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HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测
此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白.首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒.再将该质粒转化到表达菌BL21,在IPTG诱导下表达P66蛋白.表达产物经几丁质柱一步纯化后得到P66蛋白纯品.纯化的P66蛋白分别催化B95-8细胞总RNA、RT试剂盒中对照RNA进行逆转录;同时以试剂盒中的M-MLV RT为对照进行相同的逆转录,PCR后电泳比较活性.结果显示我们构建的pTWIN-p66质粒在IPTG诱导下在原核细胞中P66亚单位蛋白表达量较高,经一步纯化后蛋白凝胶扫描纯度达88%,并具有较好的逆转录活性.与M-MLV RT体外活性比较,两者活性相当.该研究为进一步开发国产HIV确证诊断试剂及抗AIDS药物的研究打下了初步基础.
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北京地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达
为了解北京地区流行的人呼吸道合胞病毒(HRSV)N蛋白基因的特征,并用大肠杆菌表达获得N蛋白,从2006年1月至3月收集的首都儿科研究所附属儿童医院急性呼吸道感染患儿标本中分离到7株HRSV毒株(3株A亚型,4株B亚型),分别经RT-PCR扩增得到HRSV N蛋白全基因,克隆至pUCm-T载体中并进行测序和分析;从重组质粒pUCm-N9968中经PCR扩增获得N基因,亚克隆入原核表达载体pET30a(+)中,得到重组表达质粒pET30a-N9968,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导培养;SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和抗原性.经扩增并测序,7株HRSV N蛋白基因全长均为1 176 bp,编码一个含391个氨基酸的蛋白;北京地区7株RSV分离株的N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在85.4%～99.7%之间和95.4%～100%之间,进一步证明N蛋白基因的高度保守性.经诱导培养产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白,主要以包涵体形式存在.N蛋白粗提物经Ni2+亲和层析获得较理想纯化.Western blot结果显示,所表达的蛋白能与特异性单克隆抗体和人血清反应.说明本研究构建的重组pET30a-N9968原核表达质粒使N蛋白获得了高效表达,并且具有特异的抗原活性,为今后进一步研究奠定了基础.
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牛副流感病毒3型HN基因原核表达及间接ELISA方法建立
用构建的HJ-1株牛副流感病毒3型HN基因原核表达载体pQE30-HN,在E.coli XL1Blue中表达了重组HN蛋白,并用电洗脱方法从电泳凝胶中纯化了该重组蛋白作为包被抗原,建立了检测该病毒抗体的ELISA方法.建立的ELISA佳工作条件分别是:抗原浓度为6μg/mL,血清稀释度为1:50,封闭液为5％脱脂奶粉,封闭条件为37℃60min,酶标抗体工作浓度为1:10 000;阳性临界值为OD450≥0.30.该方法与病毒中和试验符合率高达96％,板内和板间重复性试验变异系数均小于10％,重复性较好.该方法与牛冠状病毒、传染性鼻气管炎病毒和呼吸道合包体病毒阳性血清无交叉反应.应用该方法检测黑龙江省部分地区323份奶牛血清样本,对牛副流感病毒3型抗体血清阳性率为57.89％.该ELISA方法的成功建立为进一步研发ELISA试剂盒提供了技术基础.
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传染性造血器官坏死病毒糖蛋白原核表达及免疫原性分析
为了建立传染性造血器官坏死病毒的免疫学检测方法,本研究以IHNV-Sn分离株基因组提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出其表面糖蛋白(glycoprotein,G)的基因序列(1527bp).将该基因克隆到pET27b(+)表达载体中构建出重组质粒pET27b-G,通过大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株获得高效表达.SDS-PAGE电泳分析显示表达蛋白约55 kD,大部分以包涵体的形式表达.利用尿素变性复性处理后获得高纯度的纯化蛋白,制备兔抗血清.间接ELISA结果显示,所制备的兔抗血清能够与重组糖蛋白和IHNV-Sn病毒株表面糖蛋白发生特异性反应,与重组蛋白的反应效价为1∶20 000;间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清可与IHNV-Sn分离株和IHNV参考毒株产生特异性的荧光,以上结果说明本研究所表达的IHNV糖蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,该研究为IHNV检测方法的建立及疫苗的研制提供了基础材料和理论依据.
关键词： 传染性造血器官坏死病病毒 病毒表面糖蛋白 原核表达 -
猪盖他病毒衣壳蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备
原核表达猪盖他病毒(Getah virus)衣壳蛋白(Cap)并制备多克隆抗体.设计一对特异性引物,从含有Cap基因的pT Cap质粒中扩增全长Cap基因,克隆至携带有His标签的原核表达载体pCold Ⅰ中,通过PCR、酶切鉴定和序列测定后,重组质粒pCold-Cap转化大肠杆菌Rosetta 2,IPTG诱导后SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白；蛋白经镍柱纯化后切胶免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体.实验表明:经终浓度0.1 mmol/L IPTG 15℃诱导24 h后,Cap基因在Rosetta 2中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的40.2％,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为32.3 kD.Western blot显示制备的鼠源抗血清可以与融合蛋白发生反应,有明显的特异性条带.猪盖他病毒衣壳蛋白原核表达成功,制备的多抗可以识别Cap蛋白.
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黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究
增效蛋白(ENHANCIN)是一种主要在昆虫杆状病毒中存在的杀虫增效因子,黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulovirus,AgseGV)基因组中有一个ORF的编码产物为杆状病毒ENHANCIN同源物,命名为enhancin-like.生物信息学分析结果表明,AgseGV的enhancin-like基因编码产物含有ENH ANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a螺旋跨膜区,在其C-末端拥有类似哺乳动物的脯氨酸富集区.为了确定AgseGV的ENHANCIN-like蛋白是否具有增效功能,构建了AgseGV的enhancin-like全基因和5′端片段(1017bp)的原核表达载体.利用层析技术纯化截短片段的原核表达产物,以其为抗原制备了抗体.利用自制抗体和His-tag抗体,Western blot检测了enhancin like全基因的表达产物.结果表明,在融合蛋白预期大小处显示出阳性条带,证明目的基因得到了良好的表达.以棉铃虫为供试虫进行生物测定,证明在棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)浓度为1.17×102 PIBS/mL时,AgseGV enhancin-like的全基因原核表达产物能使其感染3龄初幼虫的死亡率提高16.25％,增效作用显著.但是,5′端截短片段的原核表达产物对HaNPV没有增效作用.
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HCoV-NL63N蛋白不同片段的表达纯化及血清学检测应用分析
将HCoV-NL63核衣壳蛋白N端(Np 1～154aa)、C端(Cp 141～306aa)基因片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上进行原核表达,制备相应的纯化蛋白Np、Cp蛋白,利用Np、Cp蛋白建立基于Western-Blot条带印迹的HCoV-NL63抗体检测法,并与基于全长N蛋白(Nf)的HCoV-NL63抗体检测法相平行筛查了50份成年体检血清.结果显示:50份成年体检血清中,采用Nf、Np、Cp分别检出25、27、36份HCoV-NL63抗体阳性血清,检出率分别为50%、54%、72%.不同N蛋白与血清反应抗体阳性谱存在差异,其中Np与Nf检出一致率为64%,Cp与Nf检出一致率为54%,而Np与Cp检出一致率为54%.本研究表明人冠状病毒NL63在我国人群中感染常见,N蛋白C端(Cp)检出率比全长N(Nf)及N端(Np)要高,Nf、Np、Cp在抗体检测上存在不一致性.这为HCoV-NL63血清学试剂研发及免疫学研究提供了依据与实验基础.
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大肠杆菌重组颗粒性戊型肝炎疫苗对恒河猴的免疫保护
大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白ORF2片段HEV 239重组蛋白颗粒,经铝佐剂吸附后,分别以5μg、10μg和20μg剂量免疫恒河猴,28天时以相同剂量加强免疫1次,3周后分别以不同病毒滴度的基因Ⅰ型或基因Ⅳ型HEV静脉攻击.结果,加强后3周,3个免疫剂量组猴的抗体几何平均滴度分别为1∶27175、1∶34409、1∶41607,以世界卫生组织参比血清定量,则分别为1098IU/ml,1357IU/ml、1724IU/ml.每个剂量免疫组及对照组各有3只猴接受107病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染,对照组3只猴均被成功感染,2只出现肝炎;20μg免疫组3只猴均未被感染;10μg和5μg免疫组各有2只猴未被感染,另1只猴出现短暂感染,免疫猴均未出现肝炎.3个剂量免疫组及对照组另外3只猴,接受104病毒滴度基因Ⅰ型HEV感染,对照组3只猴均被感染,1只出现肝炎;而免疫猴均未被感染,也未出现肝炎.3只10μg免疫猴和3只对照猴分别接受107病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染,对照组均被感染并出现肝炎,而免疫组均未出现肝炎,有2只未被感染,另1只被短暂感染.另有3只10μg免疫猴和3只对照猴分别接受104病毒滴度基因Ⅳ型HEV感染,对照组均被感染,而免疫组均未被感染.这些结果表明:HEV239疫苗可以完全预防HEV导致的肝炎,并保护大多数恒河猴不被HEV感染.另外,疫苗对基因Ⅳ型HEV的保护性与基因Ⅰ型HEV相近.
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庚型肝炎病毒基因在大肠杆菌中表达的初步研究
利用原核表达载体pRSET或(和)pGEX在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒(HGV)C-NS3和NS5区的多段基因.CE1、E2、NS3、NS5及NS3-NS5嵌合基因等的8段基因均有高效表达,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在10%～35%之间.对以上重组蛋白进行免疫学筛选,证实其中7个重组蛋白均具免疫学活性,在一定程度上确定了重组HGV抗原表位的分布,为HGV的血清学和免疫学诊断试剂的研究奠定了坚实基础.
关键词： 庚型肝炎病毒(HGV)基因 原核表达 重组抗原 免疫学活性 -
北京地区两株人偏肺病毒M蛋白基因的原核表达及抗原活性分析
人偏肺病毒(Human metapneumovirus, hMPV)是近发现的可引起人类呼吸道感染的一种副粘病毒,现被归类于偏肺病毒属(Metapneumovirus),是至今发现的第一个与人类疾病相关的偏肺病毒属成员[1].目前已经受到世界范围的重视,已有十多个国家报道了不同年龄组人群中hMPV的感染情况.
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人巨细胞病毒pp150抗原区的原核表达及初步应用
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染人体可引起广泛的临床症状,尤其是孕妇和免疫缺陷病人感染HCMV可产生严重的危害[1].传统的减毒活疫苗使用后可能会造成宿主机会性感染或导致肿瘤,因而限制了它的应用.与亚单位疫苗相比,DNA疫苗具有易于构建和制备、稳定性高等特点.多种HCMV病毒蛋白可刺激机体产生相应的抗体,但应选用免疫原性强、特异性好的蛋白抗原基因制备HCMVDNA疫苗.国内外的研究证实[2-5],HCMV的pp150蛋白具有较强的免疫原性.我们用RT-PCR方法扩增了pp150 420～752氨基酸之间多肽片段的编码基因,克隆至原核表达载体,构建了表达pp150抗原决定簇区的工程菌.
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猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征[1].
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麦二叉蚜体内病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达
从麦二叉蚜体内克隆了一个DNA片段,经序列测定表明该片段全长为1647bp,编码548个氨基酸.与禾谷缢管蚜的病毒结合蛋白基因核苷酸同源性为92%,氨基酸的同源性为96%,从而认为这是病毒结合蛋白基因(GenBank登录号为AF434719).构建了该基因的原核表达载体pBVSG和pETSG,用pBVSG表达出63kD的非融合目的蛋白,用pETSG表达出69kD的融合蛋白,二者均有较高的表达量.以纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了此病毒结合蛋白的抗血清,用琼脂双扩散法测定效价为1∶512.
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中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2的密码子优化表达及其免疫原性研究
利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV) VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性.通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(GenBank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jeat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒pET-28a-optiVP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将表达蛋白纯化并免疫至自来杭母鸡,对免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行检测,研究CSBV VP2蛋白的免疫原性.同时,收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化再与CSBV相互作用后,接种于3日龄蜜蜂幼虫,观察接种后幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力.结果显示,优化后的optiVP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有良好免疫原性,表达产物接种白来杭母鸡可诱导产生抗体,制备的卵黄抗体具有中和CSBV的作用.本实验实现了CSBV结构基因VP2在原核系统的高效表达,鸡免疫实验表明其具有良好免疫原性,并且可诱导鸡产生保护作用中和抗体,为进一步开发防治CSBV的生物制剂提供了帮助.
关键词： 中蜂囊状幼虫病毒(CSBV) VP2基因 系统进化 密码子优化 原核表达 -
人CPNE5多克隆抗体的制备
制备人CPNE5的多克隆抗体.将CPNE5基因中423bp(626-1048bp)的片段构建到原核表达载体pGEX-5X-1,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达蛋白,经SDS-PAGE分离纯化得到抗原肽段,质谱法鉴定后常规免疫家兔.用CL-4B柱纯化抗体.结果显示,成功表达并纯化了人CPNE5抗原肽段；ELISA显示抗血清具有高亲合性,Western blot检测表明抗体能特异性识别CPNE5.本文制备的抗体经检验证实为高亲合性和特异性的兔抗人CPNE5多克隆抗体.
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链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化
目的 构建链霉亲和素(streptavidin,SA)和自噬相关基因(Beclin 1)重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白(含His标签)在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.
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猫α-synuclein蛋白的表达纯化及生物学特征分析
目的：对猫突触核蛋白（α?synuclein ）进行克隆、表达及纯化，并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α?synuclein基因的保守区域内设计引物，从猫脑cDNA文库中PCR扩增得到猫的α?synuclein基因，再将此基因双酶切后克隆到pET28a原核表达载体中，构建重组质粒，测序正确的重组质粒转化BL21（ DE3）大肠杆菌，采用IPTG诱导表达。然后对猫α?synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑cDNA文库中扩增出α?synuclein基因，基因全长381个碱基，编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入pET28a，后转染大肠杆菌BL21（ DE3），获得可溶性表达的α?synuclein蛋白质，蛋白质分子量为13?12kD，与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α?synuclein蛋白与人源及鼠源α?synuclein氨基酸具有很高的同源性，分别为87?35％和83?15％，但是与鼠和人的氨基酸序列比较，猫α?synuclein氨基酸缺失41～54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α?synuclein具有很好的疏水性，有助于诱导表达时形成可溶性蛋白，这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α?synuclein基因，并在大肠杆菌中实施了可溶性表达，为后期研究α?synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。
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结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性
目的 通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白.方法 用PCR从结核分枝杆菌1137Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达.用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性.利用PCR技术鉴定fopA基因在不同分枝杆菌的分布.结果 32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化.表达Ag85A蛋白的fopA基因在结核分枝杆菌1137Rv、1-137Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达.结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度高.结论 重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性.
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人rBPI23在大肠杆菌DH5α中的表达及其多克隆抗体的制备
目的 制备人rBPI23蛋白并免疫家兔获得特异性多克隆抗体.方法 将本室制备的pBV220-synBPI600表达载体转化感受态E.coli DH5α,温控诱导后,获得以包涵体形式表达的目的 重组蛋白;用SDS-PAGE鉴定分子质量,West-ern blot鉴定抗原性;免疫家兔获得抗rBPI23抗血清,经饱和硫酸铵沉淀获得多克隆抗体,间接法ELISA检测抗体效价,Western blot分析抗体的特异性.结果 重组蛋白主要以包涵体形式表达,SDS-PAGE显示其分子质量约23 ku,与预期结果相符;重组蛋白能与市售兔抗人BPI抗体特异性结合;免疫家兔获得高效价(1∶320000)抗血清,上述抗体能与rBPI23及人BPI标准品特异性结合.结论 成功制备了人rBPI23,免疫家兔获得高效价抗人rBPI23多克隆抗体,为制备单克隆抗体及后期建立BPI免疫学检测方法奠定基础.
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颗粒溶素的克隆表达及活性分析
目的 克隆人颗粒溶素基因并进行原核表达.方法 体外分离并培养外周血单个核细胞,抽提总RNA,RT-PCR扩增人颗粒溶素的基因片段,并将其插入pMD18-T进行测序,鉴定正确后分别将目的基因亚克隆至pET32a(+),构建原核表达质粒pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blot鉴定融合蛋白的正确性.MTT检测颗粒溶素融合蛋白的生物活性.结果 成功构建了原核表达载体pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,经诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量约31和37 ku的融合蛋白,重组颗粒溶素融合蛋白能特异地与抗颗粒溶素抗体结合,GNLY9K融合蛋白可以明显抑制A549细胞增殖,而GNLY15K融合蛋白对细胞增殖影响极低.结论 利用原核表达体系成功地表达了不同分子质量的颗粒溶素融合蛋白,为颗粒溶素的后续研究奠定了基础.
