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慢病毒介导的RNA干扰对大鼠神经元PKCγ mRNA及蛋白表达的影响
目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大鼠神经元PKCymRNA及蛋白表达的影响.方法 孕16 d的SD大鼠,原代培养大鼠胚胎皮层神经元,随机分为3组,每组6孔,对照组(C组):不行任何处理;阴性对照组(NC组):每孔加入阴性对照慢病毒3×105个;RNAi组:每孔中加入编码PKCγ shRNA的慢病毒载体(LV-PKCγ shRNA)颗粒3×105个.5 d后采用RT-PCR和Western blot法检测PKCγ mRNA和蛋白的表达水平,并计算干扰效率.结果 与C组比较,RNAi组大鼠神经元PKCγ mRNA及其蛋白表达水平均降低(P<0.05),NC组上述指标差异无统计学意义(P>0.05).基因干扰效率99.3%,蛋白干扰效率85.2%.结论 慢病毒介导的RNAi可有效地下调大鼠原代神经元PKCγ基因及其蛋白的表达.
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重组抗基因RNA与铁蛋白基因双启动子慢病毒表达载体的构建
目的 构建共表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.方法 将铁蛋白重链基因构建入线性化的慢病毒载体pGC-FU,以获得中间质粒pGC-FU-HF;进而将具有基因沉默效应的β-arrestin2抗基因RNA构建人中间质粒,以获得目的质粒pGC- agRNA- HF;通过病毒的包装和浓缩,应用Realtime PCR法检测重组慢病毒的滴度,应用NG108-15细胞,采用Western blot和实时定量PCR检测抗基因RNA的基因沉默效应和铁蛋白的表达.结果 抗基因RNA与铁蛋白均成功构建入慢病毒表达载体,病毒滴度2.00×109 TU/ml,该病毒转染NG108-15细胞后,β-arrestin2表达下调,铁蛋白表达上调.结论 成功构建了表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.
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利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株实验研究
目的 利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株,为探讨Nfe2l2基因在结缔组织成纤维细胞细胞外基质(ECM)重构中的作用奠定实验基础.方法 2014年12月—2015年5月,通过双酶切将Nfe2l2目的基因连接到GV341载体(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin),经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提,将携带目的基因的工具GV341载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞,完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-Nfe2l2,病毒感染L929细胞72 h后筛选稳定表达的细胞株L929/LV-Nfe2l2,采用Real-time qPCR测定Nfe2l2的表达.结果 经比对,构建的LV-Nfe2l2阳性克隆序列与目的基因Nfe2l2相符;L929细胞达到80％感染效率的佳感染条件为:在ENi.S培养基中进行感染,设定感染复数(MOI)为8～10,感染时间为72 h.Real-time qPCR结果显示,经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞中Nfe2l2基因表达丰度为高(ΔCt值≤12).结论 本研究成功构建了一种过表达Nfe2l2基因的慢病毒载体;LV-Nfe2l2感染L929细胞后可实现目的基因的高表达,经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞株可用于后续实验研究.
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重组慢病毒携带酪氨酸羟化酶对大鼠帕金森病模型的干预研究
目的 利用携带大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组慢病毒,对大鼠帕金森病模型进行基因治疗,评估基因疗法对帕金森病症状缓解和黑质神经元恢复的影响.方法 2014年11月—2015年12月,分离、培养和鉴定胎鼠原代神经元,抽提胎鼠原代神经元RNA、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆大鼠TH(rTH)基因,将rTH基因构建至慢病毒质粒,包装rTH重组慢病毒.采用实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光实验和Western blotting法体外检测大鼠成纤维细胞REF中rTH基因表达.通过脑内立体定位注射6羟多巴胺(6-OHDA)建立大鼠帕金森病模型,给予Lv-rTH重组慢病毒(Lv-rTH治疗组)、未携带基因的慢病毒Lv-NC(Lv-NC治疗组)及0.9%氯化钠溶液(对照组)注射大鼠纹状体和黑质.通过阿扑吗啡诱发旋转实验进行行为学评分,免疫组化进行神经元恢复评分.结果 成功分离、培养了胎鼠原代神经元,成功克隆了rTH基因,并将rTH基因构建至慢病毒质粒,实时荧光定量RT-PCR、免疫荧光实验和Western blotting法检测大鼠成纤维细胞REF中均表达rTH基因.3组大鼠治疗前1周自发旋转速率比较,差异无统计学意义(P>0.05);3组大鼠治疗0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周自发旋转速率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中治疗0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周,Lv-NC治疗组和Lv-rTH治疗组大鼠自发旋转速率较对照组增快(P<0.05);治疗2、3、5、6、8、9、10周,Lv-rTH治疗组大鼠自发旋转速率较Lv-NC治疗组减慢(P<0.05).Lv-NC治疗组和Lv-rTH治疗组大鼠中脑黑质TH阳性神经元所占比例较对照组降低, Lv-rTH治疗组大鼠中脑黑质TH阳性神经元所占比例较Lv-NC治疗组升高(P<0.05).结论 通过脑内立体定位注射,将表达rTH基因的重组慢病毒递送至帕金森病大鼠纹状体和黑质能缓解帕金森病症状并恢复TH阳性神经元.
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Let-7b对骨髓基质干细胞诱导分化为神经元的作用研究
目的 探讨Let-7b在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元过程中的作用.方法 2013年1--12月将80只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、阴性对照组、Let-7b-up慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-up)组、Let-7b-inhibition慢病毒载体(LV-rno-Let-7b-inhibition)组,每组20只.将阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组大鼠分别感染EGFP空病毒,采用颈椎脱臼法处死4组大鼠,并获取MSCs,传代培养4代后备用.取传代培养的MSCs感染慢病毒,具体为:空白对照组、阴性对照组不进行感染,LV-mo-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组分别感染LV-rno-Let-7b-up、Let-7b-inhibition,采用MTr法检测感染前、感染后24 h、感染后5 d MSCs存活率.采用法舒地尔对4组进行诱导实验,观察MSCs分化为神经元的分化效率.采用免疫组化法检测4组神经元烯醇化酶(NSE)、神经微管结合蛋白(MAP-2)、微管相关蛋白(Tau)水平,RT-PCR法检测4组NSE、MAP-2、Tau mRNA水平.结果 LV-rno-Let-7b-up组MSCs于LV-mo-Let-7b-up感染后第3天荧光表达强,LV-mo-Let-7b-inhibition组MSCs于LV-rno-Let-7b-inhibition感染后第5天荧光表达强.感染第5天时,阴性对照组、LV-mo-Let-7b-up组、LV-rno-Let-7b-inhibition组MSCs感染率分别为87.46％、86.81％、87.12％.感染后24 h、5d阴性对照组、LV-mo-Let-7b-up组、LW-rno-Let-7b-inhibition组MSCs存活率低于空白对照组(P＜0.05);阴性对照组、LV-rno-Let-7b-up组、LW-rno-Let-7b-inhibition组感染后5 d MSCs存活率高于感染后24 h(P＜0.05).阴性对照组和空白对照组部分MSCs呈现神经元样改变;LV-roo-Let-7b-up组极大部分MSCs出现典型的神经元样结构;LV-rno-Let-7b-inhibition组仅有少量MSCs出现典型的神经元样结构.LV-mo-Let-7b-up组NSE、MAP-2、Tau及其mRNA水平高于空白对照组、阴性对照组(P＜0.05);LV-rno-Let-7b-inhibition组NSE、MAP-2、Tau及其mRNA水平低于空白对照组、阴性对照组(P＜0.05).结论 感染LV-mo-Let-7b-up后大鼠MSCs分化为神经元的分化效率增加,提示Let-7b可促进MSCs向神经元分化.
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含人 LINGO -1慢病毒干扰载体的构建与鉴定
目的：体外构建含人 LINGO -1慢病毒干扰载体，并测定其对靶基因 LINGO -1的干扰效应。方法2015年3—11月，根据 GenBank 数据库中报道的人 LINGO -1基因序列，设计合成针对人 LINGO -1短发夹 RNA （LINGO -1 shRNA）干扰序列，并将其克隆至重组质粒载体，测序验证后在293T 细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组（实验组）和错配序列干扰载体组（对照组），并转染至人胶质细胞瘤细胞U251，荧光显微镜下观察其感染效率，并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测 LINGO-1 mRNA 表达水平，采用 Western blotting 法检测 LINGO -1 表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体，经过包装分别得到滴度为2×108 TU/ ml 和4×108 TU/ ml 的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞 U251后，实验组和对照组载体转染效率分别为96.6％、95.2％。免疫荧光染色显示，人胶质细胞瘤细胞 U251高表达 LINGO -1，经慢病毒载体转染后，实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组 LINGO -1 mRNA 表达水平（0.09±0.01）较对照组的（1.00±0.00）降低（t ＝12.87，P ﹤0.01），实验组 LINGO -1 mRNA 相对表达抑制率为91.0％。实验组 LINGO -1 表达水平（0.28±0.02）较对照组的（1.00±0.00）降低（t ＝-8.13，P ﹤0.01）。结论本研究成功构建了含人 LINGO -1 shRNA 干扰载体，并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果，为研究 LINGO -1 在轴突再生中的作用奠定了基础。
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靶向大鼠Nogo受体基因的小发夹RNA慢病毒载体的构建及病毒包装
目的 构建靶向大鼠Nogo受体(NgR)的小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并进行病毒颗粒包装及滴度测定.方法 设计合成3对针对大鼠NgR及1对非特异性的寡核苷酸单链,退火后得到shNgR双链,克隆入慢病毒载体pGC-LV,行聚合酶链反应(PCR)并测序鉴定重组体;构建NgR过表达载体,双酶切并测序鉴定插入序列正确性;NgR过表达载体和各慢病毒shRNA干扰载体共转染293T细胞后,定量反转录(RT)-PCR及蛋白印迹法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体;重组NgR慢病毒shRNA干扰载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,包装并收集病毒颗粒,进行病毒浓缩液滴度检测.结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGC-LV-shNgR构建正确;双酶切及测序亦显示NgR过表达载体插入序列正确;定量RT-PCR及蛋白印迹法结果表明所构建的3个慢病毒载体pGC-LV-shNgR均可以有效干扰NgR的表达,其中pGC-LV-shNgR-A干扰效率高;包装病毒颗粒后,检测病毒浓缩液的滴度为2×107 TU/mL.结论 成功构建靶向大鼠Nogo受体的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装,浓缩的病毒液可以用于后续研究.
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靶向大鼠Nogo受体基因的小发夹RNA慢病毒载体的构建及病毒包装
目的 构建靶向大鼠Nogo受体(NgR)的小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并进行病毒颗粒包装及滴度测定.方法 设计合成3对针对大鼠NgR及1对非特异性的寡核苷酸单链,退火后得到shNgR双链,克隆入慢病毒载体pGC-LV,行聚合酶链反应(PCR)并测序鉴定重组体;构建NgR过表达载体,双酶切并测序鉴定插入序列正确性;NgR过表达载体和各慢病毒shRNA干扰载体共转染293T细胞后,定量反转录(RT)-PCR及蛋白印迹法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体;重组NgR慢病毒shRNA干扰载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,包装并收集病毒颗粒,进行病毒浓缩液滴度检测.结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGC-LV-shNgR构建正确;双酶切及测序亦显示NgR过表达载体插入序列正确;定量RT-PCR及蛋白印迹法结果表明所构建的3个慢病毒载体pGC-LV-shNgR均可以有效干扰NgR的表达,其中pGC-LV-shNgR-A干扰效率高;包装病毒颗粒后,检测病毒浓缩液的滴度为2×107 TU/mL.结论 成功构建靶向大鼠Nogo受体的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装,浓缩的病毒液可以用于后续研究.
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慢病毒介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染促进半月板纤维软骨细胞的增殖与基质合成
目的:碱性成纤维细胞生长因子是一种作用广泛的修复始动因子,能有效地促进多种细胞的增殖和基质合成功能.借助慢病毒载体进行碱性成纤维细胞生长因子基因转染半月板纤维软骨细胞,观察半月板纤维软骨细胞的增殖与基质合成情况.方法:实验于2004-05/2005-11在上海市四肢显微外科实验室完成.①实验材料:ViraPower慢病毒载体系统;3个月龄新西兰大白兔3只.②实验过程和分组:分离培养兔半月板纤维软骨细胞,待培养的第1代细胞生长至60%融合时,将细胞与克隆有碱性成纤维细胞生长因子基因的重组慢病毒载体悬液共培养,定义为实验组细胞;同时设立对照组细胞,与不携带任何基因的慢病毒悬液共培养;空白组细胞,未接受外加处理.③转染后48 h用酶联接免疫吸附剂测定方法检测3组半月板细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子的表达;激光流式细胞仪检测细胞周期,3H-脯氨酸摄人法检测胶原合成;转染后第2,4,6,8天用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖.结果:①与重组慢病毒共培养48 h后,在实验组细胞培养液中检测到碱性成纤维细胞生长因子的表达,而对照组和空白组细胞的培养液中未能检测到碱性成纤维细胞生长因子的表达;共培养6 d后实验组细胞吸光度高于对照组和空白组(P＜0.01).②实验组细胞DNA合成前期、DNA合成期、分裂前期及分裂期的时间较对照组和空白组缩短(P＜0.05).③实验组细胞胶原高于对照组和空白组.结论:利用慢病毒转基因技术能有效地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染入半月板纤维软骨细胞,继而促进半月板细胞的增殖和基质合成,有可能为治疗半月板损伤提供新的方法.
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靶向大鼠Smad3基因的siRNA筛选及其shRNA重组慢病毒的构建
目的 设计并筛选针对大鼠Smad3基因的siRNA,构建靶向Smad3基因的shRNA重组慢病毒.方法 针对大鼠Smad3基因设计并合成6对siRNA(siRNA001～006)及1对无关对照siRNA,转染大鼠肝细胞株BRL-3A,应用Western Blot检测各siRNA对SMAD3蛋白表达的抑制作用,挑选抑制效率高的siRNA.依据所得的序列合成并克隆到pLL3.7载体中,与包装质粒pRSVrev、pMDLg-pRRE和VSV-G共转染293FT细胞获得靶向Smad3的慢病毒.通过流式细胞仪绿色荧光蛋白(GFP)荧光计数来检测病毒滴度.结果 Western Blot检测证实siRNA001、siRNA005、siRNA006对SMAD3蛋白表达的抑制作用明显,抑制率分别可达83.36%、86.99%及64.88%.而对照siRNA无明显作用.酶切和测序结果显示Smad3 shRNA及对照shRNA重组载体质粒pLL3.7shRNA构建成功.将构建的质粒进行慢病毒包装可产生有感染活性的慢病毒颗粒.结论 筛选出针对大鼠Smad3基因有明显抑制作用的3对siRNA,并成功构建表达相应shRNA的4种重组慢病毒,为研究调控Smad3的表达对肝再生或肝纤维化的影响提供了实验条件.
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小鼠肝细胞SMAC基因特异干扰载体的构建及慢病毒包装
目的：构建并鉴定小鼠SMAC特异干扰载体，并进行慢病毒包装。方法针对小鼠SMAC基因设计并合成3对干扰序列siRNA1、siRNA2、siRNA3及一对阴性对照序列siRNAn，脂质体法转染小鼠肝细胞，Real time PCR法筛选出佳干扰序列。依据该佳干扰序列合成DNA oligo，连接GV115载体，获得重组干扰质粒，PCR鉴定阳性克隆并测序鉴定构建的正确性。将该重组干扰质粒与辅助质粒pHelper1．0和pHelper2．0共转染293T细胞，进行慢病毒包装，收集细胞上清并浓缩，梯度稀释法测定病毒滴度。多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。结果3条siRNA对肝细胞SMAC mRNA均有不同程度的抑制作用，其中siRNA1的抑制效应强，抑制效率达到70．3％。依siRNA1片段合成DNA oligo，并与慢病毒载体连接，测序显示其构建正确，梯度稀释法测定慢病毒滴度为6×108 TU/ml。结论成功构建了小鼠SMAC基因特异干扰性的慢病毒，为研究SMAC基因在肝衰竭中的作用奠定基础。
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人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定
目的:构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上鉴定其沉默效率.方法:针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用ReaI-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×10~8 PU·L~(-1).shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%.结论:成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因.
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慢病毒介导的酸性成纤维细胞生长因子基因在乳腺癌细胞MCF-7中的表达及其意义
目的:探讨慢病毒系统介导的实现酸性成纤维细胞生长因子(FGF 1)在MCF-7细胞中的过表达,获得初步稳定并且大量表达FGF-1的细胞株,为研究FGF-1在肿瘤发生及发展中的作用奠定基础.方法:构建FGF-1的慢病毒表达载体pWPXLd-FGF-1,通过与包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞进行病毒包装,用包装成功后病毒液侵染乳腺癌MCF-7细胞,通过流式细胞仪检测侵染效率,通过Western blotting检测GFP-FGF-1的融合表达,通过Wound healing实验初步检测FGF-1对细胞增殖及迁移能力的影响.结果:成功构建了FGF-1的慢病毒表达载体,病毒滴度达到2.8×106 TU·mL-1；获得一株大量表达FGF-1的细胞株,FGF-1的转染效率达60％以上,FGF-1对细胞的增殖及迁移具有一定的促进作用.结论:成功构建FGF-1的慢病毒表达载体并且实现在MCF-7细胞中的大量表达.
关键词： 酸性成纤维细胞生长因子 慢病毒属 乳腺肿瘤 伤口愈合 -
携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达
目的:构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒(Lent/EGFP),感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平.方法:采用PCR方法克隆EGFP cDNA将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况.结果:基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×106;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达.结论:采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达.
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慢病毒介导的绿色荧光蛋白报告基因对人前列腺癌PC-3细胞的标记
目的 探讨慢病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)标记人前列腺癌PC-3细胞是否影响其细胞生物学特性,以及GFP基因能否持久稳定表达,为下一步实验奠定基础.方法 常规肿瘤细胞培养、传代,在细胞状态佳时以不同病毒感染复数(MOI)实行GFP慢病毒对PC-3的感染,7天后在荧光显微镜下观察GFP在PC-3的表达情况.选取感染GFP阳性表达率高的孔继续培养传代至第三代后,分别用镜下形态观、MTT测生长曲线、划痕实验来对比两种细胞的形态、活性、生长速度和生长状态,以评价GFP基因在PC-3细胞表达的稳定性.结果 置荧光显微镜下,转染72h后,部分PC-3细胞可见绿色荧光,转染一周,绿色荧光表达强.其中以MOI=20感染率高,GFP阳性表达率为(92.3±1.2)%,GFP/ PC-3在体外持续培养2、4、8周GFP阳性率没有明显变化.镜下形态观、MTT测生长曲线、划痕实验等结果显示,与转染前相比,慢病毒感染PC-3后,对细胞活力、增殖、凋亡和周期均没有影响(P>0.05).结论 GFP慢病毒能够高效标记PC-3,并且不影响其生物学特性,GFP基因在PC-3能够持久稳定表达,可以用于下一步的细胞示踪研究.
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慢病毒介导的SMO RNA干扰对肿瘤细胞株LNCaP和PC3 SMO基因表达、细胞增殖及细胞周期的影响
原癌基因Smoothened(SMO)是Hedgehog旁路途径的重要组成成分,具有开关该信号通路的作用.我们构建特异性沉默SMO基因(NM 005631)的重组慢病毒载体,观察其对雄激素敏感性的人前列腺癌细胞株LNCaP和雄激素非依赖性的细胞株PC3中SM(O)因表达、细胞增殖、细胞周期的影响.根据SMO基因信息,设计了四个小干扰序列和一个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了四个重组质粒.用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,选择沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装.用脂质体将重组慢病毒载体与病毒包装载体pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,用慢病毒颗粒感染前列腺癌细胞株LNCaP和PC3后,用定量PCR检测SMO基因mRNA;细胞增殖实验检测细胞增殖的变化;用流式细胞仪检测转染效率和细胞周期的变化.测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体插入序列完全正确,其中pGCSIL-GFP-723的干扰效率高,后用Lv-SIL-SM0723命名该载体.用LV-SIL-SMO723慢病毒颗粒感染前列腺癌细胞株LNCaP和PC3.其中LNCaP和PC3 SMO mRNA显著下调,LNCaP细胞生长明显减缓,S期细胞减少、G_2/M期细胞增多,与未转染病毒、转染阴性对照病毒的LnCap细胞比较有显著差异(P<0.05).但对PC3细胞增殖没有改变(P>0.05).综上所述,本研究成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能特异地沉默SMO基因,抑制LNCaP细胞增殖,但对PC3无作用.
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稳定干扰ITGB3基因可促进人乳腺癌BT549细胞的增殖
目的:探讨稳定干扰整合素β3(integrin β3,ITGB3)基因对人乳腺癌BT549细胞增殖的影响.方法:采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测乳腺癌BT549、MCF-7和MDA-MB-453细胞中ITGB3 mRNA和蛋白的表达.将干扰ITGB3表达的LV-ITGB3-shRNA慢病毒感染BT549细胞后,应用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测BT549细胞中ITGB3 mRNA和蛋白的表达水平,MTT法和FCM法检测BT549细胞的增殖能力和细胞周期,蛋白质印迹法检测BT549细胞中c-Myc和cyclin D1蛋白的表达情况.结果:乳腺癌BT549细胞中ITGB3 mRNA和蛋白的表达水平高于MCF-7和MDA-MB-453细胞(P值均＜0.05).LV-ITGB3-shRNA慢病毒感染后,BT549细胞中ITGB3 mRNA和蛋白的表达水平低于阴性对照组(LV-NC-shRNA感染BT549细胞)和空白对照组(BT549细胞未进行感染)(P值均＜ 0.01),细胞增殖能力增强(P＜0.01),S期细胞所占百分比上升(P＜0.01),c-Myc和cyclin D1蛋白的表达水平上调(P值均＜0.05).结论:稳定干扰BT549细胞中ITGB3表达后,可能通过上调c-Myc和cyclin D1蛋白的表达而促进细胞增殖.
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脑胶质瘤相关癌基因1对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响
目的:探讨脑胶质瘤相关癌基因1(glioma-associated oncogene 1,GLIl)对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响.方法:构建靶向GLIl基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒重组载体pLVTHM-GLI1-shRNA(以空载体pLVTHM-GFP为对照),经包装后感染胰腺癌PANC-1细胞,应用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法检测各组细胞中GUI1、bcl-2、bcl-xl和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)mRNA和蛋白的表达;CCK8(cell counting kit-8)法分析各组细胞的生长情况.结果:成功构建了稳定低表达GUI1的GLI1-shRNA-PANC-1细胞,与PANC-1细胞和GFP-PANC-1细胞比较,GLIl-shRNA-PANC-1细胞中GLIl mRNA和蛋白表达水平分别下调了(82.1±3.2)%和(76.7±2.2)%(P<0.01),bcl-2 mRNA和蛋白表达分别下调了(49.7±5.4)%、(43.5±9.4)%(P<0.01);而blc-xl和PCNA mRNA和蛋白表达水平无明显变化.GLI1-shRNA-PANC-1细胞的增殖抑制率明显高于GFP-PANC-1、PANC-1细胞(P<0.05).结论:干扰GLI1基因的表达可抑制人胰腺癌PANC-1细胞的增殖,其机制可能与下调bcl-2的表达有关.
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长链非编码RNA HOTAIR在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨长链非编码RNA HOX转录反义RNA (HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)在宫颈癌中的表达及对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响.方法:实时荧光定量PCR法检测36例宫颈癌组织及其相应癌旁组织中HOTAIR mRNA的表达,分析其与宫颈癌患者临床病理特征之间的关系;将靶向HOTAIR基因的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒液感染人宫颈癌HeLa细胞后,应用CCK-8(cell counting kit-8)法和FCM法分别检测细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的情况.结果:宫颈癌组织中HOTAIR mRNA的表达水平明显高于其相应的癌旁组织(P＜0.001);HOTAIR的表达与患者的临床分期、肿瘤大小和淋巴结转移有关(P值均＜0.05),而与患者的年龄、组织学类型、分化水平、鳞状细胞癌相关抗原和宫体转移无关(P值均＞0.05).干扰HOTAIR的表达后,HeLa细胞的增殖受到抑制(P＜0.05),G0/G1期细胞比率和细胞凋亡率增加(P＜0.05,P＜0.01).结论:HOTAIR在宫颈癌组织中表达上调;干扰HOTAIR的表达可抑制HeLa细胞的增殖,并促进其凋亡.
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核糖体蛋白S3a RNA干扰重组慢病毒载体的构建及其对细胞凋亡的影响
目的 构建小鼠核糖体蛋白S3a(RPS3a)特异性RNA干扰重组慢病毒载体(Lenti-shmRPS3a),分析其对细胞凋亡的影响.方法 设计针对小鼠RPS3a mRNA的4条干扰序列,合成相应的发夹序列,连接人慢病毒载体系统pLLU2G-eGFP中构建重组质粒,将重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞组装病毒,检测病毒滴度.病毒感染RAW264.7细胞后,RT-PCR和蛋白质印迹法检测干扰效果,流式细胞术分析其对凋亡的影响.结果 PCR和测序证明成功构建出LentishmRPS3a慢病毒载体,病毒滴度为(6～9)×107 TU/mL;RT-PCR表明Lenti-shmRPS3a的沉默效率高达72.64％,蛋白质印迹法证明RPS3a蛋白表达水平降低;流式细胞术证明感染了Lenti-shmRPS3a的细胞凋亡率较对照组升高(P＜0.05).结论 表达小鼠RPS3a shRNA的慢病毒载体能有效沉默RPS3a基因表达,促进细胞凋亡.
