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慢病毒载体介导的neprilysin基因对小鼠神经干细胞的转导及表达
目的 观察慢病毒载体(lentiviral vector)介导的脑啡肽酶(Lenti-脑啡肽酶)基因对小鼠神经干细胞(NSC)转导及其表达的情况.方法 利用Lenti-脑啡肽酶基因载体体外转导小鼠原代NSC,细胞免疫荧光染色和蛋白质印迹法分析NSC的蛋白表达,酶联免疫吸附试验和高效液相色谱法检测NSC中脑啡肽酶蛋白对β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)的体外降解效率,不同组别之间差异比较采用t检验.结果 Lenti-绿色荧光蛋白转导NSC后96 h的成功转导率达90％以上.NSC转导脑啡肽酶基因后可同时表达脑啡肽酶和NSC的标记抗体Nestin或神经元的标记抗体微管相关蛋白2.随着细胞脑啡肽酶膜蛋白的浓度增加或孵育时间延长,脑啡肽酶降解Aβ1-40活性也增强.2.5μg(21.00±2.51)及1.0 μg (15.00±0.54)脑啡肽酶蛋白降解活性较0.5 μg(8.00±0.81)显著提高(t=40.4、12.7,均P＜0.01),phosphoramidon则明显抑制脑啡肽酶活性(0.5 μg:0.08±0.01;1.0μg:0.04±0.01；2.5 μg:0.05 ±0.01,与相等脑啡肽酶浓度比较,t=17.2、51.3和14.1,均P＜0.01).孵育1、4和12h的脑啡肽酶降解率分别为11.4％、28.4％和93.7％.结论 Lenti-脑啡肽酶基因可于体外成功转导小鼠NSC,移植脑啡肽酶基因转染的NSC具有潜在的治疗前景.
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人α-突触核蛋白基因慢病毒稳定转染PC12细胞系的建立及其凋亡检测
目的 构建及鉴定人野生型和突变型α-突触核蛋白(SNCA和SNCAmu)基因慢病毒表达载体，并观察在体外大鼠嗜铬细胞瘤细胞中的表达。方法 在引物合成后采用PCR技术扩增目的基因，并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒[pGC-FU，含绿色荧光蛋白(GFP)基因]中，构建SNCA基因慢病毒载体表达质粒(pGC-FU-SNCA-GFP)和SNCAmu基因慢病毒载体表达质粒(pGC-FU-SNCAmu-GFP)，通过酶切、测序验证后，将pGC-FU-SNCA-GFP、pGC-FU-SNCAmu-GFP质粒和包装质粒pHelperi.0、pHelper2.0共同转染大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)，获得稳定转染。结果 通过检测标签蛋白GFP和目的蛋白，进一步验证pGC-FU-SNCA-GFP和pGC-FU-SNCAmu-GFP在靶细胞中的表达。通过噻唑蓝比色法检测稳定转染后细胞凋亡水平，稳定表达SNCA组(OE组)、SNCAmu组(OEm组)、不加慢病毒质粒的空白对照组(CON组)和加pGC-FU-GFP空载体对照组(NC组)共4组细胞，病毒转染后不同时间(1、2、3、4、5d)细胞增殖变缓(F =4.534、196.285、411.829、1282.049、3135.559，均P＜0.05)。碘化丙锭单染法检测细胞周期，CON组、NC组、OE组和OEm组G1期、G2期和M期细胞百分比差异有统计学意义(F= 885.79、45.03、207.11，均P＜0.05)，其中G1期细胞百分比(％)较高(CON组：59.10±0.35、NC组：68.24±0.60、OE组：71.73 ±0.11、OEm组：74.66±0.35)。结论 人SNCA和SNCAmu基因转染到PC12细胞中，成功建立稳定表达的细胞系，并且对细胞凋亡水平和细胞周期有一定程度的改变。
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MMP-9基因RNAi重组慢病毒的构建及其对喉癌细胞侵袭的抑制
目的 构建基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒,观察其对喉癌细胞体外侵袭的抑制作用.方法 筛选确定的MMP-9基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与含H1启动子和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pLVTHM载体连接产生LV2shMMP-9慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用重组慢病毒体外转导喉癌细胞,Southern印迹法检测喉癌细胞MMP-9蛋白表达.Boyden侵袭小室法实验观察转导后的喉癌细胞侵袭能力的变化.结果 成功构建MMP-9 shRNA的慢病毒载体LV2shMMP-9,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为8×1010TU/L.转导MMP-9 siRNA的喉癌细胞MMP-9蛋白表达阴性.MMP-9 siRNA转导后喉癌细胞体外侵袭能力下降.结论 成功构建人MMP-9基因RNAi慢病毒载体,MMP-9基因沉默对喉癌细胞体外侵袭有明显的抑制作用.
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逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统的构建和鉴定
目的 构建并鉴定表达MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统并检测其对于喉癌多药耐药细胞系(LSC-1/TAX)多药耐药表型的逆转效果.方法 根据MDR-1基因序列,设计3条寡聚核苷酸序列,合成互补DNA链,插入慢病毒表达质粒pLVTHM中,与pCMV-dR8.74和pMD2G共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒.以RT-PCR、realtime PCR及Western blot方法检测三条siRNA在人喉癌耐药细胞系(LSC-1/TAX)中的干扰效率,并采用MTT方法检测干扰前后化疗药物的敏感性.结果 通过酶切和测序证实慢病毒载体构建正确,产生能够表达GFP和siRNA的慢病毒颗粒,浓缩滴度为＞1×108TU/ml.三条siRNA均可以感染LSC-1/TAX细胞系,其中第三条siRNA敲减效果佳.结论 成功建立逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统,为逆转喉癌多药耐药表型的实验奠定了基础.
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慢病毒介导的基质金属蛋白酶2基因沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究
目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据.
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趋化因子受体3 RNA干扰慢病毒载体的构建及对嗜酸粒细胞作用的初步研究
目的 构建趋化因子受体3(chemokine receptor 3,CCR3)基因RNA干扰(RNAinterference,RNAi)慢病毒表达载体,了解其对嗜酸粒细胞的作用.方法 针对小鼠CCR3基因序列,设计出RNAi的靶序列,退火形成双链DNA,与经MluⅠ、Sac Ⅰ、EcoR Ⅰ、HindⅢ、BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行酶切后的pLVX-shRNA2-m载体连接产生短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体.应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及嗜酸粒细胞,测定病毒滴度,实时定量聚合酶链反应检测嗜酸粒细胞中CCR3基因mRNA的表达情况.结果 成功构建了shRNA-mCCR3慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致.荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90％,病毒滴度为4×108 TU/ml;对嗜酸粒细胞CCR3基因沉默效率为86.7％.结论 成功构建CCR3基因RNAi慢病毒表达载体,为后续感染嗜酸粒细胞,探索其在变应性鼻炎发生和发展中的作用奠定了基础.
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慢病毒介导的类表皮生长因子域7基因沉默抑制喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭的研究
目的 探讨小干扰RNA(siRNA)重组慢病毒介导的类表皮生长因子域7(epidermal growth factor-like domain 7,EGFL7)基因沉默对体外培养喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭潜能的影响.方法 采用RNA干扰技术,构建靶向EGFL7的shRNA重组慢病毒并转染Hep-2细胞,通过Real-timePCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果;实验分为空白对照组(NC)、空白慢病毒感染组(Lenti-NC)和EGFL7基因沉默慢病毒感染组(Lenti-EGFL7),采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力.结果 Real-time PCR检测说明Lenti-EGFL7组mRNA相对表达量较NC组下降达94％(P＜0.001),Western blot检测证实Lenti-EGFL7组EGFL7蛋白相对表达量为(0.07 ±0.04)较NC组的(0.39 ±0.12)明显减低(P ＜0.001),表明成功构建稳定沉默EGFL7基因的喉癌Hep-2细胞株.CCK-8细胞增殖实验说明靶向沉默EGFL7表达导致喉癌细胞增殖明显抑制(P＜0.01),流式细胞术检测证实,与NC组和Lenti-NC组相比,Lenti-EGFL7组S期细胞百分比明显升高(P＜0.01),G1期细胞百分比下降(P＜0.05),细胞凋亡检测证实Lenti-EGFL7组细胞凋亡率为(66.2±1.28)％较NC组的(6.09±3.28)％和Lenti-NC组的(9.86±2.13)％明显增加(P ＜0.001).Transwell侵袭实验发现Lenti-EGFL7组穿过Matrigel到达下室的平均细胞数较NC组和Lenti-NC组均明显减少(P＜0.01).结论 靶向沉默EGFL7基因能抑制体外培养喉癌Hep-2细胞的增殖并降低细胞侵袭能力.
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慢病毒介导miRNA-184体外转染对人晶状体上皮细胞上皮间质转分化的影响
目的 观察慢病毒介导miRNA-184体外转染对TGF-β2诱导人LEC发生上皮间质转分化(EMT)时其基因表型的影响.方法 实验研究.构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导体外转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC,利用QRT-PCR检测转染0、6、24 h后人LEC中相关基因E-钙黏蛋白(CDH1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(VIM)表达水平的变化,并与阴性对照慢病毒侵染组进行比较.采用单因素方差分析进行统计学分析.结果 成功构建pL/IRES/GFP-miR-184质粒,经慢病毒介导转染由TGF-β2诱导而发生EMT的人LEC 24 h后,上皮细胞标志性基因CDH1相对表达量保持相对不变,24 h时为6.30E-06,而对照组则下调,24 h时为1.37E-06,差异有统计学意义(F=261.78,P＜0.01);间质细胞标志性基因α-SMA和VIM的相对表达量均保持相对不变,24 h时分别为1.55E-02和4.61E-04,而对照组则均上调,24 h时分别为2.09E-02和6.73E-04,差异有统计学意义(F=26.21,P=0.007;F=17.91,P=0.013).结论 miRNA-184经慢病毒介导转染人LEC后,能抑制其由TGF-β2诱导所发生的EMT相关的基因表型变化.
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绿色荧光蛋白和胸苷激酶基因共表达的慢病毒载体的构建及表达
目的 构建人巨细胞病毒广谱启动子(CMV)调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)和自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)共表达的慢病毒载体,获得高效的慢病毒转基因平台.方法 采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法,将HSV-tk基因插入慢病毒载体Lenti-ires-EGFP中,构建广谱启动子CMV调控的HSV-tk和EGFP共表达的慢病毒载体(Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP).构建成功后的慢病毒三质粒系统通过磷酸钙沉淀法转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T,28 h后收集病毒颗粒,测定病毒滴度,并感染人晶状体上皮细胞株、视网膜母细胞瘤细胞株、神经母细胞株、Hela细胞等,荧光显微镜下观察EGFP的表达.RT-PCR检测HSV-tk与EGFP的表达.结果 构建的慢病毒载体Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP能高效转染各类细胞并持续稳定的表达.RT-PCR的结果表明Lenti-CMV-HSV-tk-EGFP感染细胞能共表达HSV-tk和EGFP,利用该慢病毒载体系统转染人晶状体上皮细胞株时,在复合感染度(MOI)为100时,转染效率接近100%,且传代培养6个月后仍能维持高转染效率.结论 成功构建了能转染多种细胞的TK自杀基因和EGFP共表达的慢病毒载体,为眼科自杀基因治疗的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台.
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慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷体系抑制人晶状体上皮细胞的研究
目的 探讨慢病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷体系(HSV-tk/GCV)对人晶状体上皮细胞(LECs)系的杀伤效应的机制.方法 HSV-tk基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因共表达的慢病毒感染细胞为试验组,仅表达EGFP的慢病毒感染细胞和正常细胞为对照组.流式细胞仪检测病毒的转染效率,荧光显微镜观察及基因组PCR和RT-PCR检测基因在LECs内表达,DNA ladder和电镜观察该系统对LECs的杀伤作用,检测HSV-tk/GCV系统的浓度时间依赖性和旁观者效应.结果 HSV-tk整合入LECs并高效表达.10～25μg/ml的GCV能明显诱导转染HSV-tk的细胞凋亡或坏死,且随GCV浓度升高和作用时间延长效应增强,且存在明显的旁观者效应,而对照组细胞无显著改变.当GCV浓度＞25μg/ml,对照组细胞的增殖也被显著抑制.结论 GCV可高效杀伤表达HSV-tk的LECs,且旁观者效应显著增强了HSV-tk/GCV系统的杀伤效果.HSV-tk和EGFP共表达的慢病毒载体能高效稳定转染LECs.(中华眼科杂志,2007,43:810-816)
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晶状体上皮细胞启动子LEP503调控的自杀基因系统细胞特异性表达研究
目的 探讨人晶状体上皮细胞(HLEC)特异性启动子LEP503调控的Cre/LoxP增强型自杀基因(HSV-tk/GCV)系统在眼内主要细胞中的特异性表达及杀伤作用.方法 实验研究.利用分子克隆技术,构建HLEC特异性启动子LEP503调控的HSV-tk/GCV系统并进行慢病毒包装.分别在HLEC、视网膜色素上皮细胞(RPEC)、小鼠成纤维细胞(NIH3T3)、293T细胞中转人此系统,3d后观察4组细胞增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达情况,并收集HLEC和RPEC,通过RT-PCR检测HSV-tk的表达差异.20 mg/L丙氧鸟苷(GCV)作用后,CCK-8试剂盒和流式细胞仪检测HSV-tk/GCV系统对HLEC和RPEC的杀伤作用.采用单因素方差分析Scheffe两两比较法对各组RPEC活性进行比较.结果 HSV-tk/GCV系统在RPEC、NIH3T3、293T细胞中EGFP表达效率分别为62.3％,68.3％,75.8％；在HLEC中EGFP表达效率为17.5％.RT-PCR检测显示HLEC内有较高的HSV-tk表达,相对灰度值为4.01,而RPEC中HSV-tk表达微弱,相对灰度值为0.29.20 mg/L GCV作用72 h后流式细胞仪检测:HLEC组的细胞凋亡率为76.51％,而RPEC组仅为2.44％.CCK-8试剂盒检测细胞增殖抑制情况显示:20 mg/L GCV作用72 h后LEP503调控的HSV-tk/GCV转染的RPEC活性0.9198 ±0.06与正常RPE组0.9672±0.02和阴性对照RPE组0.8927±0.07相比,差异无统计学意义[组间均数差值(MD)分别为MD1=-0.047,P=0.671；MD2 =0.027,P=0.912].结论 HLEC特异性启动子LEP503调控的Cre/LoxP增强型自杀基因系统在HLEC中能特异性表达HSV-tk,GCV作用后可特异性抑制HLEC增殖,但对RPEC无明显杀伤作用.
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慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定
目的 以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM 2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度.采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠.出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况.结果 病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光.包装出的慢病毒滴度为106 U/ml,经浓缩后可达108U/ml.PCR检测显示,F0代小鼠GFP FCR阳性率为70.27%(26/37).荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当.F0代、F1代中GFP均呈广泛表达.结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台.
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慢病毒介导的敲低E6 AP表达抑制胃癌细胞增殖和迁移
目的：构建稳定敲低E6AP表达的胃癌细胞BGC-823，并检测对胃癌细胞增殖和迁移等恶性生物学行为的影响。方法采用Western印迹方法检测E6AP在不同胃癌细胞系及胃正常黏膜上皮细胞系中的表达情况；将含有E6AP的慢病毒短发夹RNA（ short hairpin RNA，shRNA）的干扰载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚肾293T细胞后，收集病毒上清感染胃癌细胞 BGC-823，经嘌罗霉素（ puromycin）筛选后，获得慢病毒介导的E6AP shRNA的稳定表达细胞，用实时（real-time）PCR和Western印迹方法检测E6AP干扰效果；并利用细胞生长曲线实验、划痕愈合（ wound healing）和Transwell实验检测E6AP shRNA对胃癌细胞增殖和迁移的影响。结果 E6AP在不同胃癌细胞系及胃正常黏膜上皮细胞系中均有表达；建立了稳定敲低 E6AP 的胃癌细胞 BGC-823；E6AP shRNA可有效抑制胃癌细胞增殖和迁移。结论 E6AP的生物学功能在胃癌恶性转化过程中发挥重要作用。
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PHLPP2基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及对舌癌细胞Tca8113增殖的影响
目的 构建稳定表达PHLPP2小发夹RNA( shRNA)的Tca8113细胞系,研究敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化水平和Tca8113细胞生长的影响. 方法 利用RNA干扰( RNAi )技术,设计并合成针对PHLPP2 基因的shRNA,并将其克隆到shRNA表达载体PSIH-H1上. 经测序成功后,包装病毒并感染舌癌细胞Tca8113,建立敲低PHLPP2的稳定细胞株. 通过实时定量PCR( qRT-PCR)和Western印迹实验检测RNAi的干扰效果. 利用Western印迹实验和细胞生长曲线检测敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化及细胞生长的影响. 结果 经测序证明,成功构建PHLPP2 shRNA真核表达载体. qRT-PCR和Western印迹实验证明,构建的shRNA能有效抑制PHLPP2的表达,并构建敲低PHLPP2基因的Tca8113稳定细胞系. 实验表明,敲低PHLPP2可促进细胞的生长并升高Akt Ser473的磷酸化水平. 结论 成功构建PHLPP2基因的shRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制PHLPP2基因的表达,且能升高Akt Ser473的磷酸化水平并促进细胞的生长,为进一步研究PHLPP2在舌癌中的功能及机制奠定了基础.
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慢病毒介导的敲低UBC9表达抑制ERβ类泛素化修饰水平
目的 建立稳定敲低UBC9蛋白表达的293T细胞株,检测其对雌激素受体β(ERβ)类泛素化修饰水平的调节作用.方法 构建4条针对人UBC9基因的慢病毒短发夹RNA(shRNA)的干扰载体,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后,收集病毒上清,感染293T细胞,经嘌呤霉素(puromycin)筛选后获得稳定表达慢病毒介导UBC9 shRNA的混合细胞集落,分别用实时(real-time) PCR和Western印迹方法检测UBC9的表达情况,瞬时转染方法检测UBC9表达水平对ERβ类泛素化修饰水平的影响.结果 建立了稳定敲低UBC9的293T细胞株,UBC9降低能够抑制ERβ类泛素化修饰水平.结论 UBC9在ERβ类泛素化修饰反应中发挥重要作用.
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Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化
目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系，检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒，进行慢病毒包装，感染HCT116细胞，嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平，筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确，蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强，Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系，便于后期Apak功能的研究。
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稳定低表达CD147的人肺腺癌细胞系的建立及对细胞增殖的影响
目的 构建CD147慢病毒干涉载体,建立稳定下调CD147表达的人肺腺癌A549细胞系,观察下调CD147表达后人肺腺癌细胞增殖能力的变化.方法 将携带不同特异性干涉序列的3个DNA片段分别插入干涉质粒pSicoR中,构建pSicoR-siCD147慢病毒干涉载体(pSicoR-siCD147-1,pSicoR-siCD147-2,pSicoR-siCD147-3).分别将构建好的载体转染入293FT细胞中,进行慢病毒包装.建立稳定下调CD147表达的细胞系.利用CCK-8法检测细胞增殖能力的变化.结果 与结论 构建了pSicoR-siCD147慢病毒干涉载体,RT-PCR和实时PCR结果显示pSicoR-siCD147-2的干涉效率高.建立了稳定下调CD147表达的人肺腺癌A549细胞系(A549-siCD147).CCK-8法检测发现A549-siCD147细胞的增殖能力显著性下降(P<0.05),下调CD147的表达可以使人肺腺癌细胞的增殖能力受到明显抑制.
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KIR2DS2 基因 RNAi 慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法:针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论:成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.
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尾侧型同源转录因子2慢病毒载体的构建及其转染骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 构建携带尾侧型同源转录因子2(caudal-related homeobox transcription factor 2,CDX2)的大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),为大鼠溃疡性结肠炎模型的基因治疗提供工具.方法 根据GenBank信息,设计CDX2引物,采用PCR扩增CDX2基因片段;通过In-Fusion技术将目的基因片段连接到线性质粒载体中,然后转化感受态细胞,进行阳性克隆筛选及基因测序.将重组载体转染293T细胞,进行慢病毒包装、浓缩及滴度测定.体外分离并培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪(fluorescence activated cell sorting,FACS)检测细胞免疫表型.将携带CDX2基因的慢病毒载体转染至大鼠骨髓间充质干细胞,利用RT-PCR及Western blot等技术检测CDX2基因及蛋白的表达水平.结果 PCR、DNA测序及Western blot检测成功构建重组Ubi-CDX2-MCS-3FLAG-CMV-EGFP GV365慢病毒载体,测定滴度为2×108 TU/ml;成功完成大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养,FACS结果 显示,大鼠BMSCs表达CD29、CD73、CD90和CD105,而不表达CD34和CD45,符合骨髓间充质干细胞的表型.成功构建携带CDX2基因的BMSCs,RT-PCR及Western blot结果 显示CDX2基因转染至大鼠BMSCs并能稳定表达.结论 本研究成功构建了携带CDX2基因的大鼠BMSCs并稳定表达CDX2,为溃疡性结肠炎基因治疗的实验性研究提供了一种新的工具.
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单链抗体导向的慢病毒介导VP22-TK系统对MUC1+人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的作用
目的探讨抗MUC1单链抗体(scFv)导向的慢病毒介导的单纯疱疹病毒结构蛋白VP22和胸苷激酶(TK)融合基因及丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对MUC1+人卵巢上皮癌的特异靶向性生长抑制作用.方法将慢病毒包装质粒、包膜质粒、转移载体质粒采用磷酸钙沉淀法共转染包装细胞293T,收集病毒上清,并建立MUC1+人卵巢上皮癌(3AO)细胞株腹腔移植瘤模型.单药组分为scFv-VP22-TK+生理盐水(NS)组、VP22-TK+NS组、NS+NS组,分别用慢病毒scFv-VP22-TK、VP22-TK或NS 1 ml腹腔注射,继予NS腹腔注射;联合用药组分为scFv-VP22-TK+GCV组、VP22-TK+GCV组、NS+GCV组分别应用慢病毒scFv-VP22-TK、VP22-TK及NS腹腔注射,24 h后给予GCV腹腔注射治疗.每组裸小鼠均为5只.观察各组裸鼠的生存时间及慢病毒的毒性作用.结果平均生存时间scFv-VP22-TK+NS组、VP22-TK+NS组、NS+NS组、NS+GCV组、VP22-TK+GCV组、scFv-VP22-TK+GCV组分别为18.4 d±2.9 d、18.8 d±1.5 d,17.6 d±1.1 d,18.5 d±1.6 d,24 d±5 d和46 d±22 d, 6组比较,差异有显著意义(χ2=24.82,P=0.002);并且scFv-VP22-TK+GCV组较VP22-TK+GCV组裸鼠平均生存时间明显延长(χ2=7.43,P=0.006).结论抗MUC1 scFv靶向的慢病毒介导的VP22-TK/GCV系统对MUC1+人卵巢上皮癌具有高效靶向杀伤作用.
