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人类8型疱疹病毒小衣壳蛋白ORF65基因的原核表达及其生物信息学分析
目的:构建人类8型疱疹病毒(HHV-8)小衣壳蛋白(ORF65)基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白.方法:软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌(E.coli) DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21(DE3),并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析.结果:测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N 糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N 肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点.BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白.结论:成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员.
关键词： 人类疱疹病毒8型 小衣壳蛋白ORF65基因 原核表达 生物信息学分析 -
人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建
目的:构建人类8型疱疹病毒(HHV-8)K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台.方法: 根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增 K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a- K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性.结果: 酶切鉴定表明在约500 bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1 基因片断为494 bp.结论: 成功构建了pET41a- K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台.
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His-AMPKα1312截短缺失融合蛋白原核表达载体的构建与纯化
目的 构建His-AMPKα1312截短缺失融合蛋白原核表达载体,表达重组AMPKα1 312为深入研究各种病理生理条件对AMPK活化的影响奠定基础.方法 经RT-PCR获得AMPKα1截短基因片段,定向插入原核表达载体PET28a(+),构建重组表达质粒YH2/PET28a(+),转化DH5αE.coli,经IPTG诱导表达及镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后SDS-PAGE分析及Western blot检测.结果 经测序和PCR证实重组表达质粒YH2/PET28a(+)构建正确.表达的截短缺失蛋白相对分子量约为38 kD,Westernblot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性.结论 已成功构建并纯化了具有生物学活性的AMPKα1312截短缺失蛋白,为深入研究AMPK奠定了基础.
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抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达
目的重新设计并人工合成抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-scfv)的cDNA克隆,构建其表达载体,在原核系统中实现初步表达.方法根据genebank中发表的anti-NI-35抗体的轻链重链序列,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段,该基因双链分35个小片段合成,经退火、复性连接成目的片段后,克隆到克隆载体pUC-18中,经全自动序列分析仪测序证实后,再亚克隆至表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导表达.结果测序结果是合成的基因序列与设计的仅差一个碱基; SDS-PAGE检测显示,表达出相对分子量31kD的融合蛋白,并得到了良好的生物活性.结论抗NI-35重组单链抗体(IN-1-scFv)基因表达载体的构建和表达,为深入研究anti-NI-35-scFv应用于神经系统损伤和修复奠定了基础.
关键词： 抗NI-35重组单链抗体 基因合成 原核表达 -
Ⅰ型流感病毒核蛋白(NP)基因在大肠杆菌中的表达与鉴定
目的:以Ⅰ型流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA,并在大肠杆菌中进行表达与鉴定.方法:提取流感病毒RNA,以RT-PCR法扩增编码NP基因cDNA.将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET-28a的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP.用pET-NP转化受体菌BL21,在大肠杆菌BL21中表达,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品,用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物.结果:经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1 mM的IPTG诱导下,6 h其表达量达到高峰,经Western-blot分析证实表达的重组核蛋白具有免疫反应活性,大小约为60 kd.结论:流感病毒核蛋白基因编码区基因获得成功克隆和构建,为流感病毒诊断试剂及单抗的研制工作提供了基础材料.
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88Arg IL-2的克隆构建及原核表达
目的 构建88Arg IL-2的重组克隆,并在大肠杆菌中表达.方法 根据天然IL-2的基因序列设计含目的突变位点的引物,经PCR定点诱变技术获得88Arg IL-2的重组克隆,插入原核表达质粒pGEX4T-2中,经IPTG诱导在大肠杆菌DH5α中表达88Arg IL-2与GST的融合蛋白.结果 所表达的蛋白相对分子质量约为42 000.Western blot检测结果表明,该蛋白具有与亲本IL-2相同的抗原性.MTT比色结果表明,88Arg IL-2可促使IL-2依赖细胞株CTLL-2生长,具有与亲本IL-2相近的生物学活性.结论 成功构建了88Arg IL-2的重组克隆,在原核表达系统中高效表达出融合蛋白,并且具有生物学活性.
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人疱疹病毒7型U14编码区原核表达载体的构建
目的构建人疱疹病毒7型(HHV-7)开放读码框(ORF)U14的原核表达载体,并且进行原核表达.方法 PCR技术扩增HHV-7 ORF U14基因的主要抗原决定簇编码区(328～533氨基酸),目的基因与原核表达载体pThioHis A分别双酶切后连接,1×TSS法转化宿主菌E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达.结果基因序列分析表明目的基因序列与HHV-7标准毒株相应序列基本一致,SDS-PAGE电泳可观察到相对分子质量为3.57万融合蛋白的表达,Western印迹证实pp85蛋白成功表达.结论 HHV-7被膜蛋白pp85原核表达载体构建和表达成功,为进一步探讨该重组蛋白在HHV-7特异性抗体检测中的应用提供实验基础.
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重组mOP-1原核细胞高效表达和纯化的研究
①目的探讨重组mOP-1(rmOP-1)的克隆化、原核高效表达载体的构建以及rmOP-1制备和纯化简单有效方法.②方法于胎龄为2周的CD-1小鼠胚胎组织中提取、纯化mRNA,应用ligo(dT)引物反转录酶合成cDNA,PCR筛选扩增OP-1全长开放读框,产物TA克隆入质粒载体pCR 3.1-Uni;亚克隆入高效原核表达载体pTrcHis 2B,经大肠杆菌JM109、IPTG诱导表达rmOP-1蛋白;经Ni-NTA树脂纯化,SDS-PAGE分析.③结果限制性酶切分析、DNA测序确认mOP-1的全长开放读框,Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白PAGE分析满意. ④结论胚胎期约2周的CD-1小鼠有OP-1 mRNA的高水平表达,RT-PCR筛选OP-1全部开放读框,产物TA克隆化方法便捷,原核高效表达质粒pTrcHis 2B能够方便、快速回收和纯化重组蛋白.
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人微小病毒B19 VP1基因原核表达克隆的构建
①目的构建人微小病毒B19 VP1基因的原核高效表达系统.②方法通过PCR扩增B19病毒主要抗原决定簇 VP1区段基因,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2 上,IPTG诱导表达融合蛋白 ,产物经亲和层析初步纯化,以Western-Blot进行鉴定,并包被ELISA板,对临床血清进行检测.③结果 pGEX-4T-2-VP1可在大肠杆菌中高效表达,表达产物经纯化后可得单一目的蛋白条带.ELISA结果表明,其灵敏度、特异度等指标与德国Vir ion试剂盒有较好的符合率.④结论该重组蛋白具有良好的抗原性,为研制和开发具有我国独立知识产权的B19病毒基因工程抗原ELISA 诊断试剂盒提供了有价值的资料.
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人巨细胞病毒pp150基因的原核表达及抗原性分析
①目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp150的原核高效表达系统,制备用于急性、活动性HCMV感染血清学诊断的基因工程抗原.②方法PCR扩增HCMV pp150抗原决定簇(840～1 048 aa)编码基因片段,分别插入原核表达载体pMAL-p2、pET-28a,转化宿主菌E.coli.诱导表达,经麦芽糖亲和层析树脂纯化,以Western-Blot及间接ELISA法鉴定其抗原性.③结果重组表达质粒pMAL-p2-pp150可在E.co1i.DH5a中有效表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后,凝胶成像系统分析显示相对分子质量约为6.4万,约占菌体蛋白的10%.而重组质粒pET-28a-pp150未见明显表达带.Western-Blot检测,阳性识别率为80%(12/15).用此蛋白包被ELISA板,检测正常孕妇血清,阳性率为6.5%(17/263).与本室制备的全病毒抗原ELISA的诊断符合率为96%.④结论此重组蛋白具有良好的抗原性,进一步完善后可用于HCMV急性和活动性感染的诊断.
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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因的原核表达及鉴定
目的 原核表达水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(gE)基因,并对其进行鉴定.方法 构建大肠埃希菌重组载体pET28a-gE-his,利用IPTG诱导表达gE蛋白,经亲和层析纯化得到蛋白,用免疫印迹法验证目的蛋白的特异性.结果 pET28a-gE-his/BL21的IPTG诱导表达产物利用亲和层析纯化除去杂蛋白后,获得相对分子质量约为60×103的纯化蛋白,并且能与鼠抗gE糖蛋白单抗发生特异性结合,证明该蛋白为gE目的蛋白.结论 成功利用大肠埃希菌表达重组VZV糖蛋白E,并利用亲和层析柱进行有效的纯化,从而为VZV糖蛋白E的应用研究打下了基础.
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弓形虫P30基因的克隆及其在E.coli中的融合表达
[目的]研究弓形虫P30基因的克隆及其在E.coli中的融合表达.[方法]参照弓形虫P30序列设计引物,应用PCR技术扩增出弓形虫RH株P30的部分基因,将扩增产物克隆到pUCm-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET-30a中,得到重组质粒pET-30a-P30并将其转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Westen-blot分析.[结果]P30基因在E.coli中得到了高效表达,表达的融合蛋白的分子量在30kDa附近,可以被鼠抗Toxoplasma gondii阳性血清特异性识别.[结论]该研究为Toxoplasma gondii的检测和疫苗研制及综合防制奠定了基础.
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牛朊病毒正常蛋白特异性片段的克隆表达和纯化
[目的] 表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段.[方法] 用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达产物(包涵体)用8mol/L尿素溶解,在变性条件下用Cu2+氧化复性纯化.[结果] 重组表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,目的蛋白分子量约为15KD,Western blotting分析表明,目的蛋白具有朊病毒蛋白的抗原特性,变性条件下用Cu2+氧化复性纯化得到电泳纯的重组蛋白.[结论] 这一工作为下一步制备抗体和进行结构、功能的研究打下扎实基础.
关键词： 朊病毒 牛朊病毒蛋白特异性片段 原核表达 纯化 -
马铃薯Y病毒基因组连接蛋白的原核表达及纯化
设计合成马铃薯Y病毒基因组连接蛋白基因的特异引物，以本实验室获得的AQ4分离物cDNA为模板，通过PCR方法扩增得到目的基因，连入表达载体PEHISEGFPTEV及PEHISTEV，用IPTG诱导，使其在大肠杆菌中得到正确表达，并利用镍柱对VPg蛋白进行纯化，为抗血清的制备以及VPg蛋白晶体结构和互作蛋白的研究奠定基础。
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PRRSV SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立
通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（de-letingM）,克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 M蛋白基因 原核表达 间接ELISA -
西尼罗病毒NS1蛋白的原核表达及其免疫原性研究
[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析.[方法]将 WNV NS1 基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pE130a - WNV - NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行 SDS - PAGE 和 Western - blot 分析,经 Ni+ 亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作 ELISA 检测.将重组蛋白包板,检测 FOCUS 公司商品化试剂盒中的阳性血清.[结果](1) 重组 WNV NS1 蛋白获得表达并纯化成功.(2)Westem blot 结果显示表达的蛋白是带有His 标签的目的蛋白.(3)兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1:50000以上.(4)检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2.[结论]重组 NS1 蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究 NS1 蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础.
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肝脏型脂肪酸结合蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备和鉴定
目的：制备抗肝脏型脂肪酸结合蛋白(LFABP)的单克隆抗体(mAb)并进行亚型和特异性鉴定。方法：以重组的LFABP蛋白为免疫原，经过原核表达和纯化后，免疫BALB/c小鼠，获得分泌鼠抗人LFABP蛋白mAb的杂交瘤细胞株，通过ELISA和Western blot方法检测其特异性。结果：纯化的LFABP重组蛋白免疫小鼠后经过筛选得到2株稳定分泌抗人LFABP的mAb杂交瘤细胞株，分别命名为3E6和5B7，其亚型分别为IgG1和IgG2a，抗体经纯化后浓度达到2 mg/mL，效价达到1∶10000以上。Western blot分析结果表明可与细胞中表达的内源LFABP发生特异性免疫反应。结论：成功制备了鼠抗人LFABP的mAb，为进一步研究LFABP的生物学特性，并为相关疾病的治疗奠定了基础。
关键词： 肝脏型脂肪酸结合蛋白 原核表达 杂交瘤 单克隆抗体 -
苦瓜MAP30基因功能性片段的克隆和表达
背景与目的:MAP30是一种具有抗肿瘤、抗HIV和抗病毒等功能的蛋白.通过克隆和表达该蛋白的核心片段,用于进一步研究基因功能和结构域之间的关系.材料与方法:设计了两对特异性的引物,通过PCR技术从苦瓜总DNA中分别扩增出两段含有成熟MAP30蛋白基因的功能性片段T8-S194和T8N263,然后将目标基因克隆到原核表达载体pET-28a上,构建成带有C端6His-tag的融合表达载体,经测序鉴定后用CaCl2介导的化学转化法转化到E.coli RosettaTM(DE3)pLysS中.利用PCR筛选出阳性克隆,经IPTG诱导工程菌表达出重组蛋白.通过Western blot对重组蛋白进行分析. 结果:含T8-S194和T8-N286基因片段的两个表达载体构建成功,它们的表达重组蛋白能与兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性反应.结论:构建的两个含目的基因的表达载体均能在E.coli RosettaTM(DE3)pLysS中表达出预期的重组蛋白,为进一步研究这两个重组蛋白打下了基础.
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TNF家族的新成员TRAIL cDNA的克隆及其在E.coli中的表达
目的:克隆Trail基因cDNA全长,构建Trail的原核表达载体,从而建立其原核表达体系.方法:通过抽提外周血淋巴细胞总RNA进行RT-PCR克隆Trail cDNA,构建Trail的原核表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,以温度进行诱导表达,通过SDS-page分析表达产物.结果:(1)克隆了Trail基因cDNA全长,DNA测序结果与报道的完全一致;(2)构建了Trail基因原核表达载体;(3)将构建好的载体转化相应的宿主菌,诱导后得到了Trail蛋白表达产物.结论:Trail基因cDNA的克隆将对于其抗肿瘤作用研究有重要意义,同时此基因原核表达系统的建立为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.
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HeLa细胞中Zwint-1选择剪接亚型v7的表达鉴定
目的：验证在HeLa细胞系中是否存在Zwint-1 v7选择性剪切亚型的mRNA和蛋白产物。方法：在缺失片段两侧设计引物，利用PCR和克隆测序验证HeLa细胞中是否存在缺失片段的mRNA；构建Zwint-1 v73′端特异区段(Z7)的GST融合表达载体pGEX-KG-GST-Z7，转化入BL21菌种诱导表达，菌体经超声破碎和2 mol/L尿素洗涤纯化，融合蛋白经SDS-PAGE电泳并切胶回收后作为抗原与佐剂混合乳化并免疫C57BL/6小鼠，收获多克隆抗血清Anti-Z7，采用Dot blot检测多克隆抗体的效价，Western blot检测HeLa细胞全蛋白中的Z7蛋白产物。结果：PCR和测序结果表明存在缺失37 bp的核酸片段；SDS-PAGE电泳显示在30.7 kDa处出现明显的蛋白条带；Dot blot结果表明1∶5000稀释的多克隆抗体能检出12 ng GST-Z7；Western blot结果表明，1∶200稀释的多克隆抗体可识别HeLa细胞中Zwint-1 v7蛋白。结论：本研究在核酸水平和蛋白水平初步验证了HeLa细胞中存在Zwint-1v7。
关键词： Hela细胞 Zwint-1v7蛋白 原核表达 多克隆抗体制备
