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35例回族苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变分析
目的 探讨宁夏回族地区苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因突变特点,为该地区苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)的基因诊断和产前诊断提供依据.方法 应用PCR产物直接测序法,对宁夏地区35例回族PKU患儿和50名正常健康个体的PAH基因第1～13外显子及其旁侧内含子区域进行基因突变分析.结果 共检出20种突变类型,包括错义突变8种(40％)、无义突变5种(25％)、剪切位点突变4种(20％)、缺失突变3种(15％),等位基因突变检出率为68.57％(48/70).常见的基因突变类型是p.R243Q(12.86％)、p.R241C(11.43％)、EX6-96A＞G(5.71％)、p.Y356X(5.71％)、p.R413P(4.29％)和p.Q232X(4.29％)；较常见的突变类型为S16fsX10(2.86％)、p.R111X(2.86％)和p.L430P(2.86％).其中S16fsX10、p.L430P、p.D222G和IVS11+1G→A突变为国内首次报道,p.Y414X和S303fsX38突变为国内本名族中首次报道.50名正常对照中未检出上述突变.结论 宁夏回族地区PAH基因的突变特点有别于我国其他地区,表现出基因突变的多样性、复杂性和地域性,具有显著的民族特色.
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苯丙氨酸羟化酶基因突变的体外表达分析
目的 对苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因7种突变(R270G、P275A、F121L、A156P、E183G、I324N和R408Q)进行功能分析,通过检测其蛋白表达及酶活性的变化,探讨突变效应和致病性质,进一步明确基因型和表型之间的关系.方法 (1)应用体外定点诱变技术构建含有7种突变型PAH cDNA的表达载体,转化感受态大肠杆菌,提取质粒并测序验证.(2)将含有野生型和突变型PAH cDNA的真核表达载体pcDNA3.0瞬时转染COS-7细胞,转染48 h后提取总蛋白,应用免疫印迹法检测蛋白表达量并进行酶活性分析.以野生型PAH作为参照,计算突变型PAH的蛋白表达量、残余酶活性.结果 R270G、P275A、F121L、A156P、E183G、I324N和R408Q突变型PAH的蛋白表达量分别为野生型的10.5％,56.6％,54.3％,8.7％,8.5％,67.3％和85.4％.体外表达酶活性分别为野生型的7.7％,27.6％,19.0％,10.4％,9.1％,50.6％和40.2％.结论 7种突变型PAH的体外表达量及酶活性相对于野生型均有明显降低,证实这7种突变均为引起PAH酶活性降低的致病性突变.
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苯丙氨酸羟化酶突变基因型与生化表型分析
目的 探讨苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患者苯丙氨酸羟化酶基因(phenylalanine hydroxylase,PAH)突变基因型与生化代谢表型的相关性.方法 用聚合酶链式反应-单链构象多态性、变性高效液相色谱分析和DNA测序法对102例治疗前血清苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)高于120 μmol/L患儿基因组DNA进行PAH基因分析,观察突变基因型与生化代谢表型的相关性.结果 (1)生化代谢表型为经典型PKU(Phe>1200μmol/L)69例,中度PKU(Phe 600-1200 μmol/L)31例,轻度PKU(Phe400~600 μmol/L)2例.(2)共检出基因突变41种,基因型75种.(3)纯合突变基因型共9例(8.8%),含R111X/R111X基因型3例,IVS4-1G>A/IVS4-1G>A基因型1例,R243Q/R243Q基因型3例和V399V/V399V基因型2例.9例纯合突变中除1例RZ43Q/R243Q基因型患者的生化代谢表型属中度PKU外,其余8例生化代谢表型均属经典型苯丙酮尿症.(4)复合突变基因型共91 例(89.2%),生化代谢表型属经典型苯丙酮尿症的61例、中度PKU的29例和轻度PKU的1例.(5)复合突变基因型R111X/R243Q和EX6-96A>G(Y204C)/R243Q均可见于经典型苯丙酮尿症和中度PKU生化代谢表型;均属于无效突变等位基因的R111X/V399V基因型、EX6-96A>G/Y356X和EX6-96A>G/V399V生化代谢表型为中度PKU.含不同无效突变相同错义突变的R111X/A165D和R176X/A165D基因型分别表现为中度PKU和经典型苯丙酮尿症表型.结论 本研究中多数患者的突变基因型属复合突变.因突变等位基因的自由组合,使患者的基因型和生化表型之间关系复杂化.虽然大多数突变基因型与生化表型相关,但仍有个别与规律不一致的现象.因此,在PKU的遗传咨询中,依据患者的突变基因型分析评估预后要慎重.同样的基因型,患者表现出不同的生化代谢表型的现象,提示在苯丙氨酸的代谢过程中可能存在还没有被认识的其它影响因素.
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联合应用高分辨率熔解曲线和多重连接依赖探针扩增技术对PAH基因突变筛查研究
目的 联合应用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)和多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术检测苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患者基因突变,并探讨两种技术联合运用对于突变筛查的价值.方法 采用HRM和MLPA技术对26例临床诊断为PKU的患者苯丙氨酸羟化酶基因(phenylalanine hydroxylase,PAH)进行检测,并通过测序验证；针对未报道的基因改变进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析.结果 在52个等位基因中检测到44个突变等位基因(共21种不同突变),包括第4外显子拷贝数的增加,总检出率达84.62％(44/52),其中c.584_585insA和IVS10+ 1G＞T突变在国内外未见报道.此外,R243Q(25％)突变为中国常见的突变种类.结论 应用HRM和MLPA技术相对提高了PAH基因突变筛查的检出率,检测结果丰富了基因突变数据库,并为临床诊断与产前诊断提供实验室依据.
关键词： 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 基因突变 高分辨率熔解曲线 多重连接依赖探针扩增 -
山西省经典型苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变研究
目的 探讨山西省经典型苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因第3、6、7、11和12外显子的突变特征.方法 通过测序及序列比对的方法对山西省59例经典型PKU患者和100名正常儿童PAH基因进行序列分析,以确定其突变位点、性质和突变频率.结果 通过序列分析,发现在患儿和正常儿童中均出现Q232Q(CAA→CAG)、V245V(GTG→GTA)和L385L(CTG→CTC)3种单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP),其中患儿cDNA 696位点的SNP发生率高达96.2%,正常儿童的SNP发生率为97.0%;患儿cDNA 735位点的SNP发生率为76.1%,正常儿童的SNP发生率为77.3%;患儿cDNA1155位点的SNP发生率仅为7.6%,正常儿童SNP发生率为8.3%.正常儿童的其它序列与GenBank中序列比较的无差异.在患儿的基因序列中还发现了16种共计72个突变基因,占全部PAH突变基因的61.0%.第3外显子发现3种突变R111X、H64＞TfsX9和S70 del,突变频率分别为5.1%、0.8%、0.8%;第6外显子仅发现1种突变EX6-96A＞G,突变频率达10.2%;第7外显子中R243Q的突变频率高,占12.7%,其次是Ivs7+2T＞A,占5.1%,T278I占2.5%,G247V、R252Q、L255S、R261Q、E280K均占0.8%;第11外显子中,Y356 X占5.9%,V399V占5.1%;第12外显子中,R413P占5.9%,A434D占2.5%.在16种突变中,有9种错义突变、3种剪接位点突变、2种无义突变及2种缺失,其中,H64＞TfsX9为本次研究新发现.结论 明确了山西省经典型PKU患者PAH基因第3、6、7、11和12外显子的突变种类和分布等特征,EX6-96A＞G、R243Q可能属于山西人群中PAH基因突变的热点.
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河南地区苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变研究
目的 了解河南地区苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因突变情况,以便为苯丙酮尿症产前诊断和遗传咨询提供理论依据.方法 应用PCR产物直接测序对47例PKU患者及其父母PAH基因第1～13外显子及其两侧内含子进行序列分析.结果 在94条染色体中共检测到了83个PAH基因突变位点,检出率为88.3%(83/94),共发现了25种突变,其中突变E79fX13、H271R和D415Y国内外未见报道,突变VS10-14C＞G为国内首次报道.河南地区PKU患者的PAH基因突变集中在第6、7和11外显子,常见的7种突变是p.R243Q(20.5%)、EX6-96A＞G(12.0%)、p.Y356X(9.6%)、VS4-1G＞A(9.6%)、p.R111X(8.4%)、p.V399V(8.4%)、p.R413P(7.2%).结论 河南地区PKU患者PAH基因突变与中国其他地区相似,通过PAH基因直接测序可对大部分的PKU家系进行产前诊断.
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天津及周边地区苯丙氨酸羟化酶基因突变谱和新突变分析
目的 分析天津地区人苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase gene,PAH)基因突变谱,明确本地区该基因突变类型和特点,为遗传咨询和产前基因诊断提供科学依据.方法 用聚合酶链反应-单链构象多态、变性高效液相色谱法和DNA测序法对天津及河北等地99例已确诊各种类型苯丙酮尿症患儿基因组DNA进行PAH全基因13个外显子分析.结果 全基因共检出41种突变,含错义突变22种、无义突变7种、剪接位点突变9种和缺失突变3种.其中新突变6种(IVS3nt+1g→a、A165D、Q301X、G344D、P362L和R413G).198个PAH等位基因突变总检出率为93.94%.结论 天津及周边地区PAH基因突变谱广、遗传异质性高,一些常见突变的发生频率与以往报道的地域分布略不同.
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新疆地区苯丙氨酸羟化酶基因的突变研究
目的 了解新疆地区苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因的突变规律及特点.方法 应用聚合酶链反应一单链构象多态性分析及基因测序列方法 ,检测46例苯丙酮尿症患者PAH基因第3、5、6、7、11和12外显子及其两侧内含子序列.结果 在92个PAH等位基因中共检出20种不同的突变基因,总检出率为73.9%(68/92).其中常见基因突变R243Q、EX6-96A＞G、R111X、Y356X和V399V与我国北方地区基本类似.较常见基因突变F161S、L255S、P281L和R413P与国内其他地区相比差异较大.E280G和A434D为在国际上第2次检出;L255S、P281L、R261Q和165T为在国内第2次检出.新疆少数民族也发现了13种PAH基因突变,均系在本民族中首次报道,其突变基因的类型表现出鲜明的民族特色.结论 从对新疆地区PAH突变基因的研究结果 来看,该地的遗传基因不仅具有独立、保守的特性,而且还存在着相互交叉、相互融合的特征.
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苯丙氨酸羟化酶基因G247S、E280G、P362T和A434D突变的体外表达研究和结构分析
目的 探讨苯丙氨酸羟化酶基因4种新错义突变G247S、E280G、P362T和A434D的致病性质以及与临床表型之间的关系.方法 (1)应用体外真核表达体系进行突变体蛋白的瞬时表达;以野生型苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)的酶活性作为参照,计算突变体的残余酶活性.(2)比对不同种属的PAH酶蛋白序列,分析这些突变位点的氨基酸的保守性.(3)以正常PAH蛋白的晶体结构为基础,应用生物大分子结构模拟软件进行突变位点的三维结构分析,预测氨基酸的替换对酶功能的潜在影响.(4)根据治疗前血苯丙氨酸浓度和饮食苯丙氨酸的耐受量,进行苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿的临床表型分析.结果 (1)突变体G247S、E280G、P362T和A434D体外表达的残余酶活性分别为野生型的3.1%、0.4%、8.2%和21.7%.(2)Gly 247、Glu 280、Pro362均属于高度保守的氨基酸残基位点,而Ala434则属于比较保守的位点.(3)三维分子结构分析显示G247S和E280G位于酶的活性中心位置,可能分别影响PAH酶与四氢生物蝶呤和铁离子的结合;而突变P362T和A434D则可能分别影响PAH酶二聚体和四聚体化的形成和稳定性.(4)临床表型分析显示携带G247S和E280G突变的患者为经典型PKU,携带P362T的患者既有经典型PKU也有中间型PKU,携带A434D患者均为中间型PKU.结论 (1)E280G、G247S、P362T和A434D突变均为致病性的突变,位于酶活性中心位点的突变影响酶的活性功能更为明显.(2)突变酶分子的结构分析以及对酶功能影响的预测与体外表达的实验结果基本一致.(3)突变基因型、体外表达活性实验以及临床表型之间的关联分析存在着一定的关联性.
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中国北方地区苯丙氨酸羟化酶基因的突变构成
目的 了解中国人苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因的突变构成.方法 应用PCR单链构象多态结合序列分析检测230例苯丙酮尿症患儿PAH基因全部外显子及其两侧内含子.结果 (1)在460个PAH等位基因中检测出75种不同的突变基因,总检测率达94.6%(435/460),其中3种突变基因(S251-R252＞SfsX89、Y387D和A389G)尚未见到报道.常见的突变基因为:R243Q(21.7%)、EX6-96A＞G(10.2%)、R111X(8.3%)、R413P(6.5%)和Y356X(6.1%).较常见的突变基因为:V399V(4.1%)、IVS4-1G＞A(3.5%)、IVS7+2T＞A(2.2%)和R241C(2.2%).大部分突变集中在第3、5、6、7、11和12外显子及其两侧内含子区域.(2)检测出10种多态性位点,突变率高的4个位点IVS3-22C＞T(56.7%)、IVS10+97G＞A(75.9%)、Q232Q(89.0%)和V245V(81.9%),提示PAH基因cDNA序列存在人种差异.结论 中国人PAH基因的突变构成与欧洲人群完全不同,与亚洲其它人群有频率的差异.
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经典型苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶基因的新突变鉴定
目的研究经典型苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)基因突变.方法应用聚合酶链反应,单链构象多态分析和DNA直接测序等技术,对内蒙古地区32个PKU家系苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因第3～12外显子进行了鉴定分析. 结果检出14种PAH基因点突变:R243Q (12/64)、Y356X(6/64)、Y204C(5/64)、R261Q(2/64)、Y161S(2/64)、R252Q(1/64)、R111X(2/64)、D282G(1/64)、S303P(1/64)、G239D(1/64)、R413P(1/64)、IVS7nt+2(2/64)、IVS4nt+3(1/64)、IVS9nt+34(2/64),经检索国际PAH基因突变数据统计库(截至到2004年7月),确认IVS4nt+3(G>C)、IVS9nt+34(G>A)为国际首次发现的新突变,S303P(T>C) 、D282G(A>G)为国内首次报道的新突变.结论内蒙古人群苯丙氨酸羟化酶基因存在突变的多样性,R243Q、Y356X、Y204C是PAH基因的突变热点.
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苯丙氨酸羟化酶基因的六种新型突变
目的检测中国苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因新的突变位点.方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性及DNA直接测序检测40例经典型PKU患者和30名正常对照的PAH基因.结果在PAH基因上共发现11种突变和3种多态,30名正常对照者PAH基因未发现异常.结论经与国际PAH基因突变数据库比较,确认M276K、M276R、280insT 、IVS10nt+32T→A、IVS4nt+47C→T是国际上首次发现的突变,H290R 是中国PKU患者基因上首次发现的新型突变.
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云南苯丙氨酸羟化酶基因点突变及外显子5内新突变Y166X(C→G)的鉴定
目的 研究云南苯丙氨酸羟化酶基因点突变分布概况,以提高该地区苯丙酮尿症(PKU)的基因诊断率.方法 应用PCR-ASO探针斑点杂交,PCR-SSCP、ASPCR和DNA直接测序等技术,对13/14名云南籍PKU患儿的苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子4、5、6、7、10、11和12进行了鉴定分析.结果 共检出5种错义突变:R243Q(5/26)、Y204C(3/28)、R413P(2/28)、T418P(1/28)及G247V(1/26),3种无义突变Y166X(C→G)(2/26)、W326X(1/28)及Y356X(2/26)和1种静止突变V399V(2/26).经检索国际PAH基因突变数据库,其中Y166X(C→G)为首次发现的新突变.结论 云南藉PKU与中国北方人群有相类似的常见的PAH基因突变类型(R243Q、Y204C、Y356X、V399V和R413P),但与南方人群PAH基因突变特点则不同.该发现有助于提高云南PKU的基因诊断率,并对我国PAH基因突变不同地区及人群的分布、起源研究有参考价值.
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陕西地区苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变研究
目的 了解陕西地区苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因突变特征,为该地区苯丙酮尿症的基因诊断和产前诊断提供参考.方法 选择陕西地区55例苯丙氨酸浓度大于2.0 mg/dL的PKU患儿,应用聚合酶链反应结合测序技术对其PAH基因13个外显子及其侧翼序列进行分析.结果 55例患儿110个PAH等位基因中共检出98个突变等位基因,突变检出率为89.10％(98/110)；第7外显子为高频突变区域,包含9种突变,相对突变频率为33.67％00(33/98),其次为第12外显子(14.29％)和第3外显子(12.24％)；共检出PAH基因突变38种,p.R243Q为突变热点,占总突变的24.49％(24/98),3种突变p.A47E、p.I65S和p.A259T国内未见报道,p.C334X经PAHdb和HGMD数据库比对查新,为未报道过的PAH基因新突变.结论 初步得到了陕西地区的PAH基因突变图谱,发现1例新突变,为本地区PKU基因诊断、产前诊断积累有价值的资料.
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甘肃地区苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变分析
.2%),IVS4-1G>A(5.2%),较常见的突变有Y356X(3.4%),R111X(3.4%),INS7+2T>A(3.4%).结论 甘肃地区PAH基因突变与中国其他地区相似,但部分突变基因比例存在明显的差异.
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儿童运动及智能障碍者四氢生物蝶呤代谢病筛查及基因研究
目的 探讨四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)代谢中各酶缺乏在儿童运动及智能发育障碍者中发生率及基因突变.方法 对100例运动及智能障碍患者进行苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)及BH4负荷试验、尿蝶呤谱分析、红细胞二氢蝶啶还原酶测定,并对部分患者进行多巴治疗性诊断;对诊断为多巴反应性肌张力障碍(dopa-responsive dystonia,DRD)及6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase,PTS)缺乏者做基因突变检测.结果 100例中70例基础血Phe浓度正常,6例(6%)诊断为DRD;30例有高苯丙氨酸血症[Phe (1022±290) μmol/L],8例(8%)诊断为PTS缺乏症,22例(22%)诊断为苯丙氨酸羟化酶缺乏症.发现2例DRD患者其三磷酸鸟苷环化酶基因(GTP cyclohydrolase 1 gene, GCH1)突变为IVS5+3insT,8例PTS缺乏症患者存在PTS基因7种突变类型,其中259C→T,286G→A,155A→G常见,占75%.结论 一些肌张力障碍或智能障碍者是由于BH4代谢障碍所致,有必要做筛查诊断以明确诊断.
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天津地区苯丙氨酸羟化酶基因外显子7突变研究
目的探讨天津地区苯丙氨酸羟化酶基因外显子7突变特点。方法聚合酶链技术扩增41例PKU患者的苯丙氨酸羟化酶基因外显子7，用单链DNA构象多态性、直接DNA测序法分析扩增产物。结果共发现4种点突变：R243Q和G257V错义突变，R261X失义突变、V245V同义突变。4种突变的基因频率分别为14.6%、1.2%、1.2%和78%，其中R261X失义突变国内未见报道。结论天津地区苯丙氨酸羟化酶基因外显子7突变有其特点。
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北方汉族人群PAH基因STR多态性分析及PKU产前基因诊断研究
苯丙酮尿症(PKU)是由肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺陷引起的常染色体隐性遗传病.临床主要表现为智力低下.研究表明,PKU的分子基础主要是PAH基因的点突变.
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大连市苯丙酮尿症筛查诊治分析
苯丙酮尿症(Phenyektonuria PKU)是一种由于肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性缺乏所造成的常染色体隐性遗传病.
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宁夏汉族苯丙氨酸羟化酶基因突变分析
[目的]了解宁夏汉族苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因的突变构成及特点. [方法] 采用PCR产物直接测序的方法,测定12例汉族苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿PAH基因全部外显子及其启动子区域序列. [结果]在24个PAH等位基因中共检出18个突变基因,突变检出率为75％(18/24),这些突变包含11种类型,其中错义突变9种、无义突变1种、剪切位点突变1种. [结论]研究结果显示宁夏地区汉族PAH基因突变表现出多样性、复杂性,呈现明显的地域特色.
