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脂肪因子chemerin对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响
目的 探讨脂肪因子chemerin对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响及可能机制.方法 制备小鼠chemerin过表达及RNA干扰重组慢病毒,感染3T3-L1细胞.实验设chemerin基因沉默组、沉默空载体对照组、过表达组、过表达空载体对照组.另在细胞增殖实验中增设细胞外信号调节激酶(ERK)阻断剂组.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法联合5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法观察chemerin对3T3-L1细胞增殖的影响;实时定量PCR检测chemerin、ERK1/2及细胞周期蛋白(cyclin)D1基因mRNA表达;Western印迹法检测chemerin、ERK1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白水平.结果 MTT及BrdU掺入实验结果显示:与过表达对照组相比chemerin过表达后吸光度(A)值升高(1.09±0.08比0.90±0.09,P＜0.05),BrdU掺入量增加[(126.5±14.6)％比(100.0±7.0)％,P＜0.05],此效应可被ERK1/2信号通路阻滞剂PD98059抑制,A值(0.91±0.13)及BrdU掺入量(104.3±10.7)％降低,与过表达组相比差异均有统计学意义(均P ＜0.05);与沉默对照组相比,chemerin基因沉默后A值降低(0.72 ±0.11比0.90 ±0.09,P＜0.05),BrdU掺入量减少[(77.6±11.8)％比(99.7±6.3)％,P＜0.05];实时定量PCR结果显示:chemerin过表达后与其空载对照组相比chemerin、ERK1/2、cyclinD1表达上调(2.77 ±0.31比1.01 ±0.12,1.39±0.19比0.76±0.30,1.46±0.14比0.88±0.14,1.44±0.17比1.03±0.15,均P＜0.05);chemerin基因沉默后均表达下调(0.35±0.12比1.25±0.31,0.64±0.15比1.03±0.14,0.56±0.10比1.06±0.29,0.66 ±0.13比1.09±0.19,均P＜0.05);Western印迹结果显示:chemerin过表达后与其空载对照组相比chemerin、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平增加(2.18±0.32比1.18±0.14,1.37±0.05比0.97±0.12,1.06±0.09比0.56 ±0.08,均P＜0.05),chemerin基因沉默后与其对照组相比chemerin、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平降低(1.00±0.07比1.40±0.17,0.87±0.15比1.20 ±0.12,0.49±0.07比0.91±0.11,均P＜0.05).结论 chemerin可促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,其机制可能是通过上调ERK1/2信号通路实现.
关键词： 脂肪因子类 3T3-L1细胞 细胞增殖 慢病毒属 丝裂原活化蛋白激酶1 -
shRNA下调基质金属蛋白酶9对脑梗死大鼠脑保护作用的扩散张量成像分析
目的 通过对大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型脑缺血区组织的扩散张量成像(DTI)评价,探讨shRNA下调基质金属蛋白酶9(MMP-9)对脑梗死大鼠的脑保护作用.方法 将32只SD大鼠随机分为4组(每组8只):A组(假手术组):仅分离结扎颈外动脉分支,不插入栓线;B组(MCAO组):参照传统的Longa法,建立大鼠MCAO模型;C组(生理盐水组):MCAO两周前给予脑组织内注射生理盐水5μl;D组(慢病毒干预组):MCAO两周前给予脑组织内注射慢病毒介导的shRNA5μl.MCAO后4、8、12、18、24h时间点,计算脑梗死侧的表观扩散系数(ADC)值和部分各向异性(FA)值.Western印迹测定缺血侧脑组织MMP-9蛋白表达;免疫组化染色观测MMP-9蛋白表达.使用SPSS 17.0软件进行统计学处理,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 缺血后4、8、12、18、24h,慢病毒干预组缺血区的ADC值和FA值高于MCAO组,且差异有统计学意义(不同时间点ADC值差异的t值分别为8.78、3.30、3.58、4.55和13.12,P＜0.05.不同时间点FA值差异的t值分别为2.51、5.87、6.91、4.97和4.58,P＜0.05).局灶性脑缺血后MMP-9蛋白表达逐渐增多;慢病毒干预组相应时间点的MMP-9蛋白的表达低于MCAO组,且在相应的每个时间点差异均具有统计学意义(不同时间点t值分别为3.55、6.11、4.67、4.63和2.77,均P＜0.05).慢病毒干预组的mNSS评分低于MCAO组,差异有统计学意义(不同时间点t值分别为2.25、2.90、5.19、4.36和7.31,P＜0.05).结论慢病毒介导的shRNA通过抑制MMP-9基因表达,减轻血管源性水肿,发挥脑梗死后的保护作用;磁共振DTI可动态监测缺血性脑梗死大鼠缺血区的改变.
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LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体的构建及其在睾丸间质细胞的表达
目的：构建钙视网膜蛋白（CALB2）基因超表达及小干扰RNA（siRNA）慢病毒载体，观察CALB2对睾丸间质细胞雄激素合成的调节作用。方法：合成超表达及干涉的质粒，转入制备好的细菌感受态细胞，聚合酶链反应（PCR）鉴定阳性重组子后测序验证，确认构建成功的超表达及干涉慢病毒载体。用上述慢病毒载体分别感染MLTC-1及R2C间质细胞，观察感染效率，而后用放射免疫法检测睾酮和孕酮的合成。结果：PCR和基因测序证实LV-calb2和LV-siRNA-calb2慢病毒载体构建成功，并可高效感染MLTC-1及R2C细胞。超表达CALB2后，MLTC-1细胞睾酮生成显著增加（P＜0.001）；干涉CALB2表达后，R2C间质细胞孕酮生成显著减少（P＜0.05）。结论：成功构建了calb2基因超表达及干涉慢病毒载体，并可体外转染睾丸间质细胞系。初步结果表明，CALB2可促进间质细胞类固醇激素生成。
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Hsa miR-7慢病毒表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞HO8910-PM中表达的有效性
目的:构建Hsa miR-7的慢病毒表达载体,感染人卵巢癌细胞HO8910-PM后检测微小RNA 7(miR-7)及其靶基因血管内皮生长因子受体(EGFR)的表达,为研究miR-7在HO8910-PM中的生物学功能奠定基础.方法:将聚合酶链反应(PCR)扩增得到的miR-7前体序列pre-miR-7和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1经酶切后连接产生pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1,经酶切及测序鉴定正确后在HEK293T细胞中包装病毒,病毒浓缩后感染HO8910-PM用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测感染后的HO8910-PM中pre-miR-7和miR-7的表达,qPCR及蛋白质印迹(Western blot)方法检测其靶基因EGFR的表达.结果:酶切及测序结果示慢病毒表达载体pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1构建正确,病毒浓缩液感染HO8910-PM后能有效提高pre-miR-7的表达(t=17.909,P=0.004)和miR-7的表达(t=35.320,P=0.024),并能有效降低其靶基因EGFR的mRNA的表达(t=8.83,P=0.005)及蛋白的表达(t=22.14,P=0.002).结论:成功构建了pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体及稳定表达miR-7的HO8910-PM细胞亚系.
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人凝血因子Ⅷ体外高效表达体系的建立
目的 构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,观察其在体外培养细胞中的表达情况.方法 用限制性内切酶酶切法获得B区缺失的人FⅧ基因(BDDhFⅧ cDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208的多克隆位点,构建慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,限制性内切酶酶切法鉴定载体的连接方向.采用三质粒共转染293T细胞制备病毒颗粒,包装后感染人肺、肾HLF细胞、张氏肝(Chang-Liver)细胞和成人骨髓基质细胞(MSC),并以pXZ171作为对照.流式细胞术(FCM)检测载体的感染效率,一期法检测细胞培养上清中FⅧ的活性,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合.结果 成功构建了慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,包装后能有效感染多种靶细胞,感染效率分别为:HLF细胞(74.52±7.57)%、MSC(42.34±5.84)%和Chang-Live细胞(27.24±6.53)%.感染后48 h检测到HLF细胞、Chang-Liver细胞和MSC培养上清中有FⅧ的表达,FⅧ活性分别为(54.1±5.6)%、(22.5±2.9)%和(12.5±2.7)%.PCR检测到目的 基因的整合.结论 成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染多种靶细胞并表达有活性的FⅧ.
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慢病毒介导的人凝血因子Ⅷ高效真核表达系统的建立
目的 应用慢病毒载体系统建立高效稳定表达人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的细胞株并评估该表达系统的生物安全性.方法 构建携带人B区缺失FⅧ(BDDhFⅧ)和绿色荧光蛋白基因的慢病毒转移质粒BDDhFⅧ/pXZ9及对照pXZ9,包装并浓缩慢病毒颗粒.体外感染中国地鼠卵巢(CHO)细胞后72 h取培养上清,ELISA法测定FⅧ抗原表达水平,一期促凝法测定FⅧ活性,RT-PCR检测感染后CHO细胞中FⅧ的转录.检测载体复制能力以评估安全性.结果 成功构建携带BDDhFⅧ和绿色荧光蛋白基因的慢病毒转移质粒BDDhFⅧ/pXZ9及对照质粒pXZ9,并制备出出高滴度的慢病毒.该慢病毒载体可高效感染CHO细胞,感染后72 h培养上清中FⅧ抗原浓度为(1724.9±283.7)mU/ml,FⅧ活性为(10.58±1.55)％,RT-PCR检测到BDDhFⅧ基因的转录.感染后的CHO细胞未检测到gag基因的表达,培养上清中也未检测到病毒.结论 慢病毒可以介导人FⅧ在CHO细胞内高效表达；该表达系统不产生子代病毒,具有良好的生物安全性.
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慢病毒介导的aggrecanase-2 shRNA转染对类风湿关节炎患者软骨细胞aggrecan的影响
目的 探讨慢病毒介导的agggrecanase-2 shRNA对类风湿关节炎患者软骨细胞aggrecan的影响.方法 术中切取类风湿关节炎患者关节软骨,通过胰酶+Ⅱ型胶原酶两步消化法消化软骨块并培养,取第2～3代软骨细胞.以慢病毒为载体将aggrecanase-2 shRNA5～8转染进入软骨细胞,观察转染后细胞的生长变化;以荧光定量PCR检测转染后第2、5、10天aggrecanase-2 mRNA水平的变化及aggrecan mRNA水平的变化,以循环阈值(cycle threshold,Ct)表示;用免疫组织化学方法检测aggrecan蛋白水平的变化,以积分光密度(integral optical density,IOD)表示,筛选佳抑制序列.结果 以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染软骨细胞后对细胞生长速度及形态无明显影响.加入病毒液200μl、100μl、50μl后感染复数分别为100、50、25,转染效率分别为90％、60％、30％.转染后aggrecanase-2mRNA的表达水平明显下降,特别是mRNA5,由开始的0.876 3±0.115 6下降至0.069 9±0.015 1 (P＜ 0.05);aggrecan mRNA水平显著上调,由开始的0.992 1±0.201 3增加至3.049 2±0.278 2(P＜ 0.05);aggrecan蛋白表达水平显著提高,由开始的496.160 5±225.673 7增加至4 525.433 0±1 131.813 0(P＜0.05);佳抑制序列为aggrecanase-2 shRNA5.结论 以慢病毒为载体介导aggrecanase-2shRNA转染骨关节炎患者软骨细胞可有效干扰aggrecanase-2 mRNA表达,相应地增加aggrecan表达,是一种保护aggrecan的有效途径.
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慢病毒构建表达人β-防御素3的滑膜间质干细胞及其抑菌活性鉴定
目的 检测利用慢病毒介导人β-防御素3 (humanβ-defensin 3,hβD-3)基因转染人滑膜间质干细胞(synovium-derived mesenchymal stem cells,SMSCs)的安全性及体外抗菌活性.方法 通过膝关节镜手术获取人膝关节交叉韧带及滑膜组织以分离、培养SMSCs,贴块法培养并用磁珠分选仪纯化,通过显微镜观察、免疫荧光鉴定和细胞表面标记对细胞进行鉴定.通过成脂、成骨和成软骨分化诱导分别对细胞多向分化潜能进行测定.利用质粒构建包含hβD-3基因的慢病毒载体并转染SMSCs,绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪确定其DNA含量,使用NOD/SCID小鼠验证其致瘤性.使用琼脂扩散法对转染后的SMSCs进行抑菌活性检测,同时用兔膝关节内金黄色葡萄球菌感染模型验证其体内抑菌作用.结果 贴块法获得的SMSCs经分离纯化后表现出间质干细胞应有的结构和表面标志物,具有多向分化潜能.免疫荧光证实被慢病毒转染的SMSCs能稳定表达hβD-3蛋白.增殖动力学、核型分析、致瘤型分析等证实转染后的SMSCs安全.重组细胞体外和动物模型体内抑菌活性检测显示,传代后的SMSCs(采用P5代细胞)能稳定表达hβD-3并具有抗菌活性.与阴性、阳性对照组比较,低浓度组有一定的抑菌活性,并且随浓度增高,抑菌圈逐渐增大.结论 经重组慢病毒载体感染的人SMSCs能安全稳定地传代并表达hβD-3,体外具有明显的抗菌活性.
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慢病毒介导的shRNA干扰PTEN表达促皮层神经元轴突再生及脊髓损伤修复
目的 观察慢病毒介导特异性短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)干扰第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)表达对皮层神经元轴突再生及脊髓损伤修复的影响.方法 体内实验和体外实验两部分各分四组:阴性对照组(DMEM)、空载慢病毒组(Lenti-control)、空白载体组(Lenti-scramble)、慢病毒介导shRNA组(Lenti-shRNA).体外神经元转染72 h后,Western blot检测各组PTEN表达情况,免疫荧光检测神经元轴突再生能力;体内载体注射1周后,Western blot检测各组PTEN表达情况;6周后荧光显微镜观察皮质脊髓束穿越脊髓损伤局部周围增强绿色荧光蛋白荧光强度及突触素表达情况.采用大鼠脊髓损伤评分评价大鼠后肢运动恢复情况.结果 慢病毒介导shRNA组体外转染神经元后PTEN表达水平比阴性对照组下降83.75％±2.85％,与其他组比较具有统计学意义(F=4277,P＜ 0.05);轴突长度(249.70±10.70)μm,大于阴性对照组(95.71±20.24) μm、空载慢病毒组(97.00±22.82)μm及空白载体组(87.57±19.34)μm,差异具有统计学意义(F=84.74,P＜ 0.05);每个神经元一级突起数量(5.800±0.359)个,大于阴性对照组(2.800±0.678)个、空载慢病毒组(2.900±0.389)个及空白载体组(3.000±0.877)个,其差异具有统计学意义(F=16.47,P＜ 0.05);神经元突起穿越硫酸软骨素蛋白多糖基质的百分比20.60％± 1.80％,大于阴性对照组6.70％±1.45％、空载慢病毒组5.50％±1.69％、空白载体组5.60％±1.77％,其差异具有统计学意义(F=94.90,P＜0.05).慢病毒介导shRNA注射大脑皮层运动区后,第6周大鼠脊髓损伤评分达(13.29±0.42)分,高于阴性对照组(7.00±1.48)分,空载慢病毒组(6.43±1.43)分,空白载体组(6.29±1.22)分,其差异具有统计学意义(F=44.85,P＜ 0.05).皮层组织PTEN表达水平下降84.57％±1.87％,损伤中心尾端见绿色荧光,突触素染色阳性面积明显增大.结论 慢病毒介导shRNA下调PTEN基因表达后可明显提高脊髓损伤后轴突再生能力,促进神经功能修复.
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采用慢病毒载体干扰ALDH-1表达的宫颈癌Hela细胞稳转株的构建及意义
目的:采用干扰乙醛脱氢酶1(ALDH-1)表达的慢病毒载体转染宫颈癌Hela细胞,构建干扰ALDH-1表达的稳转株,以利进一步探讨干扰ALDH-1表达的宫颈癌Hela细胞株的生物学特性.方法:体外培养宫颈癌Hela细胞,加入梯度浓度的嘌呤霉素溶液进行筛选,确定佳筛选浓度;取24孔板中对数生长的宫颈癌Hela细胞,吸弃旧培养液,加入400 μL新培养基,分别加入4种干扰慢病毒液(ALDH-1、ALDH1-1719、ALDH1-740、ALDH1-921,其中有一种具佳干扰效果)及1种阴性对照慢病毒液(LV3-NC),同时均加入Polybrene液.其中5种慢病毒液的加入量均为50 μL(滴度均为1×108 TU/mL),Polybrene的加入量为0.5 μL(浓度为5 mg/L);24 h后换新鲜培养液,72 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况.然后采用佳筛选浓度的嘌呤霉素溶液进行筛选,以获得稳定转染的干扰ALDH-1表达的宫颈癌Hela细胞株.结果:确定嘌呤霉素的佳筛选浓度为0.9 mg/L;5种慢病毒载体均成功转染入宫颈癌Hela细胞中,经嘌呤霉素筛选2周后成功获得稳定转染细胞株.结论:干扰ALDH-1表达的宫颈癌Hela细胞稳转株成功构建.
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慢病毒介导的RNAi敲低hTERT表达对人胶质瘤细胞系U87抑瘤作用的研究
目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)敲低人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达水平对人胶质瘤细胞系U87的影响.方法 以慢病毒为载体的靶向hTERT小干扰RNA(siRNA)构建体Lt-I直接感染U87细胞,分别以无义序列Lt-non及体外常规培养的U87细胞作为载体对照和空白对照.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和端粒重复序列扩增(TRAP)法检测肿瘤细胞内源性hTERT表达水平和端粒酶活性,四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术检测细胞增殖活性和增殖周期,荧光原位杂交法检测端粒长度,Transwell法检测细胞体外侵袭力;同时观察注射慢病毒后裸小鼠皮下移植瘤生长情况.结果 体内外实验结果显示,Lt-I可明显降低肿瘤细胞内源性hTERT表达水平(均P=0.000)和端粒酶活性(均P=0.000);对细胞增殖活性和增殖周期无明显抑制作用(均P>0.05);感染后肿瘤细胞端粒长度无明显变化(均P>0.05);但对肿瘤细胞体外侵袭力(均P=0.000)和裸小鼠皮下移植瘤的生长具有较强抑制作用(均P<0.05).结论 RNAi技术通过抑制肿瘤细胞内源性hTERT表达水平、端粒酶活性和侵袭力而逆转人胶质瘤细胞系U87恶性表型,hTERT可望成为胶质瘤基因治疗的靶点.
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慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究
目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装，探讨其转染人脐带间充质干细胞的佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接，转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞，包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞，根据转染效率得到佳MOI值，并采用Real-time-PCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284 bp的目的基因片段，与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒，测序结果与预期完全符合，并成功包装慢病毒颗粒。佳MOI值为20，转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞，并可持续高表达apelin基因。
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人真核表达慢病毒质粒载体plenti6/V5-D-TOPO(R)-T13RⅡ Dnglytk的构建及意义
目的:构建含有T13R Ⅱ DNglytk的慢病毒质粒载体plenti6/V5-D-TOPO(R)-TβR Ⅱ DNglytk,用含有TβR ⅡDNglytk质粒的慢病毒感染T淋巴细胞使其对转化生长因子-β(TGF-β)失敏感.恢复其对肿瘤的杀伤活性.方法:以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡ DN和HSV-tk基因,运用重组PCR方法将2个基因连接起来,获得TβR Ⅱ DNglytk融合基因,再以此基因为模板,PCR扩增获得其对照基因TRANSglytk.应用Invitrogen公司提供的系统,通过TOPO技术将2个融合基因分别连接到慢病毒表达质粒,并经过测序验证.结果:完成慢病毒表达质粒载体TβR Ⅱ DNglytk的构建,经测序验证序列正确,可以用于相应慢病毒的生产.结论:运用重组PCR技术和TOPO技术成功构建了plenti6/V5-D-TOPO(R)-T13RⅡDNglytI[载体,为产生对TGF-β不敏感的人肿瘤特异性淋巴细胞,并用于肿瘤的免疫治疗提供了基础.
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携带标记基因的慢病毒载体转染人脐带华通胶间充质干细胞的实验研究
目的探讨含有增强型绿色荧光蛋白标记基因的慢病毒（Lentivirus-EGFP）体外转染人脐带华通胶间充质干细胞(HUWMSCs)的佳方案及其对细胞增殖活性的影响。方法设计A、B、C、D共4种转染方案，分别以1、10、100的感染复数（MOI）转染体外培养的HUWMSCs，荧光显微镜及流式细胞仪检测各组荧光表达强度及转染效率，MTT法检测细胞增殖倍数。结果转染4 d后所有实验组转染率在10.6%～87.3%，并与MOI值存在量效关系，聚凝胺（5 mg/L）可显著增加病毒转染效率（P＜0.05）。MTT实验结果显示，与对照组比较，不同转染方案细胞增殖存在显著差异（P＜0.001）。A方案MOI=10组及B方案MOI=10组细胞增殖情况较其他组好。结论 B方案MOI=10实验组为佳转染方案。Lentivirus-EGFP能高效转染HUWMSCs且在2周内稳定表达转染基因，是一种安全、有效的基因转移载体。
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分子嵌合MHC-Ⅰ基因对小鼠DC反应的研究
目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制.方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组).分别感染BALB/c 小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞.分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数.结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17％.单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P＜0.01).结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低.
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miR-223敲减慢病毒的构建
目的：构建miR-223敲减慢病毒，为进一步研究miR-223的功能提供工具。方法采用Invitrogen公司miR-RNAi在线设计工具，根据miR-223成熟体序列设计了一对互补寡核苷酸片段,退火产物连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体，经酶切连入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体，构建了miR-223敲减慢病毒质粒，利用293T细胞将其包装成病毒，并感染ST2细胞，观察感染效率并用qRT-PCR检测miR-223成熟体表达。结果酶切鉴定及测序结果显示成功构建了miR-223敲减慢病毒载体，miR-223敲减慢病毒包装并感染靶细胞，表达绿色GFP荧光蛋白的细胞约占细胞总数的80%~90%，病毒滴度为1×109 PFU/mL，感染效率达90%。感染miR-223敲减慢病毒的细胞miR-223表达量（0.31±0.03）低于阴性对照（1.00±0.09），为阴性对照的31%，差异有统计学意义（n=3，t=15.091，P＜0.05）。结论成功构建了miR-223敲减慢病毒，为进一步研究miR-223的功能准备了条件。
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表达microRNA-203 tough decoy的慢病毒载体构建及应用
目的：建立表达microRNA（miRNA）tough decoy（TuD）的慢病毒载体构建方法，并检测其对细胞内miRNA表达水平及细胞表型的影响。方法在慢病毒表达质粒pSIH1-H1-copGFP中通过两步克隆，首先构建miRNA TuD通用骨架质粒，进一步构建特异性针对大鼠miR-203的TuD表达载体。在293T细胞中包装成慢病毒后，感染大鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs），同时用pSIH1-H1-copGFP空质粒包装慢病毒，感染BM-MSCs作为对照。定量RT-PCR检测细胞中miR-203的水平变化，并用CCK-8法和Annexin V-PI双标记法分别检测BM-MSCs的活性和凋亡。结果成功构建了基于pSIH1-H1-copGFP质粒的miR-203 TuD表达载体，并对其序列进行了验证。用表达miR-203 TuD的重组慢病毒感染BM-MSCs后第3、6、9天检测细胞内源性miR-203表达水平降低，同时细胞活性增高，凋亡比例降低，与对照组相比差异有统计学意义。结论两步克隆法构建miRNA TuD表达载体是一种简便高效的方法，其表达产物能够有效抑制细胞内源性miRNA水平，同时影响细胞表型。
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携带EGFP基因的人肝细胞生长因子基因慢病毒表达载体的构建
目的 构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒表达载体.方法 以pUC-SRα/HGF载体为模板,利用PCR体系扩增获得两端带有attB重组位点的HGF基因编码序列,并通过BP反应将其克隆至入门载体pDONRTM221的多克隆位点内以构建入门载体pDown-HGF.通过LR反应将pDown-HGF、pUp-EF1α、pTail-IRES/EGFP与目的载体pLV.Des3d.P/neo连接,得到慢病毒表达载体pLVneo/EF1 α-HGF-IRES-EGFP.并进行PCR鉴定和DNA测序.随后,通过脂质体将该重组载体与慢病毒包装系统共转染293FT细胞,空斑法测定病毒滴度.结果 PCR及DNA测序结果证实pLVneo/EF1α-HGF-IRES-EGFP中HGF基因目的片段插入位置和序列正确.转染pLVneo/EF1 α-HGF-IRES-EGFP后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.包装的慢病毒液滴度为7.9×107 TU/ml.结论 成功构建了携带EGFP基因的人HGF基因慢病毒表达载体.
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慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
目的 探讨慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)生物学特性的影响.方法 将含有绿色荧光蛋白基因的慢病毒感染第3代rMSCs.观察感染的rMSCs的形态学;感染的rMSCs与FITC标记的抗大鼠CD29抗体、PE标记的抗大鼠CD90抗体及APC标记的抗大鼠CIM5抗体孵育后,立即检测细胞表面CD29、CD90、CD45的表达水平;感染的rMSCs在成骨诱导培养基中培养21 d时,观察骨细胞的形成情况;感染的rMSCs在成脂肪诱导培养基中培养14 d时,观察脂肪细胞的形成情况;感染的rMSCs培养1、2、3、4、5、6、7、8 d时测定细胞活力;感染的rMSCs在琼脂培养基中培养21 d时,观察细胞克隆的形成情况;将感染的rMSCs接种于BALB/c-nu/nu裸鼠背部,观察接种后42 d内接种部位肿瘤的形成情况.结果 感染的rMSCs的形态学无改变,表达CD29+ CD90+ CD45-,具有形成骨细胞和脂肪细胞的能力,细胞活力无明显改变,无细胞克隆形成,接种裸鼠后接种部位未见肿瘤形成.结论 慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性无影响.
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NRG1-siRNA慢病毒载体的构建
目的 构建神经调节蛋白1(NRG1)-小干扰RNA (siRNA)慢病毒载体.方法 将NRG1干扰序列构建入线性化的慢病毒载体GV123上,得到NRG1-siRNA慢病毒载体.将重组病毒质粒包装和浓缩,并在293T细胞中测定病毒滴度.然后转染体外培养的星形胶质细胞,72 h时分别采用RT-PCR法和Western blot法检测NRG1 mRNA及其蛋白表达水平.结果 成功构建NRG1-RNAi慢病毒载体GV123-siRNA,病毒滴度为8×108 TU/ml,该病毒转染星形胶质细胞后,NRG1 mRNA及其蛋白表达均下调.结论 成功构建了NRG1-siRNA慢病毒载体.
