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脑内转染含胶质纤维酸性蛋白启动子的慢病毒对小鼠脑电图的影响
目的 本研究通过检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)启动子(pGFAP)慢病毒海马注射对小鼠脑电图活动的影响,探讨其在癫(痫)研究中的可行性.方法 采用免疫荧光检测方法检测pGFAP慢病毒在培养海马神经元体系以及小鼠海马内对星形胶质细胞感染的特异性.将小鼠分成两组,脑内注射人工脑脊液组与脑内注射pGFAP慢病毒组,检测脑内注射前后两组小鼠体质量的变化;使用Spike 2软件分析脑内注射3～4周后两组小鼠脑电图的功率谱以及高频振荡的变化.结果 (1) pGFAP慢病毒在培养海马神经元体系中特异性感染非神经元细胞;(2)小鼠海马齿状回(dentate gyrus,DG)区注射pGFAP慢病毒特异性感染GFAP阳性细胞;(3)与人工脑脊髓液注射组相比,小鼠体质量在病毒注射3～4周后无明显差异;(4)海马DG区pGFAP病毒注射未明显改变小鼠脑电图功率谱,高频振荡的数目和平均持续时间均无明显改变.结论 应用pGFAP慢病毒脑内注射方法研究星形胶质细胞功能在癫(痫)中的作用是可行的.
关键词： 慢病毒属 神经胶质原纤维酸性蛋白 启动子 癫(痫) 脑电描记术 -
Smurf1基因靶向RNAi慢病毒载体的构建及转染
目的 构建Smad泛素调节因子1(Smurf1)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,观察其转染骨肉瘤U20S细胞后对Smurf1基因表达的抑制作用,为后续研究奠定基础.方法 构建Smurf1基因过表达质粒,同时针对Smurf1基因序列设计合成4条RNAi片段并构建RNAi慢病毒载体.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western印迹法进行外源筛靶,筛靶出成功的干扰质粒PSC2939.用慢病毒包装PSC2939后感染U20S细胞,进行内源验证,荧光定量PCR和Western印迹检测U20S细胞中Smurf1 mRNA及蛋白的表达.结果 经PCR及测序证实,Smurf1基因过表达载体及4种干扰载体均成功构建；Western印迹外源筛靶显示,PSC2939干扰载体能有效敲减目的基因的表达；慢病毒包装后的PSC2939干扰载体能有效抑制U20S细胞中Smurf1蛋白的表达,对Smurf1 mRNA的抑制率达到60%以上.结论 成功构建可供感染的Smurf1基因RNAi慢病毒载体,为进一步研究Smurf1基因在骨肉瘤细胞中的作用提供了有效的实验工具.
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肾上腺脑白质营养不良蛋白慢病毒载体的构建和表达
目的 构建并表达野生型及突变型肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodyst rophy protein,ALDP)的慢病毒载体,探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响.方法 选择ABCD1基因的H283R和P534R两个突变,首先采用生物信息学方法,进行突变致病性及突变体结构稳定性预测;再利用分子克隆技术,将ABCD1基因克隆到pLEX-MCS慢病毒载体,构建野生型慢病毒载体:pLEX-ABCD1,定点诱变构建2个突变型重组载体:pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-AB-CD1-P534R,并与其他包装载体共转染293T细胞包装病毒.收集病毒并感染宿主细胞,RT-PCR检测慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA表达,免疫荧光及蛋白质免疫印迹法分析野生型与突变型ALDP亚细胞定位及表达.结果 生物信息学预测显示H283R和P534R为ALD致病性突变;RT-PCR结果显示慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA均过表达;免疫荧光及蛋白质免疫印迹结果表明,H283R和P534R突变可能导致ALDP突变体表达量下降,但未观察到ALDP定位改变.结论 成功构建ABCD1基因慢病毒表达载体,并评估了H283R和P534R突变对ALDP表达及亚细胞定位的影响,为深入研究ALD发病机制提供了实验依据.
关键词： ABCD1基因 肾上腺脑白质营养不良蛋白 计算生物学 慢病毒属 -
干扰PRMT5表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定
目的 探讨干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定.方法 针对PRMT5设计出该基因的有效短发夹RNA(shRNA)片段,选择合适慢病毒载体,通过基因工程技术,构建出PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体,并通过PCR以及测序检测构建序列的正确性.将重组病毒载体在病毒包装细胞中大量生产后,用病毒原液感染PRMT5表达量相对较高的SMMC-7721、BEL-7402细胞,2d后,用低杀死浓度的嘌呤霉素进行筛选,得到克隆样生长的细胞,扩大培养后分别提取蛋白和RNA,Western印迹和qPCR检测PRMT5的表达.结果 成功构建出由人源性PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体pLKO.1-sh-PRMT5,PCR及测序均证明构建序列的正确.Western印迹法和qPCR检测,pLKO.1-sh-PRMT5干扰组的PRMT5蛋白及mRNA水平明显低于pLKO.1-sh-GFP组(P＜0.05),pLKO.1-sh-PRMT5载体具有良好的干扰效果.结论 运用慢病毒感染并筛选出稳转细胞株,在干扰效率及经济角度均优越于瞬时转染,为今后研究PRMT5在肝癌细胞中作用功能提供了良好的科研工具.
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慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建
目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.
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shRNA沉默神经导向分子5A基因对A375细胞系增殖、转移和侵袭能力的影响
目的：探讨慢病毒介导短发夹RNA（shRNA）沉默神经导向分子5A（Semaphorin 5A）基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。方法针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物，构建慢病毒载体，转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒，利用慢病毒感染A?375细胞系并通过嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染细胞系，实验分为实验组细胞（A375?shRNA1和A375?shRNA2）、阴性对照组细胞（A375?con）及空白对照组细胞（A375）。通过反转录PCR（RT?PCR）、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况；侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。结果 Semaphorin 5A成功转染A375细胞后，经嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染实验组A375?shRNA2细胞系及对照组A375?con。反转录PCR及Western印迹检测，干扰后实验组A375?shRNA2较对照组A375?con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示，A375?con与A375细胞生长差异无统计学意义（P>0.05），A375?shRNA2细胞生长明显减慢，与A375和A375?con比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。划痕实验结果显示，A375?shRNA2划痕处细胞无明显迁移，划痕未得到修复，而A375及A375?con划痕处细胞终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示，A375组与A375?con组穿过的细胞数差异无统计学意义（P>0.05）；而A375?shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375?con组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin 5A基因能使A375中的Semaphorin 5A有效下调，并抑制细胞的生长，降低细胞的侵袭以及运动能力。
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慢病毒载体在基因工程中的应用
慢病毒载体可有效转导分裂和非分裂的细胞,将大型基因片段插入宿主细胞染色质并维持长期稳定的转基因表达,是应用广泛的基因转移载体.此文对慢病毒载体的发展及其在基因治疗、诱导多能干细胞、细胞成像、转基因动物及动物模型等基因工程方面的应用进行综述.
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慢病毒介导microRNA-214在成牙骨质细胞分化过程中的作用
目的:构建microRNA-214沉默慢病毒载体并研究其在成牙骨质细胞分化过程中的作用.方法:常规条件下培养成牙骨质细胞系,并对其进行矿化诱导,检测牙骨质分化及矿化相关标记物的变化.随后,构建microRNA-214沉默慢病毒载体并感染成牙骨质细胞,荧光显微镜观察其感染效率,并用茜素红和Von kossa染色检测不同组成牙骨质细胞的矿化能力,后检测不同组之间牙骨质分化标志物的变化.结果:Real-time PCR结果显示,随着诱导时间的延长,成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP mRNA的相对表达量逐渐增加.空白组、阴性对照组和microRNA-214沉默载体组感染成牙骨质细胞系比率达到90%以上.相对于空白组和阴性对照组,microRNA-214沉默组microRNA-214的表达量显著下降,这表明microRNA-214沉默载体很好地发挥了沉默功能.相对于空白组和阴性对照组,microRNA-214沉默组能显著提高成牙骨质细胞的增殖速率.成牙骨质细胞矿化程度的检测发现,相对于空白组和阴性对照组,microRNA-214沉默组矿化结节数量增多,形态变大.同时,成牙骨质细胞分化的标志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表达量在microRNA-214沉默组中均显著增加.结论:microRNA-214沉默能够促进成牙骨质细胞分化.
关键词： microRNA-214 慢病毒属 牙骨质 细胞分化 牙再矿化 -
基于miR30骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体的构建及其效应研究
目的:模拟miR30的框架结构设计针对HPSE的shRNA,将其克隆至慢病毒载体的CMV启动子调控的表达框内,实现Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控.方法:设计3条基于miR30骨架的HPSE-shRNA,通过PCR获得目的片段,回收后与线性化LV PP-GFP载体连接产生重组慢病毒载体LV PP-GFP /miR-HPSE-shRNA,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒,感染A375细胞.以实时荧光定量PCR检测HPSE-mRNA的表达情况,以Westen blot检测HPSE蛋白的表达水平.结果:构建出以miR30为骨架的针对HPSE的慢病毒干扰载体,经阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确.实时荧光定量PCR和Westen blot结果表明,LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA重组病毒感染后A375细胞HPSE-mRNA和蛋白的表达明显降低.结论:本研究成功构建了以miR30为骨架的HPSE-shRNA慢病毒载体,实现了Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控,为今后实现溶瘤病毒介导RNAi提供了实验依据.
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小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测
目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1( NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础.方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列.把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率.结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内.通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上.表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70％以上.结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具.
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微小RNA-29 b对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响及其分子生物学机制
目的:研究微小RNA(miRNA)-29b对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响及其分子生物学机制.方法:构建miRNA-29b重组慢病毒表达载体lenti-miRNA-29b转染293T细胞获得重组慢病毒,提纯慢病毒颗粒感染乳腺癌细胞 MCF-7.通过绿色荧光蛋白肿瘤细胞比例来验证转染情况;实时定量PCR 检测miRNA-29b的表达水平;CCK-8实验和Transwell实验检测miRNA-29b过表达后乳腺癌细胞生物学行为的变化.采用生物信息学软件对miRNA-29b调控的下游靶基因进行预测和筛选,使用双荧光素酶检测、实时定量PCR和蛋白质印迹法进行验证.对筛选出的miRNA-29b调控的下游靶基因RTKN通过siRNA-RTKN验证其对MCF-7细胞的增殖和迁移的影响.结果:成功构建了miRNA-29b的重组慢病毒表达载体.感染乳腺癌细胞MCF-7后,lenti-miRNA-29b组和空载体转染组分别有90%和60%左右的细胞出现绿色荧光;lenti-miRNA-29b组miRNA-29b表达量较空载体转染组和空白对照组显著增加(均P<0.05),MCF-7细胞的增殖和迁移能力较空载体转染组显著减弱(均P<0.05).RTKN的基因编码3'UTR区中具有miRNA-29b的结合位点;野生型RTKN-WT-3'UTR报告基因载体与lenti-miRNA-29b共转染MCF-7细胞后可使荧光素酶的活性显著下降(P<0.05).转染siRNA-RTKN后,MCF-7细胞中RTKN蛋白的水平显著下降,细胞增殖和迁移能力显著减弱(均P<0.05).结论:miRNA-29b能够通过抑制RTKN的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力.
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hsa-miR-100-3p抑制剂慢病毒表达载体稳定感染BEAS-2B细胞株的建立
目的 建立稳定感染人hsa-miR-100-3p抑制剂慢病毒表达载体的人支气管上皮(human bronchial epithelial,BEAS-2B)细胞株,为研究miR-l00的功能奠定基础.方法 根据hsa-miR-100-3p的成熟序列,设计其反向互补序列,用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法扩增目的基因,将目的基因与慢病毒载体GV280经双酶切后,进行定向连接,产生GV280-hsa-miR-100-3 p-inhibitor慢病毒表达载体.将制备好的重组慢病毒质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染人胚肾上皮细胞293 (human embryo kidney epithelial cell,HEK-293)T细胞,包装产生病毒颗粒并以适滴度感染BEAS-2B细胞以获得稳定感染的细胞株.倒置荧光显微镜观察感染效率,用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法检测重组慢病毒感染后BEAS-2B细胞中miR-100的相对表达量.结果 测序结果表明,目的基因成功的连接到慢病毒载体上,重组慢病毒高效的感染了BEAS-2B细胞.RT-PCR检测发现,BEAS-2B细胞中miR-100的相对表达明显的下调了.结论 稳定感染hsa-miR-100-3p抑制剂的BEAS-2B细胞株构建成功,敲低了细胞中内源性miR-100的表达.
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干扰MH-S细胞株β-catenin表达的shRNA慢病毒载体构建及功能鉴定
目的 针对β-catenin基因构建短发夹RNA (short harpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,鉴定β-catenin基因干扰效率,并检测其对小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S功能的影响.方法 设计并构建5个针对β-catenin基因的shRNA干扰载体.实验分为空白细胞对照组(MH-S)、二氧化硅诱导组(silica)、病毒干扰组(silica+LV-shβ-catenin)、病毒对照组(silica+LV-shβ-catenin-NC)4组,realtime-PCR检测各组细胞β-catenin基因mRNA的表达水平,ELISA检测各组细胞培养上清中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的分泌情况.结果 二氧化硅诱导后,与silica组和silica + LV-shβ-catenin组比较,silica+LV-shβ-catenin-NC组β-catenin mRNA的表达率降低(均有P＜0.05),silica+LV-shβ-catenin-NC组TGF-β1、IL-6和TNF-α的分泌减少(均有P＜0.05).结论 构建的shRNA慢病毒载体能够有效抑制经二氧化硅诱导的MH-S细胞株β-catenin基因表达,并抑制TGF-β1、IL-6和TNF-α的分泌,为体内矽肺纤维化的分子机制研究奠定基础.
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GATA2分子RNAi慢病毒颗粒的包装制备及表达研究
目的 制备GATA2分子慢病毒干涉颗粒,建立GATA2表达下调的K562稳定细胞系.方法 采用第3代慢病毒包装系统,将携带特异性干涉GATA2的DNA序列克隆入穿梭质粒PsicoR中,转染K562细胞,Western blot法检测对内源性GATA2干涉效果.在脂质体介导下,siGATA2质粒同包装质粒plP1、plP2、pl/VSVG 共同转染HEK 293T细胞,获得慢病毒干涉颗粒,感染K562细胞,检测干涉效果.结果 构建的重组质粒经酶切,测序鉴定结果 正确,并有干涉效果.该重组质粒与包装质粒共同转染HEK293T细胞,获得干涉慢病毒并利用该病毒建立稳定表达的siGATA2-K562细胞系,经Western blot鉴定,稳定细胞系的内源性GATA2表达下调.结论 成功制备siGATA2干涉病毒颗粒并构建siGATA2-K562稳定细胞系,为后续实验奠定基础.
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长链非编码 RNA Linc00461干扰慢病毒的构建与鉴定
目的：制备 shRNA 干扰人长链非编码 RNA Linc00461的慢病毒载体（shRNA-Linc00461），为进一步深入研究长链非编码 RNA 的功能奠定基础。方法利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计，根据小干扰 RNA 的设计原则，选取三对针对Linc00461特异性干扰引物送公司合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒 pSIH1-H1，形成 pSIH1-H1-shRNA-Linc00461质粒。用 PCR 及测序对其进行鉴定，之后与慢病毒包装质粒混匀，由脂质体转染至 HEK293T 细胞进行包装，产生慢病毒 shR-NA-Linc00461，收集上清液使其感染乳腺癌 MDA-MB-231细胞，通过 RT-PCR 鉴定重组慢病毒干扰效果。并选取干扰效果好的 Linc00461感染 MDA-MB-231细胞，运用 MTT 和流式细胞术检测细胞增殖和周期的改变。结果 SIH1-H1-shRNA Linc00461质粒经 PCR 验证和测序后，证实其构建成功。shRNA-Linc00461在 HEK293T 细胞中重组成慢病毒，并成功感染MDA-MB-231，感染效率约为70％。shRNA-Linc00461感染乳腺癌 MDA-MB-231细胞后 Linc00461的表达下调65．32％；感染shRNA-Linc00461第3天 MTT 结果显示：实验组吸光度值（0．232±0．032）明显低于实验对照组（0．398±0．037）。流式结果提示实验组 G2M期细胞（47．55±5．063）％高于实验对照组（8．876±3．565）％。结论成功构建了 shRNA-Linc00461慢病毒载体，并能有效抑制 Linc00461表达，为深入研究人 Linc00461基因功能奠定了基础。
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Livin shRNA慢病毒载体的成功构建及鉴定
目的 构建携带livin基因短片段发卡RNA(livin shRNA)的慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的干扰人livin基因的有效靶序列,设计、合成靶序列的寡聚脱氧核苷酸DNA序列(Oligo DNA),退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的携带U6启动子和绿色荧光蛋白的pGCL-GFP载体连接产生短片段发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果 PCR鉴定与DNA测序证实合成的含livin shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.结论 成功构建人livin shRNA慢病毒载体.
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慢病毒载体介导siRNA沉默Id-1通过ERK1/2信号通路抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长
目的 构建慢病毒表达载体介导siRNA沉默Id-1,观察其对人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其对ERK1/2信号通路的影响. 方法 构建合成特异性针对Id-1基因的siRNA慢病毒载体,转染肝癌HepG2细胞系,经半定量RT-PCR鉴定筛选沉默效果佳的细胞系,于倒置荧光显微镜(×400)下观察转染前后细胞的形态学变化.取细胞浓度为5×106 mL1的干扰效率佳的稳定转染细胞系、稳定转染空载体病毒细胞系及正常HepG2细胞系悬液各0.2 mL,分别注射到转染实验组、阴性对照组及空白对照组的裸鼠右腋皮下,每周测量肿瘤体积及裸鼠体质量,绘制肿瘤生长曲线,28d后处死裸鼠,制作肿瘤组织标本,行常规病理检查,采用半定量RT-PCR及Western-blot方法检测肿瘤组织Id-1,ERK1/2的mRNA和蛋白的表达水平及p-ERK1/2的蛋白表达水平. 结果 倒置荧光显微镜显示,转染前后细胞形态学变化不明显.经半定量RT PCR筛选出Id-1基因的siRNA慢病毒载体的佳细胞系为sh31,与稳定转染空载体病毒细胞系相比,目的基因Id-1的表达降低了80％0以上,与未干扰的HepG2细胞相比降低了60％;转染细胞皮下接种后,转染组终瘤体大小明显小于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).半定量RT-PCR显示,转染组肿瘤组织的Id-1及ERK1/2 mRNA分别为(0.389±0.058)及(0.475±0.079),均明显低于阴性对照组[(0.845±0.113),(0.977±0.082)]和空白对照组[(0.917±0.083),(0.978±0.056)](均为P＜0.05).Western-blot检测显示,转染组的Id-1及p-ERK1/2蛋白均明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05). 结论 Id 1基因特异性siRNA的慢病毒表达载体通过靶向抑制Id-1的表达,明显抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长,推测Id 1可能通过调节ERK1/2 MAPK信号通路参与肝癌的发生发展.
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靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表达质粒的构建及功能验证
目的 构建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,并验证其对AGS胃癌细胞增殖的影响. 方法 设计并合成5对针对人YWHAE基因的shRNA序列,分别克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达质粒,接着将重组的慢病毒表达质粒和包装质粒PHR、包膜质粒VSVG一起采用磷酸钙法转染293T细胞包装慢病毒,收集制备的慢病毒感染AGS细胞,用抗生素Puromycine进行筛选.Western-blot检测感染细胞YWHAE蛋白的表达.选取干扰效率高的慢病毒表达质粒,针对性设计siRNA的点突变引物,重叠延伸PCR法扩增获得点突变的YWHAE基因,克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A载体,构建YWHAE点突变的表达质粒,转染YWHAE沉默效果好的AGS细胞株,Western-blot检测转染细胞YWHAE蛋白的回复表达.采用MTS法检测YWHAE-shRNA慢病毒对AGS细胞增殖的影响. 结果 5对针对人YWHAE基因的shRNA序列构建的慢病毒中,pLL3.7-siYWHAE-5包装成的慢病毒抑制AGS细胞的YWHAE蛋白表达的效果明显,仅为对照组相对表达量的(0.269±0.083)倍;pLL3.7-siYWHAE-5包装的慢病毒,其干扰效应可经由YWHAE点突变表达质粒回复.与对照组比较,YWHAE-shRNA组AGS细胞增殖能力明显下降. 结论 成功构建了靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,获得YWHAE基因表达显著下调的AGS细胞株;探明YWHAE表达的下调可有效抑制AGS细胞的增殖,提示YWHAE在胃癌中的致癌潜能.
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BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能
目的 构建重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并检测其转染肺癌A549细胞后的表达与功能. 方法 通过PCR技术以含B细胞转位基因(BTG2)的cDNA克隆质粒(HsCD00330081)为模板获得BTG2基因片段,将此片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,形成pCDH-BTG2,转染PC3细胞检测BTG2的表达;将重组慢病毒载体质粒pCDH-BTG2包装成重组慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞后,通过蛋白免疫印迹法检测BTG2的表达,细胞计数法检测BTG2对A549细胞生长的影响. 结果 pCDH-BTG2重组质粒构建成功,转染PC3细胞后可检测BTG2蛋白的表达,pCDH-BTG2包装成慢病毒感染A549细胞后,显著抑制A549细胞的生长. 结论 成功构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并发现BTG2抑制A549细胞的生长,为研究BTG2的功能奠定了基础,同时为肺癌的药物研究提供了靶点.
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APE1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建APE1基因慢病毒载体,为其后续的体内外实验研究提供基础. 方法 应用基因工程技术,筛选出两条针对APE1基因的RNAi靶序列KD1、KD2,分别与pGCIL-GFP载体连接,经转化筛选鉴定后,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,分别命名为LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2,两种病毒颗粒分别感染MHCC97-H细胞,设为感染LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2细胞组,同时设未感染病毒组和感染空载体细胞组.Real-time PCR和Western blot检测MHCC97-H细胞中APE1基因的mRNA和蛋白的表达. 结果 PCR及测序结果与预期结果一致,LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2的病毒滴度为4×108 TU/mL和7×108 TU/mL.与未感染病毒组和感染空载体细胞组相比,2组慢病毒组APE1基因mRNA和蛋白的表达均明显下降,LV-APE1-shRNA1、LV-APE1-shRNA2对APE1基因的mRNA表达的抑制率分别为75%,90%,对APE1蛋白表达的抑制率达90%,95%. 结论 成功构建高效阻断APE1基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究APE1基因在肝癌中的作用机制和基因治疗奠定基础.
