讨慢病毒携带目的基因Math1感染神经干细胞的适宜条件及其影响.方法:以不同感染复数(MOI)的慢病毒分别感染神经干细胞,确定适感染条件.无血清培养液继续培养,观察感染效率有无下降.结果:随着MOI的增加,慢病毒的效率效率逐渐增加;当MOI为10时,感染效率达(83.83±1.49)%.无血清培养液继续培养30 d后,感染效率达(81.27±1.48)%,与继续培养前比较无明显下降(P>0.05).结论:携带目的基因的重组慢病毒可成功感染神经干细胞,被感染的神经干细胞的生长无明显改变.
关键词： 干细胞 慢病毒属 感染 @携带目的基因Math1 -
小鼠Mmp-9shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测
目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据.方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l.结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体.结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础.
