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人载脂蛋白A-Ⅰ的原核表达及二级结构和功能鉴定
目的为获得高产量并具有正常结构和生物学活性的原核表达人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ).方法利用DNA重组技术对人apoA-Ⅰ的前8个氨基酸引入沉默突变,以pET-30b(+)为原核表达载体,在apoA-Ⅰ多肽链C-末端引入6×组氨酸标签,采用镍亲和层析对表达蛋白进行纯化.分别使用圆二色分析、浊度澄清试验和胆固醇外流试验对重组apoA-Ⅰ的α螺旋含量、脂质结合动力学及促细胞胆固醇外流能力进行评价.结果获得高表达产量的重组apoA-Ⅰ(12 mg纯化apoA-Ⅰ蛋白/L菌液);重组蛋白的α螺旋含量为(54±4)%,脂质结合动力学速率常数k1/2为0.059±0.002 min-1,胆固醇外流百分比为(16.68±1.77)%.结论可获得高产量并具有生物学活性的重组人apoA-Ⅰ;为构建apoA-Ⅰ其他突变体提供模式.
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硫酸化胆汁酸水解酶基因BSS H1克隆、表达及活性
目的 从铜绿假单胞菌克隆出硫酸化胆汁酸水解酶(BSS)基因,并表达蛋白产物、研究其活性.方法 通过序列比对确定铜绿假单胞菌中的目的序列BSS H1；通过PCR扩增获得BSS H1基冈全序列,将其插入pET30b(+)载体,并将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.通过优化诱导表达条件,实现重组蛋白BSS H1的高效表达；通过BSS-HSD酶联法初步研究其酶活性质.结果 工程菌扩大培养3h、以终浓度为1 mmol/L IPTG诱导5h时蛋白表达量高；研究发现BSS H1能催化底物生成3α和3β两种构型的羟基胆汁酸,在pH 8.5时,其活性分别是(632±65) U/L和(52±4) U/L.结论 成功构建BSS H1高效表达菌株.BSS H1能催化生成两种立体异构体的特性在其他BSS中未见报道,其机制尚不明确,值得深入研究.
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截短ALT1蛋白的获得及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达、纯化截短ALT1蛋白,制备ALT1多克隆抗体.方法 利用pCold TF载体原核表达系统,IPTG诱导,表达经生物信息学分析含有两个编码ALT1抗原表位的ALT1 N端1～115个氨基酸序列的基因片段,依次经镍(Ni)离子亲和柱纯化、HRV 3C蛋白酶酶切、二次镍离子亲和柱纯化和分子筛柱层析得到不带标签的截短ALT1纯蛋白,用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.结果 经测序证实,成功构建了截短pCold TFT-ALT1表达载体.获得纯度达90％的不带标签的截短ALT1重组蛋白,制备了效价达4.0×106的ALT1多克隆抗体,经Western blot鉴定,能特异性地识别ALT1抗原和肝细胞裂解液.结论 成功获得高质量的截短ALT1无标签蛋白及其特异的多克隆抗体,为ALT1的免疫学检测试剂的研发提供了依据.
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人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化
目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化.方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆.将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化.结果经过表达及纯化条件的摸索,终获得重组HuC蛋白.结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
关键词： RNA结合蛋白HuC cDNA克隆 原核表达 纯化 -
抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv的制备及生物学功能分析
目的 构建并应用原核表达体系表达能体外刺激人γδ T细胞增殖的抗人γδ TCR单链抗体.方法 在成功建立稳定分泌鼠抗人γδTCR单克隆抗体杂交瘤细胞系G5-4的基础上,通过RT-PCR,扩增得到该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因；通过搭桥PCR法,用连接肽(Gly4Ser)3,将VH和VL连接起来,构建了抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv基因.将该基因插入原核表达载体pET22b(+),并在大肠杆菌TransB( DE3)中经IPTG诱导表达.通过SDS-PAGE,Werstern blot进行鉴定,并通过流式、固相扩增、细胞因子检测、杀伤检测等方法分析单链抗体G5-4ScFv的生物学功能.结果 单链抗体G5-4ScFv的相对分子质量约30ku,能与γδ TCR特异结合；固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖,2周时其纯度可达90％；扩增得到的γδT细胞能有效杀伤肿瘤细胞系,如Daudi细胞,并在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α.结论 成功构建并表达了具有生物学活性的抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv,为进一步研究其用于制备肿瘤过继免疫治疗用细胞制剂奠定了基础.
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抗血小板GPⅢa单克隆抗体SZ-21单链抗体片断的表达和特性
将能与血小板膜糖蛋白IIIa特异结合的单克隆抗体SZ-21构建成单链抗体.应用RT-PCR技术,从分泌SZ-21单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,并构建成SZ-21单链抗体(SZ-21ScFv).将该单链抗体基因亚克隆到高效表达质粒pET20b, 得到pET20b-21ScFv.通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli BL21(DE3)PlysS中表达了功能分子.表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的21%.经过包涵体的溶解、Ni-NTA树脂亲和吸附纯化和蛋白质的体外重折叠等一系列的变性和复性过程,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段.ELISA 和Wester n blot证实该融合蛋白保留了与亲本抗体同样的血小板结合特性.SZ-21单链抗体体外能够抑制ADP诱导的血小板聚集,其抑制能力呈剂量依赖性,在浓度为20mg/L时达到大抑制率.流式细胞仪检测证实该单链抗体能与内皮细胞反应.该单链抗体有望用于血栓性疾病的治疗.
关键词： 血小板 膜糖蛋白IIIa 单链抗体(ScFv) 原核表达 -
人神经蛋白synuclein gamma的原核表达及纯化
synucleins是脊椎动物中高度保守的小分子量蛋白家族,主要在神经元表达,在突触前末梢尤为丰富.SNCG(synuclein gamma; spersyn; breast cancer-specific protein 1)是该家族的第三个成员,在脑中广泛表达,其表达异常与神经退行性病变和细胞恶变都有一定的相关性.它在神经元胞质中广泛分布,可能起到维持神经纤维网络完整性的作用[1].γ-synuclein蛋白的N末端与脑中参与多种信号通路的14-3-3蛋白家族成员有较高的同源性,具有分子伴侣的特性,参与 MAPK途径的调节.为了研究SNCG基因及其表达产物在神经系统中的作用,本研究采用RT-PCR的方法克隆得到SNCG基因的全编码区,在大肠杆菌中表达了全长蛋白,并用亲和层析得到纯化的蛋白.
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无融合标签人胱抑素C重组蛋白的制备
目的 构建人胱抑素C(CysC)基因的原核表达质粒pCold TF-CysC,表达并制备去标签蛋白的CysC.方法 用人CysC的全长编码基因插入原核表达载体pCold TF并测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导、镍柱纯化后获得带有His标签的重组蛋白TF-CysC.利用GST-HRV 3C蛋白酶去除该融合蛋白的TF标签,再经分子筛一步法同时去除TF标签、3C蛋白酶获得CysC,SDS-PAGE鉴定其纯度.用该CysC免疫新西兰大白兔,制备抗血清,并用间接ELISA及Western blot鉴定.结果 测序结果与Genbank中人CysC序列一致,实现了CysC可溶性高表达.纯化的无标签CysC纯度大于95％,分子质量约为13.3 ku,与预期相符.免疫家兔后,获得的抗血清效价达到1:4×106以上,能特异性识别市售CysC蛋白.该蛋白稳定性良好,在4℃保存一个月未见明显下降.结论 成功应用原核表达系统,获得了可用作免疫诊断试剂标准品的CysC,为进一步建立CysC的免疫检测方法奠定了基础.
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恶性疟原虫海南株翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因在M15中的表达
获得翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因后与表达载体pQE-30重组,然后转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导后表达TCTP融合蛋白,薄层扫描结果显示目的蛋白占菌体总蛋白的23.4%,目的蛋白中可溶性蛋白所占比例高于非溶性蛋白.Ni-NTA纯化后C端测序,结果C端13个氨基酸序列与由GenBank国际基因库中恶性疟原虫TCTP基因推导出的C端13个氨基酸序列及组成完全一致.结果表明成功地在M15中表达了恶性疟原虫海南株TCTP基因,为进一步研究提供了实验材料.
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家蝇抗菌肽defensin基因的克隆、原核表达纯化及抑菌、抑肿瘤活性鉴定
为研究家蝇防御素融合蛋白对肿瘤细胞K562有抑制作用,在GenBank中检索家蝇defensin基因,设计特异引物,在家蝇幼虫组织中提取RNA,并通过PCR扩增defensin基因成熟肽部分(Mature defensin,MD),将该基因与原核质粒表达载体pGEX-6P-1进行重组,构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1/MD.通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经25℃ IPTG诱导在大肠杆菌E.coli DH5ɑ中表达.用GST-Sefinose亲和层析纯化蛋白,15% SDS-PAGE分析鉴定,可见相对分子量为约30 kDa的特异性目的条带.运用琼脂孔穴平板扩散法测定表达产物的活性,得知纯化后的重组融合蛋白pGEX-6P-1/MD对大肠杆菌生长有一定的抑制作用,并首次证明家蝇防御素融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制作用.家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表达,证明纯化融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制和损伤作用,这为以后研发蝇防御素抗菌肽药物提供了依据.
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伊氏锥虫微管结合蛋白p15基因的分子克隆与表达
根据报道的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)微管结合蛋白p15(Tb-MAP p15)基因及其3'非翻译区保守序列设计引物,采用PCR法从伊氏锥虫云南水牛株(Trypanosoma evansi stock YNB)基因组DNA中克隆得到伊氏锥虫微管结合蛋白p15(Te-MAP p15)基因.克隆片段长273 bp,编码90个氨基酸,预测分子量9.0kDa.经同源性比较,所得基因与Tb-MAP p15基因同源率达到94%.抗原性分析Te-MAP p15基因表达的氨基酸序列比T.brucei微管结合蛋白p15多5个,均参与组成其中1个抗原决定簇,并且此抗原决定簇序列形成在蛋白中常作为识别位点的α螺旋.将该基因亚克隆到pGEX-6P-1原核表达载体,转化大肠杆菌E.coli RS21宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达.重组融合蛋白大小为35 kDa,与预期大小一致,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定为重组伊氏锥虫微管结合p15蛋白.
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鸡柔嫩艾美耳球虫江苏分离株5401基因的克隆、序列分析及原核表达
分别以孢子化卵囊及第2代裂殖子为材料,应用RT_PCR技术克隆了柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)江苏分离株5401基因.测序结果表明该序列全长为864 bp,序列本身是一个开放阅读框,将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较,第174位和第287位发生突变,碱基分别由T突变为C,由C突变为T.第1个为无义突变,第2个突变引起第96位氨基酸由A变为V.其核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%.将所获5401基因克隆到pGEX-4T-2获得重组质粒pGEX-4T-2-5401,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达.用大鼠抗柔嫩艾美耳球虫子孢子高免血清对原核表达产物进行Western Blotting检测,结果表明有2条融合蛋白,大小分别为90 kDa和80 kDa左右.
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鸡柔嫩艾美尔球虫第二代裂殖子表面抗原MZ5-7基因的克隆、表位分析及原核表达
用RT-PCR的方法,从感染柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)第5天的鸡盲肠分离的第二代裂殖子中克隆出MZ5-7基因,并进行抗原表位分析和原核表达,结果表明,MZ5-7基因ORF为945 bp,与GenBank里已知序列(登录号为L08257)比较核甘酸和氨基酸同源性均为99.9%.应用DNAStar软件对该基因的抗原表位进行了分析,发现其B细胞表位广泛分布在80～300区域,其中80～130区域、190～220区域和300～320区域更为突出,而T细胞基序则集中在123～190区域和220～300区域.根据MZ5-7基因序列重新设计一对引物,PCR方法扩增出不含信号肽长度为885 bp的基因序列,克隆到pET28b获得重组质粒pET28b-MZ亚,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达,表达的融合蛋白约36.5 kDa 10-pound note,符合目的蛋白大小;同时应用Western blot方法与抗第二代裂殖子和子孢子的2种高免血清反应,结果表明抗裂殖子和子孢子血清均能识别MZP(裂殖子蛋白,MZP,merozoite protein).
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弓形虫GRA7基因的克隆表达及免疫分析
本文构建了刚地弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)基因原核表达重组质粒,进行蛋白表达并分析重组蛋白的免疫反应性.设计合成引物,从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出GRA7基因片段并进行序列分析.目的片段用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后分别构建重组质粒pET32a-GRA7和pET28a-GRA7,而后转入大肠埃希菌BL21 (DE3)中诱导表达,Western blotting分析表达蛋白.结果显示,从弓形虫RH株中成功扩增出大小约710 bp的GRA7基因片段,构建的重组质粒经双酶切和PCR鉴定及测序,目的基因片段与预期相符.重组质粒pET32a-GRA7经IPTG诱导后,可高效表达重组蛋白,Western blotting分析显示重组GRA7蛋白能被弓形虫慢性感染血清识别,而重组质粒pET28a-GRA7未能诱导表达出目的蛋白.原核表达的重组GRA7抗原具有特异的免疫反应性,为弓形虫的诊断应用和疫苗研究奠定了基础.
关键词： 刚地弓形虫 致密颗粒蛋白7 (GRA7) 基因克隆 原核表达 免疫反应性 -
CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定
目的 构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶.方法 用PCR扩增CAD基因, 将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达载体.经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定.结果 构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达载体,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体.经分离纯化后得到纯度很好的CAD-ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带.经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用.结论 成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶,为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂.
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VEGFR-32-Ig反义多肽的原核表达及生物活性鉴定
目的将VEGFR-3 2-Ig的反义基因在体外进行原核表达,并将产物进行生物活性鉴定.方法构建VEGFR-3 2-Ig反义基因的原核表达载体,经过原核表达、亲和层析及蛋白酶切后获得将VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,用MTT 法进行活性鉴定.结果获得VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,MTT 法证明VEGFR-3 2-Ig的反义多肽具有较强生物学活性.结论成功获得VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,为研究和利用反义多肽提供了实验理论依据.
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麻疹病毒血凝素基因原核表达与抗原性鉴定
目的 利用大肠杆菌表达系统表达麻疹病毒血凝素(Hemagglutinin,H)基因,并将表达产物应用于麻疹病毒抗体的检测.方法 从麻疹病毒株MVi/Zhejiang.CHN/7.05/4中提取核糖核酸,用逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)扩增H基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+);用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组质粒在大肠杆菌BL21(DB3)中进行表达;利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白印迹法(Western Blotting)分析重组蛋白表达情况和抗原性:通过Ni-NTA亲和层析获得的高纯度目的 蛋白用于酶联免疫吸附试验.结果 RT-PCR获得的H基因外段约长1700bp,经测序确证无突变.转化的大肠杆菌表达产物在SDS-PAGE中出现与目的 蛋白分子量相一致的条带,且重组蛋白主要以包涵体形式存在;蛋白印迹(Western Blot)显示,表达产物具有良好的抗原性.结论 构建麻疹病毒H基因的原核表达体系,纯化的重组蛋白可用作麻疹病毒检测的抗原.
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流行性乙型脑炎病毒囊膜蛋白截片段的克隆及表达
目的 获得流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(JEV)SA14-14-2株囊膜蛋白抗原域Ⅲ基因并在大肠杆菌中表达,为进一步研发JEV血清学检测试剂盒提供抗原.方法 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增JEV SA14-14-2株囊膜蛋白抗原域Ⅲ测序,并定向克隆入原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pET-EⅢ,转化大肠埃氏菌(Escherichia coli,E. coli)BL21菌株,并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导在大肠杆菌中表达SA14-14-2株囊膜蛋白抗原域Ⅲ.结果 扩增的SA14-14-2株JEV囊膜蛋白截片段基因与发表的SA14-14-2株基因序列完全一致,构建了原核表达载体并在大肠杆菌中得到了表达,且表达产物具有免疫反应性.结论 在大肠杆菌中表达了囊膜蛋白抗原域Ⅲ基因,为进一步研发JEV血清学检测试剂盒提供了抗原.
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十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1的原核表达及其抗凝活性研究
目的 分离、克隆十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1基因,在大肠埃希菌中重组表达AduNAP1,并检测其抗凝活性. 方法 以十二指肠钩虫成虫cDNA为模板,PCR扩增AduNAP1成熟肽编码序列,并克隆、连接到表达质粒pET32a-sumo,构建原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP1.重组载体转入到大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.重组产物经Ni亲和层析后用SUMO蛋白酶酶切融合伴侣,纯化获得重组目的多肽.用 SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况,用凝血时间法(PT及aPTT)检测重组多肽的抗凝活性. 结果 扩增并克隆AduNAP1成熟肽编码序列,构建的原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP-1转化大肠埃希菌表达rAduNAP1.纯化的rAduNAP1能延长PT及aPTT,但延长PT作用更为显著,其延长2倍PT及aPTT时间所需的浓度分别约为142 nmol/L及406 nmol/L. 结论 构建rAduNAP1表达载体,其表达产物具有较强抗凝活性,为进一步了解AduNAP1的生物学功能及作为抗凝新药开发应用奠定了基础.
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蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因的克隆分析与原核表达
目的 克隆并表达蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12.方法 根据家蚕微孢子虫基因组数据库信息设计简并引物进行PCR扩增,克隆得到蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因.利用生物信息学软件对NpSWP12的基因与蛋白序列进行分析与结构功能预测.将该蛋白基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化表达载体至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE与Western blot检测.结果 蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因长687bp,编码228个氨基酸残基(基因登录号:KT287071),预测蛋白质分子质量单位为26.6ku,等电点(pI)为5.96.蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因结构为单外显子结构,编码的蛋白中α螺旋占77.19％.该编码蛋白含有1个BAR结构域(Bin/Aphiphysin/Rvs domain),属BAR结构域蛋白质超家族成员.NpSWP12与家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP12核苷酸序列序列相似性为95.2％,氨基酸序列相似性为96.9％.表达载体NpSWP12/pET-30a(+)转入BL21 (DE3)菌株,IPTG诱导,得到的重组蛋白rNpSWP12与理论蛋白分子质量大小(30ku)相符.Western blot鉴定.结论 成功克隆了蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因,构建的NpSWP12/pET-30a(+)重组原核表达载体表达预期分子质量的融合蛋白,该蛋白能被相应抗体识别,为进一步研究NpSWP12的细胞定位和功能奠定了基础.
