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北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3,BcUGT6的表达分析及其原核表达
该研究测定了北柴胡中2个糖基转移酶基因BcUGT3和BcUGT6在不同组织中的转录水平及MeJA处理后不定根中的转录水平.BcUGT3在根、叶、花和果中的转录水平无明显差异,但均高于茎中的转录水平.BcUGT6在叶中转录水平高,在花中低.以未处理的为对照,BcUGT6在MeJA处理后2h,8h,24h,2d,4d的北柴胡不定根中,转录水平均提高近2倍,表明BcUGT6的转录受MeJA影响较小.BcUGT3转录水平随处理时间的延长不断增加,4d时,达7倍左右.利用载体pET-28a(+),进行了2个基因的原核表达.IPTG诱导后,宿主菌表达出了目的蛋白,并获得了纯化蛋白.为后续开展这2个基因的功能研究奠定了基础.
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白花丹参鲨烯合酶SQS2的克隆与原核表达分析
该研究根据丹参的转录组数据提供的基因片段设计引物,采用逆转录聚合酶链式反应方法,从白花丹参中克隆鲨烯合酶SQS2的全长cDNA序列,命名为SmSQS2,GenBank注册号KM244731.序列长度为1 597 bp,包含1 245 bp的开放阅读框,推测编码414个氨基酸,含有115 bp的5'UTR和237 bp的3'UTR.利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析,得出白花丹参SQS2的与紫花丹参SQS2的序列无明显差异.原核表达分析结果表明SmSQS2在大肠杆菌中能表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,对影响蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的吸光度(A600)进行了优化,得出SmSQS2蛋白表达的佳条件为:IPTG终浓度0.2 mmol· L-1,宿主菌的吸光度(A600)为0.6,温度30℃,诱导时间20 h.这为进一步研究白花丹参鲨烯合酶SQS2在丹参萜类和甾醇类生物合成途径中的作用提供了理论依据.
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灵芝DNA甲基转移酶(G1MET1)基因克隆及原核表达诱导分析
DNA甲基转移酶是DNA甲基化过程中关键的酶,对生物体内的基因表达调节起着重要作用.研究根据灵芝转录组数据,通过全基因合成首次克隆得到灵芝DNA甲基转移酶G1MET1,Genbank注册号为KU239998,并对其基因特性和空间结构进行全面的生物信息学分析.原核表达诱导分析表明pET28a(+)-G1MET1重组质粒在BL21(DE3)中能成功表达出目的蛋白,对其诱导条件进行优化,得出蛋白合适的表达条件为:诱导温度为16℃,重组菌生长2.5 h(A600为0.8),IPTG浓度为0.2 mmol·L-1,诱导时间为12 h.实时荧光定量PCR结果表明不同品种灵芝G1MET1的基因表达水平均有明显差异,且GlMET1在成熟期的表达水平均低于幼年期,说明GlMET1表达量随着灵芝的生长发育呈下降趋势.该研究结果为深入研究DNA甲基转移酶蛋白的作用机制奠定了基础.
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白木香AsJAZ1基因原核载体的构建与表达
克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis jasmonate-zim-domain protein(AsJAZ1)基因的编码区,构建原核表达载体及诱导重组蛋白的表达,为筛选互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础.该实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆到茉莉酸信号转导抑制蛋白基因JAZ(AsJAZ1)的编码区全长序列,克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组原核表达载体pET-28a-AsJAZ1,经酶切鉴定和测序验证后将其转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.5 mmol.L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4h后,可获得相对分子质量约为39 kDa的融合重组蛋白的高效表达.该重组蛋白在大肠杆菌的上清和沉淀中均有表达,但以包涵体表达为主.
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滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达
目的:克隆滇重楼鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因(PpSQS),对该基因进行序列分析及原核表达.方法:采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA,并对其进行生物信息学分析；构建原核表达载体pET-30b(+)-PpSQS,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达.结果:PpSQS基因cDNA全长1498 bp,包含1个1212 bp的开放阅读框(ORF),可编码403个氨基酸；PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa,等电点为pI6.83；SDS-PAGE分析表明,经1 mmol·L-1IPTG诱导后,重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达.结论:首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列,该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征,实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达.
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穿心莲中1个新NADPH-细胞色素P450还原酶的克隆及功能鉴定
穿心莲内酯为传统中药穿心莲中的主要有效成分,具有多种药理活性,广泛运用于临床,但其生物合成途径尚未被解析.细胞色素P450还原酶为CYP450提供电子,在CYP450的催化过程中起重要作用.该研究通过同源比对筛选并克隆了 穿心莲CPR的编码序列,命名为ApCPR4.原核表达ApCPR4蛋白,分离纯化后进行体外酶活鉴定,发现ApCPR4能够以NADPH依赖性方式还原细胞色素c和铁氰化物.为了验证其体内功能,将ApCPR4与CYP76AH1共转化入酵母工程菌,结果表明,ApCPR4在酵母体内能够协助CYP76AH1催化生成铁锈醇.实时定量PCR结果显示,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理的叶片中,ApCPR4的表达量逐渐增加.该表达模式与穿心莲内酯受MeJA诱导积累的趋势一致,推测ApCPR4与穿心莲内酯的生物合成相关.
关键词： 穿心莲内酯 生物合成途径 细胞色素P450还原酶 原核表达 功能鉴定 -
穿心莲转录因子ApNAC1的克隆、亚细胞定位及原核表达
从穿心莲叶片中克隆了1个NAC家族的转录因子,命名为ApNAC1,GenBank注册号为KY196416.生物信息学分析表明该基因的完整编码区包含972bp,编码1个323个氨基酸的多肽,预测蛋白相对分子质量为35.9kDa,等电点为6.14.原生质体瞬时表达研究证实了ApNAC1-GFP融合蛋白特异定位在穿心莲叶肉细胞的细胞核中,是一个核定位蛋白.实时定量PCR结果表明ApNAC1基因表达与穿心莲内酯的积累模式一致:主要在穿心莲的叶片里表达,而且茉莉酸甲酯处理能急剧上调其表达水平.ApNAC1基因在大肠杆菌中进行异源表达,并且被成功纯化.该研究为进一步探索ApNAC1蛋白参与穿心莲内酯生物合成的研究奠定了基础.
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丹参蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表达分析
蔗糖非酵解型蛋白激酶家族2 (SnRK2)在逆境植物信号转导途径中起着重要作用.该研究根据丹参转录组数据从丹参cDNA中克隆得到一个SnRK2家族基因,命名为SmSnRK2.4,属于I类SnRK2.SmSnRK2.4基因包含8个内含子,9个外显子,其开放阅读框1 068 bp,编码355个氨基酸,推测其蛋白相对分子质量为40.63 kDa,将其构建到原核表达载体pMAL-c2X上,原核诱导表达出与预测蛋白大小一致的目的蛋白.依据丹参基因组序列,PlantCARE分析SmSnRK2.4起始密码子ATG上游3 000 bp的启动子系列,结果显示该序列包含I-box,GA-motif,HSE,LTR,TC-rich repeats等逆境胁迫响应元件,以及GARE-motif,P-box,ABRE,CGTCA-motif等激素响应元件.实时荧光定量PCR分析表明SmSnRK2.4在丹参根中的含量较高,在茎中和叶中含量相当,ABA和PEG胁迫响应分析表明,SmSnRK2.4对PEG渗透胁迫响应显著,对ABA胁迫响应微弱.该研究为进一步探讨SmSnRK2.4基因在丹参干旱胁迫下次生代谢产物积累机制中的作用奠定了基础.
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杭菊黄酮醇合酶基因的原核表达与重组蛋白体外活性研究
从杭菊转录组数据库中筛选并通过RACE技术克隆出1条黄酮醇合酶基因(暂命名CmFLS),简单序列分析表明CmFLS基因全长1 235 bp,包含1个1 008 bp的开放阅读框(ORF),编码335个氨基酸.预测得到的CmFLS编码的蛋白相对分子质量为37.96 kDa,等电点(pI)为5.41,构建进化树发现CmFLS与菊科其他种植物同源性很高.利用原核表达技术成功诱导出大小43 kDa左右的重组融合蛋白,同时使用Ni-NTA树脂分离纯化出重组融合蛋白,并确定使用含250 mmol· L-咪唑的Ni-native buffer洗脱效果好.将纯化后的重组融合蛋白进行体外催化反应,然后将反应的产物萃取后进行HPLC分析,结果显示CmFLS重组融合蛋白在特定缓冲液及反应条件下能够将二氢槲皮素催化生成槲皮素,表明CmFLS编码的功能性蛋白在杭菊黄酮生物合成途径中具有双加氧酶活性.以上研究结果为进一步研究CmFLS的功能、阐明FLS酶的功能机制奠定了基础,同时为从分子水平调控杭菊黄酮醇成分代谢及体外催化合成黄酮醇提供新思路.
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小叶女贞糖基转移酶基因的克隆和原核表达研究
根据前期小叶女贞转录组研究的结果,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从叶片中克隆到1条编码糖基转移酶的基因(xynzUGT).该基因cDNA全长1598 bp,由66 bp 5'-UTR,1440 bp ORF,92 bp 3'-UTR组成,其中ORF编码1条含480个氨基酸残基的酶蛋白(xynzUGT),其相对分子质量和等电点分别为54826.67 Da和5.82.利用生物信息学方法分析酶蛋白的结构,结果表明在一级结构中含有一段糖基转移酶高度保守的PSPG盒,在二级结构中含有α螺旋(38％)、β折叠片(12.1％)和无规蜷曲(49.9％),在三级结构中由肽链折叠形成2个正对的α/β/α类Rossmann折叠区域,并且两者之间夹着一个底物结合口袋.通过系统进化树分析发现,xynzUGT有可能催化酪醇等苯丙素类物质发生糖基化,进一步开展酶蛋白与酪醇的分子对接模拟实验,结果显示位于结合口袋的Gly138和Ser285通过氢键与酪醇发生相互作用.SDS-PAGE电泳分析表明,原核表达系统成功表达出相对分子质量为58370.57 Da的xynzUGT重组蛋白,但它以非可溶性的包涵体形式存在.利用分子伴侣和酶蛋白共表达的方法,在一定程度上可促进酶蛋白的可溶性表达.以上研究结果为进一步开展体外酶促反应研究,并阐明酶的功能机制奠定了基础.
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建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究
泽泻鲨烯合酶(AoSS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶.为深入研究AoSS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体pCzn1上,并在大肠杆菌BL21 (Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻AoSS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中AoSS表达高,其次为叶,根中表达甚微.原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展AoSS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据.
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三七病程相关蛋白PR10-2基因的克隆、表达及功能初步分析
在转录组测序的基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从三七主根中分离到三七病程相关蛋白10 (pathogensis related protein 10,PR10)基因,命名为PnPR10-2,测序结果表明该序列长465 bp,编码154个氨基酸.氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,PnPR10-2与人参的PR10-2蛋白同源性高,具有典型的病程相关蛋白Bet v I 保守结构域.构建了重组载体pET32a(+)-PnPR10-2,在宿主菌Escherichia coli BL21中诱导表达融合蛋白,优化诱导条件,PnPR10-2融合蛋白在E.coli BL21中以可溶性和包涵体蛋白2种形式大量表达.纯化上清中的重组蛋白,运用纸片法分析纯化重组蛋白的体外抑菌活性,其对三七根腐病病菌腐皮镰刀菌Fusarium solani和坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans具有一定的抑制作用,猜测该基因可能参与了三七抗根腐病的防御反应.
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番鸭呼肠孤病毒YB株σB蛋白的基因序列分析及其原核表达
番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是造成雏番鸭高死亡率的重要病原体,深入其检测与免疫研究对于防控DRV感染意义重大.利用RT-PCR和测序技术,对3株福建DRV分离株的S3基因进行序列分析,发现DRV-YH、YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)遗传距离较近,同源性高达94.6％～98.9％,而DRV-YB株与ARV同源性仅为60.6％～61.7％.构建和鉴定DRV YB株重组原核表达质粒pET-30a-S3,并转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE表明,表达的目的蛋白分子量约为42ku,IPTG适诱导浓度为0.1mM,适诱导时间为5h,适诱导温度为37℃,以包涵体形式存在.薄层扫描显示重组DRV σB蛋白占菌体总量的67.7％.以Ni2+柱亲和层析纯化蛋白,纯化后的目的蛋白纯度为93％,质量浓度为0.86g/L.Western blot分析该融合蛋白能与抗DRV阳性血清发生特异性反应,表明重组DRV σB蛋白具有良好的免疫反应性.
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SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达
利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或/和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15%～30%之间.分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同一活性水平.由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的.
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人星状病毒Ⅰ型非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4的原核表达及鉴定
人星状病毒(Human Astrovirus,HastV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体.HastV非结构蛋白nsP1a及C末端蛋白nsP1a/4含有各种保守的功能结构域,在星状病毒的复制、转录,病毒与宿主的相互作用中起重要作用.为获得nsP1a及其nsP1a/4蛋白,为后续蛋白相关研究提供平台,本研究在E.coli系统中进行人星状病毒非结构蛋白nsP1a及nsP1a/4蛋白的表达并对表达产物进行鉴定.首先将nsP1a及nsP1a/4基因克隆入原核表达载体PGEX-4T-1,构建nsP1a及nsP1a/4蛋白融合表达质粒;在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,摸索两种融合蛋白表达的优条件并对表达蛋白进行免疫印迹鉴定.结果表明nsP1a蛋白在30℃,1mM IPTG诱导12h时,蛋白表达量达到高;nsP1a/4蛋白在20℃,0.5 mM IPTG诱导8h时,蛋白表达量达到高.Western blot结果显示两种融合蛋白既可与nsP1a蛋白免疫血清发生特异性反应,也可被GST标签抗体所识别.本研究成功利用原核系统表达并鉴定了人星状病毒非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4,为进一步研究星状病毒非结构蛋白的功能及病毒的致病机制奠定基础.
关键词： 人星状病毒 非结构蛋白nsP1a nsP1a/4 原核表达 融合蛋白 -
人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定
本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值.采用PCR技术扩增出HPV16 E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达.以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平.在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16 E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16 E7单克隆抗体发生特异性反应.二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1:200.结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性.
关键词： 人乳头状瘤病毒16型 E7蛋白 原核表达 蛋白质印迹 ELISA -
人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白N末端缺失突变体融合蛋白的表达及其免疫原性分析
本研究采用PCR方法从人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1) HXB2株tat基因中扩增编码Tat蛋白N末端1-21位氨基酸缺失的突变体Tat22-101基因片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat22-101,经双酶切及测序验证后,转化大肠埃希菌BL21( DE3),进行IPTG诱导表达及Ni2+ NTA柱亲和层析纯化.纯化后的突变体融合蛋白PET32a-Tat22-101经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,其相对分子质量约为26.9kD.该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测结果表明,pET32a-Tat22-101融合蛋白不仅较好地保留其免疫原性,而且能诱导产生高滴度的针对Tat N末端区之外的Tat其他功能区表位的抗体,为进一步研究Tat生物学功能和研制新型HIV Tat疫苗奠定试验基础.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 Tat蛋白 缺失突变 原核表达 免疫原性 -
侵染广西罗汉果的小西葫芦黄花叶病毒的鉴定及抗血清制备
在广西临桂罗汉果花叶畸形病株上获得了一个线状病毒分离物LGL-1,寄主范围、蚜传能力测定、病毒粒子形态和细胞病理特征研究表明,它是马铃薯Y病毒科成员.采用马铃薯Y病毒科特异性简并引物做PCR扩增,并测定了分离物LGL-1的基因组3′-末端序列,序列分析表明它是小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV).系统进化树分析揭示,世界范围内的ZYMV分离物主要可分为3大群体,分离物LGL-1为中国特有群体Group Ⅲ成员.原核表达制备了分离物LGL-1的外壳蛋白抗血清,明确了ZYMV是引起广西罗汉果病害的主要病毒,并且比较了原核表达法和提纯病毒法制备的抗血清,在病样的间接ELISA法检测中结果的差异.
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风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价
原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性.将RV衣壳蛋白C aa 3～29、aa 96～123以及包膜糖蛋白E1 aa208～247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别.分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgMELISA血清学检测中.
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一种新的PrP无细胞构象转化系统的建立
PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素.为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kD HaPrP蛋白,Westernblot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应.将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHS),与纯化的scrapie 263K毒株仓鼠感染脑组织prpsc蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Western blot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD.这表明HaPrpsen可以被转化为HaPrPres.实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究.
